CN113671099B - 一种紫叶丹胶囊的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种紫叶丹胶囊的检测方法，所述方法，步骤如下：标准溶液的配制：取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准品母液，然后加75％的甲醇稀释到相应浓度；供试品溶液的配制，取胶囊内容物，加入75％的甲醇提取，滤过，取续滤液，采用高效液相色谱法检测，本发明可以同时快速、准确的测定紫叶丹胶囊中三种指标成分的含量，该方法精密度高、稳定性好、重复性优秀，同时还可以大幅缩短检验时间、节约试剂及标准品使用量，本发明还提供了一种紫叶丹胶囊指纹图谱方法，通过指纹图谱对比法控制产品质量，能更有效的保证产品的质量稳定，进而保证产品的安全性和有效性。
Description
技术领域：
本发明涉及一种中药成药的检测方法，特别涉及一种紫叶丹胶囊的检测方法，所述方法采用高效液相色谱法。
背景技术：
紫叶丹胶囊，为一种已经上市的中成药，配方为：叶下珠2100g，云芝800g，丹参200g，紫草200g，具有清肝解毒、活血化瘀之功效。用于慢性乙型病毒性肝炎辨证属湿热内蕴兼气虚血瘀型者。症见：脘腹胀满、胁肋疼痛、食欲不振、乏力口苦等。
原标准中各指标成分含量测定条件
现有检测方法操作复杂，不同组分需要分别测定，检测时间过长，在一定程度上延长了生产时间，增加每批生产时间及成本。
本发明为此提供一种新的检测方法，可以同时快速、准确的测定紫叶丹胶囊中三种指标成分丹参酮ⅡA、柯里拉京、丹酚酸B的含量。
发明内容：
本发明提供一种紫叶丹胶囊的检测方法，所述方法，包括以下步骤：
步骤1，标准溶液的配制：
取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加甲醇制成丹参酮ⅡA溶液；
步骤2，供试品溶液的配制：
取胶囊内容物，加入75％的甲醇提取，滤过，取续滤液；
步骤3，测定：
将标准溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图计算紫叶丹胶囊中丹参酮ⅡA、柯里拉京、丹酚酸B的含量。
优选的，本发明的方法，步骤如下：
步骤1，对照品溶液的制备取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准品母液，然后加75％的甲醇稀释成每1ml含丹参酮ⅡA 0.008-0.01mg的溶液，即得。
步骤2，供试品溶液的制备取胶囊内容物，0.4-0.6g，加入75％的甲醇溶解，称定重量，滤过，取续滤液。
步骤3，测定法吸取对照品溶液与供试品溶液各5-20μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图中的峰面积，计算丹参酮ⅡA、柯里拉京、丹酚酸B的含量。
最优选的，本发明的方法，步骤如下：
对照品溶液的制备取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准品母液，然后加75％的甲醇稀释成每1ml含丹参酮ⅡA 0.009mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备取装量差异项下的本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％的甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，以丹参酮ⅡA对照品的峰面积为对照，分别计算丹参酮ⅡA、柯里拉京、丹酚酸B的含量。
上述方法中的高效液相色谱条件如下：
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.3％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm。理论板数按丹参酮ⅡA峰计算应不低于3000。
其中，根据色谱图中的峰面积，计算丹参酮ⅡA，柯里拉京、丹酚酸B的含量。
计算方法如下：
本发明的检测方法，是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1仪器与试药
Startorius BSA224S电子天平(万分之一)，TP-215D电子天平(十万分之一)，Agilent 1260HPLC；，甲醇为色谱纯，水为超纯水。
2色谱条件
色谱柱：Kromasil C18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速：1.0ml/min，检测波长：254nm
2.1流动相的选择
参考国家食品药品监督管理局标准紫叶丹胶囊YBZ00532011中样品的制备方法，取本品内容物，研细，取约0.5g，和阴性样品(除丹参以外的相同处方量的其他各味药材，模拟工艺制成的样品)，同样制备供试品和阴性样品溶液，用甲醇-0.3％甲酸作为流动相进样分析，所得液相色谱图中的柯里拉京，丹酚酸B与流动相丹参酮ⅡA峰能达到基线分离。
结论：(1)在此流动相条件下，柯里拉京、丹酚酸B与丹参酮ⅡA峰均可基线分离；
(2)在确定的流动相系统下，阴性样品与空白溶剂在柯里拉京、丹酚酸B与丹参酮ⅡA出峰位置无干扰。
2.2测定波长的选择
取浓度为0.06654mg/ml的柯里拉京，0.13369mg/ml的丹酚酸B，0.01731mg/ml的丹参酮ⅡA对照品溶液，用甲醇-0.3％甲酸的流动相梯度洗脱，在200nm～400nm范围内进行波长扫描。对照品和样品都在254nm波长处有稳定吸收，综合3个对照品的色谱吸收，故选择254nm做为测定波长。
3标准溶液的配制
取丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加甲醇制成标准品母液，再加75％的甲醇(体积比为75％的甲醇水溶液)制成每1ml含0.009mg的溶液，即得。
4供试品溶液的配制
取装量差异项下的本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％的甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5提取溶剂的选择
参考国家食品药品监督管理局标准紫叶丹胶囊YBZ00532011中样品的制备方法，含量测定的提取溶剂分别是50％甲醇和75％的甲醇，因此分别采用50％甲醇、75％的甲醇、甲醇作为提取溶剂，考察提取效果。取本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，①其中两份精密加入50％甲醇；②两份精密加入75％的甲醇；③两份精密加入甲醇，6份分别称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定，结果见表1。
表1三种溶剂提取所得结果
结论：由上述结果可知，75％的甲醇与50％甲醇提取柯里拉京、丹酚酸B接近，明显高于甲醇提取；但50％甲醇提取丹参酮IIA含量很低，因此选择75％的甲醇作为提取溶剂。
6提取溶剂用量的考察
取本品内容物，研细，混匀，取约0.5g，6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，①其中两份精密加入75％的甲醇25ml；②两份精密加入75％的甲醇50ml；③两份精密加入75％的甲醇100ml，6份分别称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定，即得。结果见表2。
表2溶剂用量的考察结果
结论：由上述结果可知，甲醇50ml已基本提取完全，因此采取加入50ml 75％的甲醇超声提取。
7稳定性试验
取对照品溶液，按上述色谱条件每隔一定时间测定其峰面积，每次进样10μl，考察对照品溶液在室温放置下的稳定性，计算相对标准偏差，结果见表3。
表3稳定性试验结果
结果表明，柯里拉京对照品、丹酚酸B对照品、丹参酮ⅡA对照品室温放置24小时内稳定。
8精密度试验
精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，每次10μl，测定峰面积，结果见表4。
表4精密度试验结果
结果表明，本色谱条件下的仪器精密度良好。
9重复性试验
精密称取胶囊内容物(批号：210101)6份，按上述拟定的方法制成供试品溶液，对6份样品进行含量测定，进样量10μl，结果见表5。
表5紫叶丹胶囊重复性试验结果
结果表明，本方法三种成分的RSD均小于3％，重现性良好。
10加样回收率试验
取已知柯里拉京含量、丹酚酸B含量、丹参酮ⅡA含量的胶囊(批号：210101)6份，分别精密加入一定量的柯里拉京含量、丹酚酸B含量、丹参酮ⅡA对照品，按上述拟定的方法制成供试品溶液，对6份样品进行含量测定，进样量10μl，计算回收率，结果见表6-8。
表6柯里拉京回收率试验结果
结果表明，本法的回收率在99.69～100.55％，平均为100.13％，RSD为0.30％，符合相关要求。
表7丹酚酸B回收率试验结果
结果表明，本法的回收率在98.39～100.84％，平均为99.27％，RSD为0.95％，符合相关要求。
表8丹参酮ⅡA回收率试验结果
结果表明，本法的回收率在98.54～100.77％，平均为99.59％，RSD为0.73％，符合相关要求。
11相对校正因子计算
照含量测定项下的方法，分别考察不同品牌的C18色谱柱(Kromasil C18、WelchC18、Dikma C18、安捷伦C18)及不同品牌液相(安捷伦、岛津)所测得的线性回归方程。记录各条件下色谱图。结果见表9。
表9各待测组分在不同仪器和不同色谱柱上的相对校正因子
结论：柯里拉京、丹酚酸B相对校正因子差异较小，RSD分别为2.57％、4.57％，该方法符合不同仪器和色谱柱，耐用性强。可以得出，一测多评法可用作检测紫叶丹胶囊中柯里拉京、丹酚酸B、丹参酮ⅡA含量，方法简便、快捷、准确、可靠。
12待测成分色谱峰的定性
照含量测定项下的方法，分别考察不同厂家、不同型号的C18色谱柱。结果见10。
表10各待测组分在不同仪器和不同色谱柱上的保留时间差
上述结果表明：柯里拉京、丹酚酸B保留时间差差异较小，RSD分别为1.20％、2.62％，该方法符合不同仪器和色谱柱，耐用性强。可以得出，三种成分相对位置比较稳定。因此，在丹参酮ⅡA保留时间的前提下，可以准确定位柯里拉京、丹酚酸B色谱峰。
13紫叶丹胶囊一测多评法与常规外标法测定结果比较研究
取样品，按上述方法测定，计算含量。样品测定结果见表11。
表11一测多评法与常规外标法测定紫叶丹胶囊中成分的含量
本发明在上述检测方法的基础上，进一步研究了指纹图谱测定方法，为此，本发明进一步提供紫叶丹胶囊指纹图谱测定方法，所述方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液制备：
取紫叶丹胶囊内容物，0.4-0.6g，加入75％的甲醇使有效成份溶解，过滤，取续滤液，
步骤2，色谱图的测定：
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图。
步骤3，比对：
将步骤2得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行比对，若相似则判断供试品为合格产品。
优选的，所述方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液制备：
取紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.5g，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用
步骤2，色谱图的测定：
取供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，检测波长：254nm，记录色谱图；步骤3，比对：
将步骤2得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行比对，若相似则判断供试品为合格产品。
其中，指纹图谱测定方法的高效液相色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：Welch100-5-C18 4.6×250mm 5μm)，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。检测波长：254nm，进样：10μL，
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 20 | 80 |
| 10 | 30 | 70 |
| 15 | 40 | 60 |
| 30 | 50 | 50 |
| 35 | 90 | 10 |
| 50 | 100 | 0 |
| 51 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
紫叶丹胶囊指纹图谱测定方法中，所述标准对照指纹图谱，建立方法如下：
步骤1，
取多批次合格的紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.4-0.6g，加入75％的甲醇溶解有效成分，过滤，取续滤液，备用；
优选的，取5-50批次合格的紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.4-0.6g，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用；
步骤2，
将多批次步骤1的续滤液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
步骤3，
对得到的多批次色谱图，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰作为共有峰进行标定，确定了15个共有峰，经计算机拟合，得到标准对照指纹图谱。其中，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：Welch100-5-C18 4.6×250mm 5μm)，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。检测波长：254nm，进样量：10μl，
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 20 | 80 |
| 10 | 30 | 70 |
| 15 | 40 | 60 |
| 30 | 50 | 50 |
| 35 | 90 | 10 |
| 50 | 100 | 0 |
| 51 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
本发明考察了建立的方法用于指纹图谱测定的精密度，结果如下：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，结果是：指纹图相似度计算结果均为1.000，表明该方法准确可靠。
本发明考察了建立的方法的重复性，结果如下：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，结果是：指纹图谱相似度计算结果均大于0.997，表明该方法重复性良好。
本发明考察了供试品溶液的稳定性，结果如下：
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，结果是：指纹图谱相似度计算结果均大于0.999，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
附图说明：
图1：紫叶丹胶囊指纹图谱的检测结果
图2：紫叶丹胶囊精密度指纹图谱
图3：紫叶丹胶囊重复性试验指纹图谱
图4：紫叶丹胶囊稳定性试验指纹图谱
图5：7批紫叶丹胶囊样品的指纹图谱
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制：
实施例1：紫叶丹胶囊HPLC指纹图谱检测方法
1、仪器及材料：
紫叶丹胶囊(北京汉典制药有限公司，批号：210101)
甲醇(色谱纯，Honeywell，lot No：UC3G1H)
磷酸(AR，天津福晨化学试剂有限公司，批号：20180420)
电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，BSA224S)
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ500DE)
高效液相色谱仪(Agilent 1260Infinity，HPLC-2，VWD)
色谱柱(Welch 100-5-C 18，250×4.6mm，5μm)
2、实验过程：
供试品溶液制备：取210101批紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：Welch 100-5-C18 4.6×250mm 5μm)，柱温为30℃；检测波长：254nm；流速为每分钟1.0ml。
3、测定：进样量：10μL，照高效液相色谱法测定，记录色谱图，如图1。
4、比对：
将得到的色谱图图1和标准对照指纹图谱图5进行比对，两者相似度为95％，结论为：供试品为合格产品。
实施例2：
1精密度试验
取同一批号紫叶丹胶囊(批号：210101)的供试品，按照拟定的提取方法制备样品溶液，取10μl注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱图谱相似度计算结果均为1.000(以S1为参照，图2所示)，表明该方法准确可靠。
2重复性试验
同一批号紫叶丹胶囊(批号：210101)的供试品6份，按照拟定的提取方法制备样品溶液，各取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱图谱相似度计算结果均大于0.997(以S1为参照，图3所示)，表明测定方法的重现性好。
3稳定性试验
同一批号紫叶丹胶囊(批号：210101)的供试品，分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h共6个时间点进行检测，6次测定结果经指纹图谱相似度软件计算，测得的色谱指纹图谱的相似度满足相似度不小于0.999(如图4所示)；表明在24h内供试品溶液的成分是稳定的。
实施例3：紫叶丹胶囊标准指纹图谱建立方法
1、仪器及材料：
紫叶丹胶囊(北京汉典制药有限公司，批号：190401、190402、190701、190901、191201、200401、210101)
甲醇(色谱纯，Honeywell，lot No：UC3G1H)
磷酸(AR，天津福晨化学试剂有限公司，批号：20180420)
电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，BSA224S)
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ500DE)
高效液相色谱仪(Agilent 1260Infinity，HPLC-2，VWD)
色谱柱(Welch 100-5-C 18，250×4.6mm，5μm)
2、实验过程：
供试品溶液制备：取7批紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用。
| 批号 | 称样量1(g) | 称样量2(g) | |
| S1 | 190401 | 0.5227 | 0.5183 |
| S2 | 190402 | 0.5162 | 0.5178 |
| S3 | 190701 | 0.5175 | 0.5153 |
| S4 | 190901 | 0.5350 | 0.5276 |
| S5 | 191201 | 0.5258 | 0.5214 |
| S6 | 200401 | 0.5363 | 0.5319 |
| S7 | 210101 | 0.5206 | 0.5188 |
色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱。(色谱柱：Welch 100-5-C18 4.6×250mm 5μm)，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 20 | 80 |
| 10 | 30 | 70 |
| 15 | 40 | 60 |
| 30 | 50 | 50 |
| 35 | 90 | 10 |
| 50 | 100 | 0 |
| 51 | 20 | 80 |
| 60 | 20 | 80 |
检测波长：254nm
进样量：10μL，记录色谱图。
3、结果：
将得到的S1-S7图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)进行相似度评价，以S1图谱作为参照，采用平均数法，时间窗宽度为0.1min，经多点校正后Mark峰谱匹配，生成对照指纹图谱，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰作为共有峰进行标定，确定了15个共有峰，7批紫叶丹胶囊指纹图谱见图5.
实施例4：一测多评方法
步骤如下：
步骤1，标准溶液的配制：取丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇制成标准品母液，再加75％的甲醇制成每1ml含0.009mg的标准溶液，即得；
步骤2，供试品溶液的配制：取胶囊内容物，研细，混匀，取0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入75％的甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用75％的甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
步骤3，测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，以丹参酮ⅡA对照品的峰面积为对照，分别计算丹参酮ⅡA、柯里拉京、丹酚酸B的含量；
其中，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Kromasil C184.6×250mm 5μm)；以甲醇为流动相A，以0.3％甲酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml，检测波长：254nm，进样：10μl
实施例5：
实施例1，实施例3或实施例4中的对照品溶液的制备，方法如下：丹参酮ⅡA对照品,加入75％的甲醇制成每1ml含丹参酮ⅡA 0.008或0.01mg的溶液。
供试品溶液的制备，方法如下：取胶囊内容物0.4或0.6g，加入75％的甲醇溶解，称定重量，滤过，续滤液为供试品溶液。
测定法，方法如下：吸取对照品溶液与供试品溶液各5或20μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图。
其他操作步骤不变。
Claims (3)
1.一种紫叶丹胶囊指纹图谱测定方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
步骤1，供试品溶液制备：
取紫叶丹胶囊内容物0.4-0.6g，加入75％的甲醇使有效成份溶解，过滤，取续滤液；
步骤2，色谱图的测定：
取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
步骤3，比对：
将步骤2得到的色谱图和标准对照指纹图谱进行比对，若相似则判断供试品为合格产品；
其中，所述标准对照指纹图谱的建立方法，步骤如下：
步骤1，
取多批次合格的紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.4-0.6g，加入75％的甲醇溶解有效成分，过滤，取续滤液，备用；
步骤2，
将多批次步骤1的续滤液分别注入高效液相色谱仪，得到色谱图；
步骤3，
对得到的多批次色谱图，选择稳定性好，吸收强，特征明显的色谱峰作为共有峰进行标定，确定了15个共有峰，经计算机拟合，得到标准对照指纹图谱；
其色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱：Welch 100-5-C18 4.6×250mm5μm)；以甲醇为流动相A，以0.3％磷酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml，检测波长：254nm，进样量：10μL，
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1所述的方法为：取5-50批次合格的紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.4-0.6g，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1所述的方法为：取30批次合格的紫叶丹胶囊内容物，研细，称取0.5g，置锥形瓶中，精密量取75％的甲醇50ml，超声处理30min，过滤，取续滤液，备用。
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