CN116879424A - 生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其克服了现有技术中存在的血宝制剂中特女贞苷含量检测效率较低的问题。本发明包括以下步骤：1)对照品制备：称取特女贞苷对照品适量，加稀乙醇制成溶液，即得；2)供试品溶液的制备：精密量取生血宝制剂，加入稀乙醇稀释定容至，摇匀，滤过，取续滤液，即得；3)测定：分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。根据峰面积使用外标法计算供试品溶液中特女贞苷含量；其色谱条件：甲醇‑水35：65为流动相；色谱柱为C18色谱柱，流速为1.0ml/min，柱温30℃；检测波长为：224nm。
Description
技术领域：
本发明属于药物检测分析技术领域，涉及一种生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法。
背景技术：
生血宝合剂由制何首乌、女贞子、桑椹、墨旱莲、白芍、黄芪、狗脊7味药组成，具有滋补肝肾、益气生血等功效，在临床中广泛应用于肝肾不足、气血两虚所致的神疲乏力、头晕耳鸣；放、化疗所致的白细胞减少，缺铁性贫血等疾病。
女贞子为生血宝合剂处方中臣药，处方量较大，生物活性较强。女贞子常用于治疗肝肾阴虚、眩晕耳鸣、腰膝酸软、须发早白、目暗不明、内热消渴、骨蒸潮热等。女贞子主要成分有环烯醚萜苷类、三萜类、苯乙醇类、糖类和脂肪油类等，其中环烯醚萜苷类特女贞苷是女贞子的专属性成分之一，也是2020版《中国药典》用于女贞子含量测定的指标性成分，但该方法仅针对于女贞子一味药材，而现有的生血宝合剂和生血宝颗粒成分复杂，各成分互相干扰，按照这种方法测定，存在专属性差、检测效率较低，无法达到精确检测目的，为此需要更好的分离纯化技术和方法对特女贞苷含量进行检测。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其克服了现有技术中存在的生血宝制剂中特女贞苷含量测定专属性差、样品处理过程复杂、检测效率低，无法达到精确检测的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)对照品制备：称取特女贞苷对照品适量，加溶剂制成溶液，即得；
2)供试品溶液的制备：精密量取生血宝制剂，加入溶剂稀释定容，提取，滤过，取续滤液，即得；
3)测定：
分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。根据峰面积使用外标法计算供试品溶液中特女贞苷含量；
其色谱条件：甲醇:水35～40:60～65为流动相；色谱柱为C18色谱柱，流速为1.0ml/min，柱温30℃～40℃；检测波长为：210～340nm。
步骤3)中，甲醇-水35：65为流动相；检测波长为：224nm。
步骤1)、步骤2)中，溶剂为稀乙醇或甲醇。
步骤1)中，称取特女贞苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
步骤2)中，精密量取生血宝制剂2ml，加入稀乙醇稀释定容至25ml～100ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
步骤2)中，精密量取生血宝制剂2ml，加入稀乙醇稀释定容至25ml～100ml，回流30min，滤过，取续滤液，即得。
步骤2)中，精密量取生血宝制剂2ml，加入稀乙醇稀释定容至25ml～100ml，超声30min，滤过，取续滤液，即得。
甲醇浓度为50％～80％
一种生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法的应用，其特征在于：所述测定方法用于生血宝合剂或其他剂型中特女贞苷含量的测定。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
本发明建立了一种生血宝制剂中特女贞苷含量的测定方法。原有的生血宝合剂质量控制标准只对特女贞苷进行薄层鉴别，为进一步完善和提高质量标准，本发明将特女贞苷作为指标性成分，针对生血宝制剂中的特女贞苷，建立简单、可靠、精密度高、稳定性好的含量测定方法，以较好地控制生血宝制剂的质量，也为其质量标准的优化提供科学的依据。本发明还进行了方法学验证，验证结果表明，本发明方法优于现有技术，符合含量测定要求。
附图说明：
图1为特女贞苷紫外光谱扫描图(210～340nm)；
图2为流动相甲醇-水(40：60)HPLC图；其中，峰1：特女贞苷；A.特女贞苷对照品；B.供试样品；C.阴性样品；
图3为流动相甲醇-水(35：65)HPLC图；其中，峰1：特女贞苷；A.特女贞苷对照品；B.供试样品；C.阴性样品；
图4为提取溶剂考察重叠色谱图；
图5为提取溶剂体积考察重叠色谱图；
图6为提取方法考察重叠色谱图；
图7为对照品溶液图；
图8为阴性样品溶液图；
图9为供试品溶液图；
图10为线性重叠色谱图；
图11为标准曲线图；
图12为精密度重叠色谱图；
图13为溶液稳定性重叠色谱图；
图14为重复性试验重叠色谱图；
图15为回收率试验重叠色谱图；
图16为柱温考察30℃重叠色谱图；
图17为柱温考察35℃重叠色谱图；
图18为柱温考察40℃重叠色谱图。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种生血宝制剂中特女贞苷含量的测定方法，所述方法包括以下步骤：
1)对照品溶液制备方法：称取特女贞苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
2)供试品溶液的制备方法：精密量取生血宝制剂2ml，加入稀乙醇稀释定容至25ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3)测定方法：
分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。根据峰面积使用外标法计算供试品溶液中特女贞苷含量。
其色谱条件：甲醇-水(35：65)为流动相；色谱柱为C18色谱柱，流速为1.0ml/min，柱温30℃。检测波长为：224nm。
经方法学验证，本测定方法符合含量测定要求，可以用于生血宝制剂中特女贞苷的含量测定。
本发明优选的实验方法、色谱条件和样品前处理方法，是经过筛选得到的。采用高效液相色谱法，方法简单，提高了分析的准确性和分析效率。
本发明还进行了方法学验证，验证结果表明，本发明方法优于现有技术，符合含量测定要求。
一、仪器和试药
研究用仪器与材料：主要分析仪器：Agilent1260系列高效液相色谱仪，四元梯度泵，紫外检测器；；日立L-2000高效液相色谱仪，四元梯度泵，二级管阵列检测器；SHIMADZUshim-packGIST C18(4.6mm×250mm，5μm)、Agilent5TC C18(250×4.6mm，5μm)色谱柱；AG285分析天平；KQ-500VDE型超声波清洗器；HH-S8型电热恒温水浴锅。
对照品：特女贞苷(批号：111926-201906)中国食品药品检定研究院，纯度95.0％。
试剂：甲醇(色谱纯，云南新蓝景化学工业有限公司)、娃哈哈饮用纯净水、95％乙醇(分析纯，天津市河东区红岩试剂厂)、
供试样品：来源于清华德人西安幸福制药有限公司生血宝合剂样品15批，批号分别为21091、21092、21093、21094、22011、22012、22013、22101、22102、22103、22111、22112、22113、22114、22115。
阴性样品：参照《中国药典》2020版中“生血宝合剂”的处方(不加入女贞子)投料，按照其制备方法制成阴性样品。
筛选过程如下：
1、检测波长的选择
对特女贞苷对照品溶液进行紫外光谱扫描(210～340nm)，由图1可知，特女贞苷在紫外波长224nm有最大吸收，故选用224nm作为特女贞苷的检测波长。
2、色谱条件的确定
色谱柱为SHMADZUC18柱(4.6μm×250mm，5um)，流速为1.0ml/min，柱温30℃，流动相为甲醇-水。
对流动相(甲醇-水)的组成比例进行考察，如图2所示，当甲醇-水(40：60)时，特女贞苷色谱峰附近有明显杂峰干扰；而如图3所示，当甲醇-水(35：65)时，特女贞苷附近无其他成分干扰，说明该条件专属性良好，故流动相最终选择甲醇-水(35：65)。
3、供试品前处理方法的筛选
3.1溶剂选择
取生血宝合剂样品，摇匀后，精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，分别加入稀乙醇、80％甲醇、50％甲醇稀释至刻度(平行2份)，摇匀，滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定，每份样品平行进2针，色谱图见图4。计算结果如表1所示：80％甲醇和稀乙醇作为溶媒含量较高，且无差异。鉴于甲醇毒性较大，故确定采用稀乙醇作为溶媒。
表1提取溶剂考察结果
3.2提取溶剂体积的考察
取生血宝合剂样品，摇匀后，精密量取本品2ml，分别置25ml、50ml、100ml量瓶中(平行2份)，分别加入稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，按上述色谱条件测定，每份样品平行进2针，色谱图见图5。计算结果如表2所示：由表可见，在三种提取溶剂体积提取效率相当，综合考虑确定溶剂体积为25ml。
表2提取溶剂体积考察结果
3.3提取方法的考察
取生血宝合剂样品，摇匀后，精密量取本品2ml，制备6份，其中2份分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，密塞，称定重量，加热回流30min，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得；2份分别置25ml量瓶中，分别加入稀乙醇稀释至刻度，超声处理(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，即得；2份分别置25ml量瓶中，分别加入稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；按按上述色谱条件测定，每份样品平行进2针，色谱图见图6。计算结果如表3所示：回流30min、超声30min及摇匀处理含量无明显差异，故选择摇匀。
表3提取方法考察结果
综合以上考察结果，供试品溶液制备方法为：精密量取生血宝合剂2ml，置25ml量瓶中，加入稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法学考察
1、专属性
取不含女贞子的阴性样品按供试品溶液制备方法制备并测定，如图7-9所示，阴性样品在与特女贞苷对照品相同保留时间处未显色谱峰，而供试品在相同保留时间处显示色谱峰，说明该方法专属性良好。
2、线性关系
精密称取特女贞苷对照品41.56mg，置100ml量瓶中，加稀乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液贮备液。精密吸取对照品溶液贮备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0ml分别置10ml容量瓶中，加稀乙醇溶解稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液10μl注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，每份样品平行进2针，色谱图见图10。其对照品进样量与平均峰面积如表4所示。
表4特女贞苷测定结果
以对照品进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，见图11。由此可知特女贞苷进样量在0.1974～3.1584μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；回归方程：Y＝1225.7X+11.245；相关系数：R2＝0.9998。
3、精密度试验
精密吸取对照品溶液，按上述色谱条件操作，重复进样6次，分别进样10μl，测定峰面积和保留时间，结果RSD％为0.3％，0.2％，说明方法精密度良好。结果见图12、表5。
表5特女贞苷精密度测定结果
4、稳定性试验
按供试品制备方法制备供试品溶液，并按照上述色谱条件，分别在0、2、4、8、12、16、20、24、28、32、36h测定峰面积，色谱图见图13；测定结果如表6，供试溶液放置36h，其含量结果相差不大，RSD％为0.64％，说明供试品溶液稳定性良好。
表6特女贞苷稳定性测定结果
5、重复性
按上述供试品制备方法，对同一批制剂平行制备6份供试品溶液进行测定，色谱图见图14；测定结果如表7，RSD％为0.84％，说明方法重复性良好。
表7特女贞苷重复性测定结果
6、加样回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量的同一批样品1ml，平行6份，分别精密加入浓度为0.20197mg/ml的特女贞苷对照品溶液各5ml，再加入稀乙醇至刻度，摇匀，按上述色谱条件测定，色谱图见图15。
由表8可见，结果平均回收率为97.12％，RSD为1.09％，完全符合《中国药典》(2020年版)四部“9101分析方法验证指导原则”项下“样品中待测定成分含量和回收率限度”标准要求，即待测定成分含量为1mg/g时，回收率限度为90％～108％。说明回收率良好。
表8特女贞苷回收率测定结果
7、耐用性
考察不同柱温(30℃、35℃、40℃)对含量测定结果的影响。取同一份供试品溶液，分别以30℃、35℃、40℃为柱温，在其他色谱条件不变的情况下，对供试品进行含量测定，色谱图见图16-18。按外标法以峰面积计算本品的含量，由表9可知，柱温变化对分离效果影响不大，RSD为1.17％，均能达到理想的分离，柱温只对保留时间有影响，表明该方法耐用性良好。
表9特女贞苷耐用性柱温考察结果
四、女贞子药材及15批样品含量测定
按本发明的生血宝合剂中特女贞苷含量的测定方法，进行15批样品含量测定，结果见表10。
表10样品测定结果
结果与讨论
色谱条件与系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(35:65)为流动相；检测波长为224nm。理论板数以特女贞苷峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备取特女贞苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，
即得。
本发明不仅可用于生血宝合剂也可用于其他剂型。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡是利用本发明的说明书及附图内容所做的等同结构变化，均应包含在发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)对照品制备：称取特女贞苷对照品适量，加溶剂制成溶液，即得；
2)供试品溶液的制备：精密量取生血宝制剂，加入溶剂稀释定容，提取，滤过，取续滤液，即得；
3)测定：
分别取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。根据峰面积使用外标法计算供试品溶液中特女贞苷含量；
其色谱条件：甲醇:水35～40:60～65为流动相；色谱柱为C18色谱柱，流速为1.0ml/min，柱温30℃～40℃；检测波长为：210～340nm。
2.根据权利要求1所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：步骤3)中，甲醇-水35：65为流动相；检测波长为：224nm。
3.根据权利要求1所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：步骤1)、步骤2)中，溶剂为稀乙醇或甲醇。
4.根据权利要求1所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：步骤1)中，称取特女贞苷对照品适量，加稀乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
5.根据权利要求1所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：步骤2)中，精密量取生血宝制剂2ml，加入稀乙醇稀释定容至25ml～100ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.根据权利要求1所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：步骤2)中，精密量取生血宝制剂2ml，加入稀乙醇稀释定容至25ml～100ml，回流30min，滤过，取续滤液，即得。
7.根据权利要求1所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：步骤2)中，精密量取生血宝制剂2ml，加入稀乙醇稀释定容至25ml～100ml，超声30min，滤过，取续滤液，即得。
8.根据权利要求3所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法，其特征在于：甲醇浓度为50％～80％。
9.根据权利要求1所述的生血宝制剂中特女贞苷含量测定方法的应用，其特征在于：所述测定方法用于生血宝合剂或其他剂型中特女贞苷含量的测定。
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| CN117470990A (zh) * | 2023-10-30 | 2024-01-30 | 中国中医科学院中药研究所 | 一种生血宝制剂特征图谱的构建方法 |
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