CN104678011B

CN104678011B - 一种通脉养心丸的检测方法

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Publication number: CN104678011B
Application number: CN201510044671.2A
Authority: CN
Inventors: 王怡; 王磊; 高秀梅; 金兆祥; 李来来; 杨瑾; 张伯礼; 胡利民
Original assignee: Tianjin University of Traditional Chinese Medicine; Lerentang Pharmaceutical Factory of Tianjin Zhongxin Pharmaceutical Group Co Ltd
Current assignee: Lerentang Pharmaceutical Factory Of Jinyao Darentang Group Co ltd; Tianjin University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2015-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2035-01-29
Also published as: CN104678011A

Abstract

本发明实施例公开了一种通脉养心丸的质量控制方法，该方法测定5种指标成分的含量，其中，5种指标成分包括：甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、五味子醇甲、甘草酸，所述方法包括：(1)建立5种指标成分的标准曲线；(2)获得供试品溶液的高效液相色谱图；(3)确定供试品中5种指标成分含量；本发明采用高效液相色谱法同时测定通脉养心丸中5种指标成分的含量，具有简单快速、专属性强、精密度高、重现性好的特点，通过测定通脉养心丸中5种指标成分的含量，可以更有效地对通脉养心丸进行质量控制，从而保证通脉养心丸临床疗效。

Description

一种通脉养心丸的检测方法

技术领域

本发明涉及中药质量分析领域，特别涉及一种通脉养心丸的质量控制方法，该方法开创性地通过测定通脉养心丸的5种指标成分的含量来进行质量控制。

背景技术

中药化学成分复杂，具有多靶点、多途径作用特点，其药效物质往往是其所含的多种指标成分的综合作用，因此建立中药质量标准时必须尽可能地将药品内在品质反映出来，即中药定性鉴别，然后在分析出的指标成分中尽可能多地选取含量测定对象，即进行多指标成分的含量测定。

通脉养心丸是由11味中药材组成的复方制剂，具有养心补血、通脉止痛等功效，主要含有以下几味药材：甘草、鸡血藤、制何首乌、五味子。

《中国药典》2010年版中通脉养心丸含量测定项下，仅用高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，简称HPLC)测定通脉养心丸中甘草酸的含量，而通脉养心丸组方中药味众多、制备工艺复杂，其所含化合物成分繁多，仅控制一个指标成分并不能有效地对其进行质量控制，因此需要一种更加可信、更加全面的通脉养心丸的质量控制方法，对提升其质量控制水平具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明实施例公开了一种通脉养心丸的质量控制方法。技术方案如下：

一种通脉养心丸的质量控制方法，该方法测定5种指标成分的含量，其中，5种指标成分包括：甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、五味子醇甲、甘草酸，所述方法包括：

(1)建立5种指标成分的标准曲线

分别精密称定对照品甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、五味子醇甲、甘草酸，用体积分数为0～100％的甲醇水溶液溶解，制成具有已知浓度的各对照品溶液；然后分别精密吸取5种对照品溶液，并将其混合后，用体积分数为0～100％的甲醇水溶液稀释，配制成分别具有已知浓度的5种指标成分的对照品混合储备液；

用体积分数为0～100％的甲醇水溶液将所述对照品混合储备液稀释成一系列分别具有不同已知浓度的5种指标成分的对照品混合溶液；

在相同的预设色谱条件下，将体积V₁的各浓度的对照品混合溶液分别注入高效液相色谱仪中，获得各浓度对照品混合溶液的高效液相色谱图；

以各对照品混合溶液的高效液相色谱图中各指标成分的色谱峰峰面积为纵坐标或横坐标，以各指标成分的浓度为横坐标或纵坐标，分别建立各指标成分的标准曲线；

(2)获得供试品溶液的高效液相色谱图

将质量M的通脉养心丸，用体积V₂的体积分数0～100％的甲醇水溶液进行回流提取，过滤，弃去初滤液，量取体积V₃的续滤液，浓缩至体积V₄，离心取上清液作为供试品溶液；

在与以上(1)步骤中相同的预设色谱条件下，取体积V₁供试品溶液注入高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的高效液相色谱图；

(3)确定供试品中5种指标成分含量

根据供试品溶液高效液相色谱图中5种指标成分各自的色谱峰峰面积，根据已建立的各指标成分的标准曲线，分别读出5种指标成分各自的浓度C_浓，并按照下列公式分别计算出供试品中5种指标成分含量；

其中，所述预设的色谱条件包括：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：A相为0.01％～1％甲酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱。

其中，预设的色谱条件还包括：柱温：10～20℃；流速：0.3～1.0ml/分钟；进样量：2～10μL；检测波长：0-45分钟280nm，45-95分钟为254nm。

其中，所述梯度洗脱具体为：乙腈占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而增加，0–5分钟，5％；5–25分钟，5％–20％；25–40分钟，20％–21％；40–60分钟，21％–30％；60–70分钟，30％–45％；70–85分钟，45％–55％；85–90分钟，55％–95％；和90–95分钟，95％。

其中，流动相中A相为0.05％～0.5％甲酸-水。

其中，流动相中A相为0.1％甲酸-水。

其中，通脉养心丸的质量M与甲醇水溶液的体积V₂的比值为(1：50～80)g/mL。

其中，在步骤(1)和(2)中所采用的甲醇水溶液的体积分数为20％～90％。

其中，在步骤(1)和(2)中所采用的甲醇水溶液的体积分数为为40％～80％。

其中，在步骤(1)和(2)中所采用的甲醇水溶液的体积分数为60％～70％。

其中，在步骤(1)中，用体积分数为0～100％的甲醇水溶液将所述对照品混合储备液稀释成3～8个具有不同已知浓度的5种指标成分对照品混合溶液，在所得的各对照品混合溶液中，甘草苷的浓度为10～300μg/mL、何首乌苷的浓度为10～350μg/mL、芒柄花苷的浓度为0.5～25μg/mL、五味子醇甲的浓度为1～50μg/mL、甘草酸的浓度为15～500μg/mL。

本发明采用高效液相色谱法同时测定通脉养心丸中5种指标成分的含量，具有简单快速、专属性强、精密度高、重现性好的特点，通过测定通脉养心丸中5种指标成分的含量，可以更有效地对通脉养心丸进行质量控制，从而保证通脉养心丸临床疗效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为对照品混合溶液高效液相色谱图，其中，1代表甘草苷，2代表何首乌苷，3代表芒柄花苷，4代表甘草酸，5代表五味子醇甲；

图2为供试品溶液高效液相色谱图，其中，1代表甘草苷，2代表何首乌苷，3代表芒柄花苷，4代表甘草酸，5代表五味子醇甲；

图3为本发明方法的专属性试验高效液相色谱图，其中，1代表甘草苷，2代表何首乌苷，3代表芒柄花苷，4代表甘草酸，5代表五味子醇甲。

具体实施方式

通脉养心丸主要含甘草、鸡血藤、制何首乌、五味子这4味药材。其中，甘草中的甘草苷及甘草酸、鸡血藤中的芒柄花苷、制何首乌中的何首乌苷、五味子中的五味子酸甲的综合作用，才使得通脉养心丸具有良好的养心补血、通脉止痛的功效。也就是说甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、五味子醇甲、甘草酸这5种指标成分的含量在一定的范围内时，通脉养心丸才有良好的养心补血、通脉止痛的功效。如果某一指标成分的含量过高或过低，都会影响药物的临床疗效，因此，现有技术只测定甘草酸的含量是不能保证通脉养心丸的临床疗效的，只有全面测定上述5种指标成分的含量，才能够更加全面的对通脉养心丸进行质量控制，从而保证通脉养心丸的临床疗效。

本发明采用高效液相色谱法可以同时测定通脉养心丸5种指标成分的含量。在进行高效液相色谱测试时，色谱条件如下：色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：A相为0.01％～1％甲酸-水，优选A相为0.05％～0.5％甲酸-水，更优选A相为0.1％甲酸-水；B相为乙腈；进行梯度洗脱，其中，梯度洗脱优选为乙腈占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而增加，0–5分钟，5％；5–25分钟，5％–20％；25–40分钟，20％–21％；40–60分钟，21％–30％；60–70分钟，30％–45％；70–85分钟，45％–55％；85–90分钟，55％–95％；和90–95分钟，95％。发明人意外地发现采用如上色谱条件能够非常简单、方便、准确地测定通脉养心丸5种指标成分的含量，并且在该色谱条件下，检测的重现性非常高，这确保了本发明的方法能够准确地测定各种通脉养心丸5种指标成分的含量。对于其他更为具体的色谱条件，可以由本领域技术人员根据实验需要进行确定，例如，柱温：10～20℃；流速：0.3～1.0ml/分钟；进样量：2～10μL；检测波长：0-45分钟为280nm，45-95分钟为254nm。

发明人在实验的过程中，意外的发现，在对照品混合溶液中，当甘草苷的浓度为10～300μg/mL、何首乌苷的浓度为10～350μg/mL、芒柄花苷的浓度为0.5～25μg/mL、五味子醇甲的浓度为1～50μg/mL、甘草酸的浓度为15～500μg/mL时，尤其是5种指标成分在各对照品混合液中的浓度是相对均匀分布的情况下，进行线性回归所得到的回归方程的线性关系更好。

在制备供试品溶液时，发明人意外的发现，当通脉养心丸的质量M与甲醇水溶液的体积V₂的比值为(1：50～80)g/mL时，能够确保通脉养心丸中各指标成分都能够充分溶解在甲醇水溶液中。另外，在该比例范围内时，将体积V₃的续滤液，浓缩至体积V₄时，所需要的浓缩时间也较短，操作方便。

下面对本发明所需的仪器与试剂进行说明。

仪器：仪器：Agilent1100型高效液相色谱仪(Agilent公司)。

试剂：乙腈、甲醇为色谱纯(Merck公司)

对照品：

甘草苷(批号：140116，HPLC纯度99.07％)，上海融禾医药科技发展有限公司。

何首乌苷(批号：140329，HPLC纯度99.21％)，上海融禾医药科技发展有限公司。

芒柄花苷(批号：131130，HPLC纯度98.79％％)，上海融禾医药科技发展有限公司。

甘草酸(批号：140420，HPLC纯度99.47％)，上海融禾医药科技发展有限公司。

五味子醇甲(批号：100915，HPLC纯度99.23％)，上海融禾医药科技发展有限公司。

药材或制剂：

通脉养心丸，11批，天津中新药业乐仁堂制药厂生产，批号：A107626，A107765，A107750，C017396，D107458，B107801，A107730，A107650，D107532，A107696，C107368。

大枣(Ziziphuszizyphus)，批号：1212398。

制何首乌(Fallopiamultiflora(Thunb.)Harald.)，批号：1211236。

桂枝(CassiaTwig)，批号：1212370。

党参(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.)，批号：1008258。

五味子(Schisandrachinensis)，批号：1212300。

麦冬(Ophiopogonjaponicus)，批号：1212354。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)，批号：1210161。

地黄(Rehmannia)，产地：山西，批号：1212397。

鸡血藤(Kadsurainterior)，产地：广西，批号：1210322。

醋龟甲(CarapaxEtPlastrumTestudinis)，产地：湖北，批号：307091。

阿胶(CollaCoriiAaini)，产地：山东省聊城市阿胶县，批号：100641-2。

本发明中所提及的术语“精密称定”：精密称定系指称定重量应准确至所取重量的千分之一。“精密吸取”：系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该计量器具的精确度要求。

下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

确定色谱条件

色谱柱：AgilentZORBAXSB-C₁₈(5μm，4.6×250mm)；柱温：15℃；流速：0.6ml/分钟；进样量：5μl；检测波长：0-45分钟，280nm，45-95分钟，254nm；流动相：A相为0.1％甲酸-水，B相为乙腈；采用梯度洗脱的方法，乙腈站流动相的体积百分比在下属范围内随着时间的增加而增加：0–5分钟，5％–5％；5–25分钟，5％–20％；25–40分钟，20％–21％；40–60分钟，21％–30％；60–70分钟，30％–45％；70–85分钟，45％–55％；85–90分钟，55％–95％；90–95分钟，95％–95％。

对照品溶液制备

精密称定对照品甘草苷5.76mg，何首乌苷6.44mg，甘草酸9.73mg，五味子醇甲2.26mg，分别用70％甲醇溶液溶于2ml容量瓶中，用70％甲醇定容至刻度，摇匀，得甘草苷、何首乌苷、甘草酸和五味子醇甲的浓度分别为2880μg/mL，3220μg/mL，4865μg/mL，452μg/mL。精密称定对照品芒柄花苷2.22mg，用70％甲醇溶液溶于10ml容量瓶中，用70％甲醇定容至刻度，摇匀，得芒柄花苷的浓度为222μg/ml。将甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、甘草酸溶液分别精密吸取0.5mL，五味子醇甲精密吸取0.2mL，五者混合，用70％甲醇定容至5ml，配得对照品混合储备液。

上述的对照品混合储备液的制备虽然具体说明了各对照品的用量、甲醇水溶液的量及其体积分数，但需要说明的是，上述的对照品混合储备液的制备过程只是代表一个优选的实施例，不应构成对本发明技术方案的限制。在实际对照品混合储备液的制备中，本领域技术人员可以根据实际情况来选择各对照品的量、甲醇水溶液的量，例如选择1～10mg的各对照品，在1～10mL容量瓶中定容。甲醇水溶液的体积分数可以是0～100％，这是合理的，可以实现本发明的技术方案，但是，在实际对照品混合储备液的制备中，所采用的甲醇水溶液的体积分数为20％～90％，优选为40％～80％，更优选为60％～70％。

配得对照品混合储备液后，将上述对照品混合储备液作为对照品混合溶液7，简称为标7。

精密吸取标7的4ml于另一5ml容量瓶中，用70％甲醇定容后，作为对照品混合溶液6，简称为标6。

精密吸取标6的4ml于另一5ml容量瓶中，用70％甲醇定容后，作为对照品混合溶液5，简称为标5。

精密吸取标5的3ml于另一5ml容量瓶中，用70％甲醇定容后，作为对照品混合溶液4，简称为标4。

精密吸取标4的3ml于另一5ml容量瓶中，用70％甲醇定容后，作为对照品混合溶液3，简称为标3。

精密吸取标3的2ml于另一5ml容量瓶中，用70％甲醇定容后，作为对照品混合溶液2，简称为标2。

精密吸取标2的2ml于另一5ml容量瓶中，用70％甲醇定容后，作为对照品混合溶液1，简称为标1。

需要说明的是，除了可以采用上述的方法将对照品混合储备液稀释成一系列具有不同已知浓度的对照品混合溶液，还可以要用其它的方法，例如采用本领域常用的倍比稀释法等。

建立5种指标成分的标准曲线

在确定的相同色谱条件下，精密吸取标1～标7的对照品混合溶液5μL，分别注入高效液相色谱仪中，获得各对照品混合溶液的高效液相色谱图，其中，标7的高效液相色谱图如图1所示；

需要说明的是，精密吸取的对照品溶液的体积V₁具体值可以由本领域技术人员根据高效液相色谱仪的要求及实验结果确定，本发明在此不作具体限定。

根据标1～标7的对照品混合溶液的高效液相色谱图中各指标成分的峰面积，以及标1～标7的对照品混合溶液中各各指标成分的浓度，建立5种指标成分的浓度-峰面积标准曲线，以获得指标成分的线性与范围，结果如下表1。

表1各对照品线性与范围表

供试品溶液的制备

精密称定通脉养心丸M＝3g(批号A107626)，置梨形烧瓶中，精密加入70倍70％甲醇(V₂＝210ml)，回流提取3小时，放冷，摇匀，过滤，弃去初滤液，精密吸取V₃＝50ml续滤液，浓缩，用70％甲醇定容至V₄＝10ml，取适量溶液13,000转离心10分钟，取上清液作为供试品溶液。

上述的供试品溶液的制备虽然具体说明了通脉养心丸的质量M与甲醇水溶液的体积V₂等，但需要说明的是，上述的供试品溶液的制备只是代表一个优选的实施例，不应构成对本发明技术方案的限制。在实际供试品溶液的制备中，甲醇水溶液的体积V₂只要能够满足可以充分溶解质量M的通脉养心丸中各指标成分即可，例如通脉养心丸的质量M与甲醇水溶液的体积V₂的比值为(1：50～80)g/mL。甲醇水溶液的体积分数可以是0～100％，这是合理的，可以实现本发明的技术方案，但是，在实际供试品溶液的制备中，所采用的甲醇水溶液的体积分数为20％～90％，优选为40％～80％，更优选为60％～70％。

在确定的色谱条件下，精密吸取供试品溶液5μL注入超高效液相色谱仪中，获得供试品溶液的高效液相色谱图；供试品溶液色谱图如图2所示。

根据供试品溶液高效液相色谱图中5种指标成分各自的色谱峰峰面积，根据已建立的5种指标成分的标准曲线，分别读出5种指标成分各自的浓度C_浓，并按照下列公式分别计算出供试品中5种指标成分含量；

将11批次的通脉养心丸样品(批号：A107626，A107765，A107750，C017396，D107458，B107801，A107730，A107650，D107532，A107696，C107368)分别按上述实施例1方法制备供试品溶液，每个批次平行操作3次，用实施例1的色谱条件进行高效液相色谱(HPLC)分析，用外标法计算各指标成分含量。具体结果如表2所示。

表2多批次通脉养心丸各指标成分含量

方法专属性实验

制备阴性对照品溶液

按《中国药典》2010年版通脉养心丸处方准备除甘草以外的各味药材，按药典处方配比及制备方法制备缺甘草的通脉养心丸，用实施例1的方法，制备缺甘草的通脉养心丸阴性样品溶液，简称阴性样品1。同法制备缺甘草和鸡血藤、缺制何首乌、缺五味子的通脉养心丸，用实施例1的方法，分别制得：缺甘草和鸡血藤的通脉养心丸阴性溶液，简称阴性样品2；制备缺制何首乌的通脉养心丸阴性样品溶液，简称阴性样品3；制备缺五味子的通脉养心丸阴性样品溶液，简称阴性样品4。

取实施1的对照品溶液、实施1的供试品溶液以及4份阴性供试品溶液适量，用实施1的色谱条件进行HPLC分析，得图3。可知甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、甘草酸和五味子醇甲所在保留时间处对应的阴性供试品溶液无干扰。

仪器精密度试验

按实施例1记载的方法制备供试品溶液1份，取对照品溶液1份，用施例1记载的色谱条件进行HPLC分析，分别连续进样6次，计算各指标成分峰面积RSD，均小于2％。结果见下表3及表4。

表3仪器精密度中供试品溶液各指标成分峰面积RSD

表4仪器精密度中对照品溶液各指标成分峰面积RSD

样品稳定性试验

按实施例1记载的方法制备供试品溶液1份，用按实施例1记载的色谱条件进行HPLC分析，在0、2、4、6、8、10、12、14、24h时进样，计算各指标成分峰面积RSD。结果显示供试品溶液在24小时内稳定，具体见下表5。

表5样品稳定性试验中各指标成分峰面积RSD

方法重复性试验

平行制备供试品溶液6份，分别用上述色谱条件进行HPLC分析，用外标法计算各指标成分含量，考察各指标成分含量RSD。结果显示RSD均小于3％，具体见下表6。

表6方法重复性试验中各指标成分平均含量及其RSD

方法回收率试验

(1)配制用于加样的对照品溶液：

精密称定芒柄花苷2.28mg，70％甲醇溶液溶于2ml容量瓶中，用70％甲醇定容至刻度，摇匀，得芒柄花苷溶液。

精密称定甘草苷15.71mg，何首乌苷16.33mg，甘草酸28.34mg，五味子醇甲1.52mg，加入至50ml容量瓶中，加入约40ml70％甲醇溶解后，精密吸取0.5ml芒柄花苷溶液加入至该容量瓶中，用70％甲醇定容至刻度，摇匀，得用于加样的对照品溶液。

(2)取通脉养心丸1.5g(批号A107626)，置梨形烧瓶中，精密加入用于加样的对照品溶液8ml，再精密加入70％甲醇202ml，回流提取3小时，放冷，摇匀，过滤，弃去初滤液，精密取50ml续滤液，浓缩，用70％甲醇定容至10ml，取适量溶液13,000转离心10分钟，取上清液作为加样供试品溶液。平行操作6次，得6份加样供试品溶液。

取通脉养心丸1.5g(批号A107626)，精密加入70％甲醇210ml，回流提取3小时，其余操作步骤同加样供试品溶液制备，制得不加样的供试品溶液。

(3)取上述6份加样的供试品溶液及1份不加样供试品溶液适量，用上述色谱条件进行HPLC分析，用外标法计算各指标成分含量，计算加样回收率平均值及RSD。结果见下表7。

表7方法回收率试验结果

从上述结果可以看出，本发明采用高效液相色谱法同时测定通脉养心丸中5种指标成分的含量，具有简单快速、专属性强、精密度高、重现性好的特点，通过测定通脉养心丸中5种指标成分的含量，可以更有效地对通脉养心丸进行质量控制，从而保证通脉养心丸临床疗效。

Claims

1.一种通脉养心丸的检测方法，该方法测定通脉养心丸的5种指标成分的含量，其中，所述5种指标成分包括：甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、五味子醇甲、甘草酸，其特征在于，所述方法包括：

(1)建立5种指标成分的标准曲线

分别精密称定对照品甘草苷、何首乌苷、芒柄花苷、五味子醇甲、甘草酸，用体积分数为0～100％的甲醇水溶液溶解，制成具有已知浓度的各对照品溶液；然后分别精密吸取5种对照品溶液并将其混合，用体积分数为0～100％的甲醇水溶液稀释，配制成分别具有已知浓度的5种指标成分的对照品混合储备液；

(2)获得供试品溶液的高效液相色谱图

(3)确定供试品中5种指标成分含量

其中，所述预设的色谱条件包括：

色谱柱：采用十八烷基硅烷键合硅胶的固定相；流动相：A相为0.01％～1％甲酸-水，B相为乙腈；梯度洗脱,所述梯度洗脱具体为：乙腈占流动相的体积百分比在下述范围内随着时间的增加而增加，0–5分钟，5％；5–25分钟，5％–20％；25–40分钟，20％–21％；40–60分钟，21％–30％；60–70分钟，30％–45％；70–85分钟，45％–55％；85–90分钟，55％–95％；和90–95分钟，95％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，预设的色谱条件还包括：柱温：10～20℃；流速：0.3～1.0ml/分钟；进样量：2～10μL；检测波长：0-45分钟为280nm，45-95分钟为254nm。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相中A相为0.05％～0.5％甲酸-水。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，流动相中A相为0.1％甲酸-水。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通脉养心丸的质量M与甲醇水溶液的体积V₂的比值为(1：50～80)g/mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和(2)中所采用的甲醇水溶液的体积分数为20％～90％。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和(2)中所采用的甲醇水溶液的体积分数为40％～80％。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(1)和(2)中所采用的甲醇水溶液的体积分数为60％～70％。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，用体积分数为0～100％的甲醇水溶液将所述对照品混合储备液稀释成3～8个具有不同已知浓度的5种指标成分的对照品混合溶液，在所得的各对照品混合溶液中，甘草苷的浓度为10～300μg/mL、何首乌苷的浓度为10～350μg/mL、芒柄花苷的浓度为0.5～25μg/mL、五味子醇甲的浓度为1～50μg/mL、甘草酸的浓度为15～500μg/mL。