CN110196293A - 一种大叶钩藤提取物总生物碱的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大叶钩藤提取物总生物碱的含量测定方法，所述方法即以异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B、柯诺辛为对照，以甲醇‑0.02％三乙胺＝55～75:25～45为流动相的高效液相色谱法。本发明选择大叶钩藤提取物中总生物碱为指标进行含量测定，该测定方法精密度高、重现性好、稳定性好，测定结果准确度高，可有效控制大叶钩藤提取物的质量，从而确保其临床用药的安全、有效。

Description

一种大叶钩藤提取物总生物碱的含量测定方法

技术领域

本发明涉及中药提取物质量检测领域，更具体的说是涉及大叶钩藤提取物总生物碱的含量测定方法。

背景技术

大叶钩藤(Uncaria macrophylla Wall.)为茜草科钩藤属植物，药用部位为带钩茎枝，具有息风定惊、清热平肝的功效。常用于肝风内动，惊痫抽搐，高热惊厥，感冒夹惊，小儿惊啼，妊娠子痫，头痛眩晕。在国内知名大品种中成药天麻钩藤颗粒、正天丸、小儿七星茶中，大叶钩藤均作为主药使用。

根据文献报道，生物碱类成分是钩藤的主要药效成分。目前，关于钩藤总生物碱的含量测定方法主要有滴定法、直接紫外分光光度法和酸性染料比色法，但这几种方法测定所得结果的准确性还存在较大的争议。

因此，如何提供一种测定结果可信度高，能得到大家广泛认同的钩藤总生物碱含量测定方法，对于钩藤提取物的质量控制具有重大意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种大叶钩藤提取物中总生物碱的含量测定方法。本发明通过对大叶钩藤提取物中总生物碱的含量进行定量研究，完善了大叶钩藤提取物的质量检测标准。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种大叶钩藤提取物中总生物碱的含量测定方法，即以钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛、柯诺辛B为对照，以甲醇-0.02％三乙胺＝55～75:25～45为流动相的高效液相色谱法。

具体的含量测定方法为：高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝55～75:25～45为流动相；流速为0.5～2ml·min-1；柱温为25～40℃；检测波长为240～250nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛B、柯诺辛对照品适量，用甲醇制成分别含钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛B、柯诺辛0.06～0.60mg·ml-1溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤提取物适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

优选的，含量测定方法为：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝68:32为流动相；流速为1ml·min-1；柱温为25℃；检测波长为246nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称定异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL分别含0.29,0.148,0.13,0.296mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤提取物适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明有益效果如下：

本发明选择大叶钩藤提取物中总生物碱为指标进行含量测定，该测定方法精密度高、重现性好、稳定性好，测定结果准确度高，可有效控制大叶钩藤提取物的质量，从而确保其临床用药的安全、有效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例4中混合对照品的高效液相色谱图。

图2为实施例4中大叶钩藤提取物的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

以下是本发明人对大叶钩藤提取物中钩藤总生物碱的含量测定方法进行试验研究的过程：

1、仪器与试药

Waters alliance E2695型高效液相色谱仪(美国waters公司)，Inertsil ODS-3C18色谱柱(4.6x250mm，5μm)，BS110S型1/10万电子分析天平(梅特勒公司),9200S超声波清洗器(上海)。

钩藤碱对照品(纯度≥98％，批号：20160518)、异钩藤碱(纯度≥98％，批号：20160228)、柯诺辛B(纯度≥98％，批号：20151123)均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司,柯诺辛(纯度≥98％，批号：BCY-0155)购自江西佰草源生物科技有限公司，钩藤提取物(自制)，甲醇为色谱纯(美国Fisher公司),水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2、色谱条件的选择

发明人在进行色谱条件的选择时，尤其对检测波长及流动相系统进行了选择。确定色谱条件为：Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4.6x250mm，5μm)色谱柱；甲醇-0.02％三乙胺(68:32)为流动相；流速为1ml·min-1；柱温为25℃；检测波长为246nm。

(1)检测波长的选择

对异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛进行全波长扫描，结果显示其在246nm有最大吸收，故选择246nm为检测波长。

(2)流动相的选择

考察了不同比例乙腈-水，甲醇-0.02％三乙胺，甲醇-水为流动相对分离效果的影响。结果表明，甲醇-0.02％三乙胺(68：32)较合适，可使样品中目标峰与杂质峰达到分离，峰型较好，故选为流动相。

3、线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液1,3,5,10,15,20uL注入色谱仪,按上述色谱条件进行测定,以峰面积值(Y)为纵坐标,各待测物进样量(X)为横坐标,分别绘制标准曲线。结果(表1)表明各成分在各自的线性范围内具有良好的线性关系。

表1钩藤对照品4种生物碱的线性关系考察结果

4、精密度试验

取同一份供试品溶液，连续进样6次。测定各待测成分峰面积，结果供试品溶液中异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛峰面积的RSD分别为0.75％，0.68％，0.86％，0.74％。

5、重复性实验试验

精密称取同大叶钩藤提取物样品共6份，按本发明所述含量测定方法中的供试品的制备方法制备，结果异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛峰面积的RSD分别为1.46％，1.92％，1.48％，2.23％。

6、稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于制备后0,1,2,6,10,18h进行测定。结果显示异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛峰面积的RSD分别为2.21％，1.02％，2.05％，2.82％，表明供试品溶液在18h内稳定。

7、加样回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的样品，精密称定，分别精密加入一定量的异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B、柯诺辛，按照本发明技术方案中所述的供试品的制备方法来制备供试液，按照上述测定方法进行测定，计算回收率，结果见表2。

表2钩藤提取物4种生物碱的加样回收率(n＝6)

8、样品测定

按本发明技术方案中所述的方法制备供试品和对照品溶液，分别进样，记录色谱图，计算大叶钩藤提取物中4种生物碱和总生物碱的含量，结果见表3。

表3钩藤提取物4种生物碱及总生物碱含量测定结果

注：表中总生物碱含量＝4种生物碱总含量÷(四种生物碱的峰面积总和/所有峰的峰面积总和)

通过实施1的试验，本发明得到了权利要求书保护的技术方案，同时也证明了该测定方法精密度高、重现性好、稳定性好，测定结果准确度高，可有效控制大叶钩藤提取物的质量，从而确保其临床用药的安全、有效。

实施例2：

一种大叶钩藤提取物中总生物碱的含量测定方法，具体方法为：高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝72:28为流动相；流速为1ml·min-1；柱温为25℃；检测波长为246nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称定异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL分别含0.29,0.148,0.13,0.296mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤总碱样品适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

实施例3：

一种大叶钩藤提取物中总生物碱的含量测定方法，具体方法为：高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝70:30为流动相；流速为1ml·min-1；柱温为30℃；检测波长为246nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称定异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL分别含0.29,0.148,0.13,0.296mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤总碱样品适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

实施例4：

一种大叶钩藤提取物中总生物碱的含量测定方法，具体方法为：高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝68:32为流动相；流速为1ml·min-1；柱温为25℃；检测波长为246nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称定异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL分别含0.29,0.148,0.13,0.296mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤总碱样品适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

实施例5：

一种大叶钩藤提取物中总生物碱的含量测定方法，具体方法为：高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝60:40为流动相；流速为1ml·min-1；柱温为30℃；检测波长为246nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称定异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL分别含0.29,0.148,0.13,0.296mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤总碱样品适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

实施例6：

一种大叶钩藤提取物中总生物碱的含量测定方法，具体方法为：高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝55:45为流动相；流速为1ml·min-1；柱温为30℃；检测波长为246nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称定异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL分别含0.29,0.148,0.13,0.296mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤总碱样品适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种大叶钩藤提取物总生物碱的含量测定方法，其特征在于，含量测定方法是以异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B、柯诺辛为对照，以甲醇-0.02％三乙胺＝55～75:25～45为流动相的高效液相色谱法。

2.根据权利要求1所述的一种大叶钩藤提取物总生物碱的含量测定方法，其特征在于，具体方法为：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝55～75:25～45为流动相；流速为0.5～2ml·min^-1；柱温为25～40℃；

检测波长为240～250nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称取钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛B、柯诺辛对照品适量，用甲醇制成分别含钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛B、柯诺辛0.06～0.60mg·ml^-1溶液；

供试品溶液的制备：取钩藤提取物适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

3.根据权利要求1所述的一种大叶钩藤提取物总生物碱的含量测定方法，其特征在于，具体方法为：

色谱条件与系统适用性实验：以C18键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.02％三乙胺＝68:32为流动相；流速为1ml·min^-1；柱温为25℃；检测波长为246nm；理论板数应不低于3000；

对照品溶液的制备：精密称定异钩藤碱、钩藤碱、柯诺辛B和柯诺辛对照品适量，置于容量瓶内，加甲醇溶解并定容至刻度，制成每1mL分别含0.29,0.148,0.13,0.296mg的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：取钩藤提取物适量,置于25mL容量瓶内，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得；

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。