CN114689710B - 一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法 - Google Patents

一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法，属于中成药生产技术领域，通过对照品溶液制备、供试品溶液制备的研究，以及高效液相色谱测定、相对校正因子值确定，对照品溶液的盐酸小檗碱峰面积得出其成分含量与峰面积关系的线性回归方程，并将供试品溶液测得的盐酸小檗碱峰面积代入线性回归方程即得样品中盐酸小檗碱成分的含量，再以盐酸小檗碱的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的含量，达到检测枇杷清肺饮提取物多成分质量检测的目的，检测便捷、可靠，成本较低。

Description

一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法
技术领域
本发明涉及中成药生产技术领域，具体涉及一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法。
背景技术
枇杷清肺饮始见于清代吴谦的《医宗金鉴》，是一种临床常用的中药汤剂，现代临床主要用于治疗痤疮。记载的煎法为：“取人参三分，枇杷叶二钱(刷去毛，蜜炙)，甘草三分(生)，黄连一钱，桑白皮二钱(鲜者佳)，黄柏一钱。水一盅半，煎七分，食远服”。照《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求》(征求意见稿)、《古代经典名方关键信息表(7首方剂)》(征求意见稿)中苓桂术甘汤剂量、制法等考证，通过考证的结果可知枇杷清肺饮现代的煎法为：“取人参1.12g，枇杷叶7.46g，甘草(甘草)1.12g，黄连(黄连)3.73g，桑白皮7.46g，黄柏3.73g。以水300毫升，煎至210毫升，食远服。”已有研究表明,枇杷清肺饮的有效物质主要集中为枇杷叶的三帖酸类成分、甘草主要含三萜类化合物、桑白皮的黄酮类成分、黄连和黄柏的异喹啉生物碱。
经典名方是由多味中药组成的复方，由于中药多成分的复杂性，单一成分或指标评价难以表征中药的质量，而多成分质量控制的方法需要较多的对照品。而中药化学成分对照品分离难度大或单体不稳定、难以供应、成本高等因素，在实际应用中有诸多限制，使得多成份质量控制的实施存在诸多困难，难以推广；近年来关于枇杷清肺饮的含量测定的文献未有相关报道，目前还没有文献公开将一测多评方法用于枇杷清肺饮的成份检测中，较为系统的质量控制方法还尚未建立。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法，解决了现有技术中中药的复方方剂的多成分质量控制的方法需要较多的对照品，现有操作方法成本高，质量控制受限制较多，实际应用存在很多困难的问题，结合现有的一测多评方法，一测多评法通过中药有效成分间存在的内在函数关系和比例关系法，测定一个成分实现多个成分同步测定，同时利用本方法得到了一个校正因子，目前未有相关的文献报道，利用校正因子结果计算含量从而节约中药稀有资源，降低检验成本，不仅解决了中药多成分定量和多指标质量控制中存在的对照品缺乏问题，同时实现多指标同步质量控制反应中药质量。
本发明通过下述技术方案实现：
一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法，包括以下步骤：
A、对照品溶液制备：取盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀对照品适量，加入溶剂甲醇，制得含盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀对照品的混合对照品溶液，即得；
B、供试品溶液制备：取枇杷清肺饮对照提取物，加入溶剂甲醇，制得供试品溶液；
C、高效液相色谱测定：分别吸取上述对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行数据测定；
D、相对校正因子值确定：根据对照品溶液测得的盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的峰面积，代入相对校正因子计算公式：相对校正因子(f)＝As*Cr/Cs*Ar，以盐酸小檗碱为内标，分别计算得到新绿原酸、桑皮苷A、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀相对于盐酸小檗碱的相对校正因子；
E、根据对照品溶液的盐酸小檗碱峰面积得出其成分含量与峰面积关系的线性回归方程，并将供试品溶液测得的盐酸小檗碱峰面积代入线性回归方程即得样品中盐酸小檗碱成分的含量，再以盐酸小檗碱的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的含量。
进一步地，步骤A中，对照品溶液具体制备方法为：取盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含新绿原酸、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各60μg，每1mL含桑皮苷A、盐酸黄柏碱各70μg的混合溶液，作为混合对照品溶液，即得。
进一步地，步骤B中，供试品溶液具体制备方法为：取枇杷清肺饮对照提取物约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理，再称定重量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
进一步地，所述步骤C中，高效液相色谱仪测定条件是：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
柱温为30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：220nm；
流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液，梯度脱洗。
进一步地，所述梯度洗脱过程为：
0～37min，流动相A为5～15％，流动相B为95～85％；
37～45min，流动相A为15～25％，流动相B为85～75％；
45～65min，流动相A为25～40％，流动相B为75～60％。
进一步地，在步骤E中，测得的新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的总量应为5.57％-10.35％。
进一步地，所述步骤B中，枇杷清肺饮对照提取物的制备方法为，包括以下步骤：
a1：按原料重量份数计，取饮片：人参1.12份，枇杷叶7.46份，甘草1.12份，黄连3.73份，桑白皮7.46份，黄柏3.73份；
b1：将a1步骤中的全部饮片，放在煎煮容器中，一煎加7倍量水，浸泡30min，煎煮30min；第二次加5倍量水，煎煮30min，共煎煮2次，过滤，合并滤液，冷冻干燥成冻干粉，得枇杷清肺饮对照提取物。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
(1)、本发明中，结合现有技术中的一测多评法，通过中药有效成分间存在的内在函数关系和比例关系法，测定一个成分(对照品易得、廉价、有效者)实现多个成分(对照品难以得到或难供应者)同步测定，同时利用本方法得到了一个校正因子，目前未有相关的文献报道，利用校正因子结果计算含量从而节约中药稀有资源，降低检验成本，不仅解决了中药多成分定量和多指标质量控制中存在的对照品缺乏问题，同时实现多指标同步质量控制反应中药质量。
(2)、本发明中，采用高效液相色谱法，并自主设计检测条件，结合一测多评法，检测方法便捷、可靠。
(3)、本发明中，通过测定这新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱六种成分，能有效控制枇杷清肺的对照提取物的质量，确保枇杷清肺的对照提取物质量的稳定。
(4)、本发明中，HPLC多成分检测方法，供试品制备简单，且该方法精密度高，稳定性好，重复性好，准确度高。能弥补现阶段对枇杷清肺饮研究的空白，为枇杷清肺饮等制剂的后续研究提供参考。
附图说明
图1为实施例3中方案一的流动相考察图。
图2是实施例3中方案二的流动相考察图。
图3是实施例3中方案三的流动相考察图。
图4是实施例4中专属性考察的色谱图。
图5是实施例7中新绿原酸标准曲线图。
图6是实施例7中桑皮苷A标准曲线图。
图7是实施例7中盐酸黄柏碱标准曲线图。
图8是实施例7中盐酸巴马汀标准曲线图。
图9是实施例7中木兰花碱标准曲线图。
图10是实施例7中盐酸小檗碱标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
高效液相色谱仪：Waters2695-2998型高效液相色谱仪、安捷伦1260型高效液相色谱仪、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪；
电子天平：ME204E/02、MS205DU、XP26(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
超纯水机：细胞型1810A(上海摩勒科学仪器有限公司)；
超声波清洗器：KQ5200DB型(600W，40KHz；昆山市超声仪器有限公司)；
色谱柱：Agilent 5TC C18 250×4.6mm、Kromasil C18 5μm 4.6×250mm、YMC-TriartC18 4.6×250mm。
盐酸小檗碱(中国食品药品检定研究院，批号：110713-201613，含量以86.8％计)；
新绿原酸(北京世纪奥科生物技术有限公司，批号：190124-015，含量以98％计)；
桑皮苷A(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq180811503，含量以98％计)；
盐酸黄柏碱(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq19012810，含量以98％计)；木兰花碱(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：wkq17063003，含量以98％计)
盐酸巴马汀(中国食品药品检定研究院，批号：110732-201812，含量以97.6％计)；
乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；
缺阴性样品信息：缺人参对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：PPQFY200911)；
缺蜜枇杷叶对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：PPQFY200912)；
缺甘草对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：PPQFY200913)；
缺黄连对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：PPQFY200914)；
缺桑白皮对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：PPQFY200915)；
缺黄柏对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：PPQFY200916)；
枇杷清肺饮对照提取物(四川新绿色药业科技发展有限公司制备，批号：PPQFY200901、PPQFY200902、PPQFY200903、PPQFY200904、PPQFY200905、PPQFY200906、PPQFY200907、PPQFY200908、PPQFY200909、PPQFY200910)。
实施例1
本实施例提供了一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法，包括以下步骤：
A、对照品溶液制备：取盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含新绿原酸、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各60μg，每1mL含桑皮苷A、盐酸黄柏碱各70μg的混合溶液，作为混合对照品溶液，即得；
B、供试品溶液制备：取枇杷清肺饮对照提取物约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率220W，频率50kHz)30分钟，再称定重量，用70％甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
C、高效液相色谱测定：分别吸取上述对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，进行数据测定；
D、相对校正因子值确定：根据对照品溶液测得的盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的峰面积，代入相对校正因子计算公式：相对校正因子(f)＝As*Cr/Cs*Ar，公式中的AS为内标物质的峰面积；Ar为对照品的峰面积；CS为内标物质的浓度；Cr为对照品的浓度，以盐酸小檗碱为内标，分别计算得到新绿原酸、桑皮苷A、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀相对于盐酸小檗碱的相对校正因子；
以盐酸小檗碱对照品为参照，以其保留时间相应的峰为S1峰，计算新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内(若相对保留时间偏离超过10％，则应以相应的被替代对照品确认为准)。相对保留时间及校正因子见下表1：
表1
E、根据对照品溶液的盐酸小檗碱峰面积得出其成分含量与峰面积关系的线性回归方程，并将供试品溶液测得的盐酸小檗碱峰面积代入线性回归方程即得样品中盐酸小檗碱成分的含量，再以盐酸小檗碱的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的含量。
结合表1中得到数据以及相对校正因子，以小檗碱的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱与盐酸巴马汀的含量。
实施例2
本实施例是对实施例1的步骤C中，色谱条件选择与系统适用性试验-检测波长的考察。
对新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品溶液进行全波长光谱采集，通过对光谱图的分析，新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱均在220nm波长下有较好的吸收，综合考虑，最终确定检测波长为220nm。
实施例3
本实施例是实施例1的步骤C中，色谱条件选择与系统适用性试验-色谱条件的考察。
以之前常用的色谱条件，结合对其物质特性的初判，设计了三种色谱条件，具体情况如下：
方案一：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为30℃；检测波长：220nm，结果见图1。
表2：方案一中梯度洗脱表
在该色谱条件下，出峰时间晚，60min内色谱峰未完全洗脱，需对色谱条件再进行考察。
方案二：以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表3中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为30℃；检测波长：220nm，结果见图2。
表3：方案二中梯度洗脱表
在该色谱条件下，出峰时间早，色谱峰分离度和对称性基本可行，但任需对色谱条件再进行优化。
方案三：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按下表4中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为30℃；检测波长：220nm。结果见图3。
表4：方案三中梯度洗脱表
由以上可知，在本方案的色谱条件下目标峰理论板数、分离度、对称性均更好，故选择该色谱条件作为枇杷清肺饮对照提取物质量检测方法的流动相。
综上所述，色谱条件及系统适应性为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；柱温为30℃；检测波长：220nm，理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。
实施例4
本实施例是对本发明的方法学考察-专属性试验。
供试品溶液的制备：按实施例1中拟定的实验条件，制备枇杷清肺饮对照提取物供试品溶液。
对照品溶液的制备：取新绿原酸、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、桑皮苷A、盐酸黄柏碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含新绿原酸、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各60μg，每1mL含桑皮苷A、盐酸黄柏碱各70μg的混合溶液，作为混合对照品溶液，即得。本对照品溶液的制备方法中，对照品制备成不同的浓度，便于计算峰面积从而便于计算含量。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺人参对照提取物阴性溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺枇杷叶对照提取物阴性溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺甘草对照提取物阴性溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺黄连对照提取物阴性溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺桑白皮对照提取物阴性溶液。
阴性对照溶液的制备：按以上拟定的实验条件，制备缺黄柏对照提取物阴性溶液。
按拟定方法进行检测。结果见图4，其中，峰1：新绿原酸；峰2：桑皮苷A；峰3：盐酸黄柏碱；峰4：木兰花碱；峰5：盐酸巴马汀；峰6：盐酸小檗碱。
结果表明，阴性对照溶液对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
实施例5
本实施例是对实施例1技术方案的方法学考察-精密度考察。
取对照品溶液连续进样6次，记录各成分的峰面积，计算RSD值，结果见表5。
表5：精密度考察结果
从表5所示结果表明，精密度考察中各成分的峰面积RSD值均小于1.03％，该仪器的精密度良好。
实施例6
本实施例是对实施例1技术方案的方法学-重复性考察。
取同一供试品(批号：PPQFY200901)0.1g，精密称定6份，由同一操作人员按照拟定的方法制成供试品溶液，计算6份供试品中各成分的含量，结果见表6。
表6：重复性实验结果
结果表明，枇杷清肺饮中新绿原酸、桑皮苷A、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀、小檗碱的含量的RSD值均合格，本方法重复性良好。
实施例7
本实施例是对实施例1技术方案的方法学-线性关系考察。
取新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱混合对照品母液，然后分别逐级稀释得到相应的混合对照品溶液。分别取上述溶液10μL注入液相色谱仪，分析得到峰面积，以浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制相应曲线，结果见表7-12、图5-10。
表7：新绿原酸标准曲线分析结果。
表8：桑皮苷A标准曲线分析结果
表9：盐酸黄柏碱标准曲线分析结果
表10：盐酸巴马汀标准曲线分析结果
表11：木兰花碱标准曲线分析结果
表12：盐酸小檗碱标准曲线分析结果
从上述考察结果来看，得出各成分在各自进样量范围内呈现良好的线性关系，线性关系考察结果，如表13所述。
表13：
实施例8
本实施例是对实施例1技术方案的方法学考察-稳定性实验。
取同一供试品溶液(批号：PPQFY200901)约0.1g，精密称定，制备供试品溶液，分别在0、2h、4h、8h、12h、24h测定各成分的色谱峰面积，结果见表14。
表14：
结果表明：在本实验条件下，各成分的峰面积RSD值均合格，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
实施例9
本实施例是对实施例1技术方案的方法学考察-加样回收率。
取已知含量的供试品(批号：PPQFY200901)约0.050g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的对照品，按拟定的方法进行供试品溶液的制备并测定，计算回收率，结果见表15。
表15：加样回收率实验结果
结果表明，各成分含量回收率结果的RSD值均合格，本方法准确度良好。
实施例10
本实施例是对方法学考察-不同仪器的考察
在前述实施例拟定的实验条件基础上，分别精密称取枇杷清肺饮对照提取物(批号PPQFY200901)，制备供试品溶液，分别在Waters e2695-2998、Agilent 1260、岛津LC-20AD型高效液相色谱仪上进行测定(色谱柱均为Agilent ZORBAX SB-C18 250×4.6mm 5μm)，计算各成分的含量。结果见表16。
表16：不同仪器考察结果
结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，各成分含量的RSD值均合格，本方法耐用性良好。
实施例11
本实施例是对方法学-耐用性的考察。
采用不同品牌色谱柱(Waters XBridge C18 4.6×250mm 5.0μm、Agilent ZORBAXSB-C18 4.6×250mm 5μm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm 5.0μm)对同一供试品(批号PPQFY200901)进行检测，结果见表17。
表17：耐用性考察结果。
结果表明，各成分含量的RSD值均合格，本方法色谱柱耐用性良好。
实施例12
本实施例是对实施例1中的相对校正因子的进一步考察、确定。
待测组分相对较正因子的计算：
取混合对照品溶液，进样5、10、15、20、30μL测定，以小檗碱为内标，分别计算新绿原酸、桑皮苷A、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀的相对校正因子，计算公式为：相对校正因子(f)＝As*Cr/Cs*Ar，式中AS为内标物质的峰面积；Ar为对照品的峰面积；CS为内标物质的浓度；Cr为对照品的浓度。结果见表18、19。
表18：混合对照品峰面积数据表
表19：相对较正因子计算结果表
进一步的，需对上述方案得到的相对较正因子进行耐用性考察。
采用Agilent 1260型，分别考察了3种不同品牌色谱柱(Waters XBridge C18 4.6×250mm 5.0μm、Agilent ZORBAX SB-C18 4.6×250mm 5μm、Kromasil 100-5-C18 4.6×250mm 5.0μm)；采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱考察了Waters e2695-2998、Agilent1260、岛津LC-20AD型高效液相色谱系统对校正因子的影响，结果见表20。
表20：相对较正因子重现性考察
结果表明，各成分的相对较正因子耐用性良好。
相对较正因子的确定：
参考《一测多评法建立的技术指南》，对影响相对较正因子的各因素进行考察，在RSD值小于5％的情况下，取各次试验所得相对较正因子的平均值，结果见下表21。
表21：相对较正因子结果汇总表
由表21可知，最终确定新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、盐酸木兰花碱、盐酸巴马汀的相对较正因子分别为1.69、1.66、1.46、0.68、1.08。
待测色谱的定位：
通过计算在不同色谱仪器和不同色谱柱中各待测成分色谱峰与小檗碱色谱峰的相对保留时间，对各待测成分进行定位，结果见表22。
表22：各成分的相对保留时间
结果表明，各成分色谱峰间相对保留时间波动较小，其RSD％值均小于3％。
一测多评法与外标法测定结果比较：
采用外标法和一测多评法计算枇杷清肺饮对照提取物中新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的含量，测定结果见表23。
表23：一测多评法与外标法测定结果比较
续表23
结果表明，常规的外标法实测值与一测多评法计算的含量值没有显著性差异，由此说明一测多评法在枇杷清肺饮的多指标成分质量评价中应用可行。
结果表明，枇杷清肺饮中新绿原酸、桑皮苷A、黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱总量的实测范围为7.11％-8.92％，平均值为7.96％，SD值为0.61，总含量平均值的70％-130％范围为5.57％-10.35％；均值加减3倍SD的限量范围为6.13％-9.79％。根据《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求(征求意见稿)》中关于合理确定质量标准中相关质控项目质量要求的上下限的方法，即含量测定的波动范围一般不超过均值的70％～130％，得出本品含新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的总量应为5.57％-10.35％。
实施例13
本实施例是在实施1的基础上的进一步优化，所述步骤B中，枇杷清肺饮对照提取物的制备方法为，包括以下步骤：
a1：按原料重量份数计，取饮片：人参1.12份，枇杷叶7.46份，甘草1.12份，黄连3.73份，桑白皮7.46份，黄柏3.73份；
b1：将a1步骤中的全部饮片，放在煎煮容器中，一煎加7倍量水，浸泡30min，煎煮30min；第二次加5倍量水，煎煮30min，共煎煮2次，过滤，合并滤液，冷冻干燥成冻干粉，得枇杷清肺饮对照提取物。
采用本实施例中的枇杷清肺饮对照提取物的制备方法，得到的枇杷清肺饮对照提取物冻干粉，冻干粉的性质稳定，含量检测得到的结果更准确。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、对照品溶液制备：取盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀对照品适量，加入溶剂甲醇，制得含盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀对照品的混合对照品溶液，即得；
B、供试品溶液制备：取枇杷清肺饮对照提取物，加入溶剂甲醇，制得供试品溶液；
C、高效液相色谱测定：分别吸取上述对照品溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行数据测定；
D、相对校正因子值确定：根据对照品溶液测得的盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的峰面积，代入相对校正因子计算公式：相对校正因子（f）=As*Cr/Cs*Ar，公式中的As为内标物质的峰面积；Ar为对照品的峰面积；Cs为内标物质的浓度；Cr为对照品的浓度，以盐酸小檗碱为内标，分别计算得到新绿原酸、桑皮苷A、黄柏碱、木兰花碱、巴马汀相对于盐酸小檗碱的相对校正因子；
E、根据对照品溶液的盐酸小檗碱峰面积得出其成分含量与峰面积关系的线性回归方程，并将供试品溶液测得的盐酸小檗碱峰面积代入线性回归方程即得样品中盐酸小檗碱成分的含量，再以盐酸小檗碱的峰面积为对照，分别乘以校正因子，计算新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀的含量；
步骤A中，对照品溶液具体制备方法为：取盐酸小檗碱、新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含新绿原酸、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱各60μg，每1mL含桑皮苷A、盐酸黄柏碱各70μg的混合溶液，作为混合对照品溶液，即得；
步骤B中，供试品溶液具体制备方法为：取枇杷清肺饮对照提取物0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理，再称定重量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
所述步骤C中，高效液相色谱仪测定条件是：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm；
柱温为30℃；
流速：1.0mL/min；
进样量：10μL；
检测波长：220nm；
流动相A为乙腈，流动相B为0.1%磷酸水溶液，梯度脱洗；
所述步骤B中，枇杷清肺饮对照提取物的制备方法为，包括以下步骤：
a1：按原料重量份数计，取饮片：人参1.12份，枇杷叶7.46份，甘草1.12份，黄连3.73份，桑白皮7.46份，黄柏3.73份；
b1：将a1步骤中的全部饮片，放在煎煮容器中，一煎加7倍量水，浸泡30min，煎煮30min；第二次加5倍量水，煎煮30min，共煎煮2次，过滤，合并滤液，冷冻干燥成冻干粉，得枇杷清肺饮对照提取物。
2.根据权利要求1所述的一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程为：
0～37min，流动相A为5～15%，流动相B为95～85%；
37～45min，流动相A为15～25%，流动相B为85～75%；
45～65min，流动相A为25～40%，流动相B为75～60%。
3.根据权利要求1所述的一种枇杷清肺饮提取物多成分质量检测方法，其特征在于：在步骤E中，测得的新绿原酸、桑皮苷A、盐酸黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的总量应为5.57%-10.35%。
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