CN102520103B

CN102520103B - 六味地黄丸中成分的定量检测方法

Info

Publication number: CN102520103B
Application number: CN201110426259.9A
Authority: CN
Inventors: 郝延军; 桑育黎; 孙苓苓; 李虹; 陈婧; 王维宁; 赵晓笠; 徐秋阳
Original assignee: LIAONING PROVINCE INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Current assignee: LIAONING PROVINCE INSTITUTE FOR FOOD AND DRUG CONTROL
Priority date: 2011-12-19
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2031-12-19
Also published as: CN102520103A

Abstract

本发明涉及一种六味地黄丸中成分的定量检测方法。采用的技术方案是：六味地黄丸对照中成药提取液的组成为：每毫升提取液中含有：16.71～66.82ug5-羟甲基糠醛、30.56～122.22ug莫诺苷、19.52～78.06ug马钱苷、12.71～50.84ug芍药苷和40.27～161.06ug丹皮酚。以本发明提供的六味地黄丸对照中成药提取液为标准物质，采用高效液相色谱法，对商品六味地黄丸进行含量测定，能同时对多成分进行控制，简化检验过程，大大地降低检验成本，符合中药检验领域技术发展趋势。而且对照提取液的制备方法简便，利于推广应用，实用性强。

Description

六味地黄丸中成分的定量检测方法

技术领域

本发明属于中药成分分析领域，具体地涉及一种针对商品化的六味地黄丸质量的检测方法。

背景技术

众所周知，在中成药检验中经常需要使用大量对照品，对照品价格高，数量有限，已经成为制约对照品检验方法广泛应用的重要因素，同时也是企业生产、检验成本提高，导致商品药价过高的因素之一。

另外，药典中对于中药成分含量的测定项规定：同时测定2个或多个组分含量的中成药，在实验操作上需要分别配制相应的2个或多个对照品溶液，然后分别进行检测，因此，操作复杂，不仅试验用对照品用量大，而且实验后剩余的对照品溶液弃用，都造成巨大的浪费。

以经典药物六味地黄丸为例，六味地黄丸的主要成分为5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚，按照传统的药品检测方法，需要分别配置5种成分的对照品溶液，然后分别制备供试品溶液，再按不同的检测条件进行检测，操作步骤繁琐，检验周期长，不利于快速高效地进行检验，同时5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚的对照品价格高，尤其是莫诺苷对照品供应量极其有限，每20mg莫诺苷价格在2000元以上，造成检验成本过高，目前中药检验领域的技术发展趋势是快速、高效，多组分含量同时测定。所以急需探索一种使用成本低的标准物质，并且对中成药中多个组分的含量同时进行测定的简便方法。

发明内容

本发明的目的是针对目前检验技术中存在的不足，提供新的中成药检验对照物——六味地黄丸对照中成药提取液，应用按本发明中方法制备的六味地黄丸对照中成药提取液，测定商品六味地黄丸中的5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚含量。本发明不仅操作简便，检验速度块，而且降低了检测成本，准确度高。

本发明采用的技术方案是：六味地黄丸对照中成药提取液，其组成为：每毫升提取液中含有：16.71～66.82μg 5-羟甲基糠醛、30.56～122.22μg 莫诺苷、19.52～78.06μg 马钱苷、12.71～50.84 μg 芍药苷和40.27～161.06 μg 丹皮酚。

上述的六味地黄丸对照中成药提取液的制备方法如下：

1) 六味地黄丸对照中成药的制备：取熟地黄160份、酒萸肉80份、牡丹皮60份、山药80份、茯苓60份和泽泻60份，粉碎成细粉，混匀；每100g粉末加炼蜜35～50g与适量的水，制得六味地黄丸对照中成药；或每100g粉末加炼蜜80～110g制成六味地黄丸对照中成药；

2) 六味地黄丸对照中成药提取液的制备：取六味地黄丸对照中成药15～30g，置具塞锥形瓶中，加甲醇200～400mL，超声提取25～40分钟，滤过，滤液加在中性氧化铝柱上，用100～200mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸至50～90mL，转移至100～200mL量瓶中，加甲醇至刻度，用微孔滤膜过滤至安瓶中，充氮气，熔封。

一种商品六味地黄丸中成分的定量检测方法，步骤如下：

1) 采用高效液相色谱法，利用标准对照品5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚标定上述的六味地黄丸对照中成药提取液中的5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量，以此作为标准物质；

2) 商品六味地黄丸样品的处理：取商品六味地黄丸1～2.5g，置具塞锥形瓶中，加甲醇30～40mL，超声提取25～40分钟，滤过，滤液蒸至5～9mL，转移至10～25mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得供试液；

3) 检测：采用高效液相色谱仪；紫外检测器，检测条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为 0.05%磷酸水；

梯度洗脱：0-30 min，流动相B的配比由95%至80%；

30-80 min，流动相B的配比由80%至30%；

80-85 min，流动相B的配比由30%至95%；

柱温：35℃；

流速：1 mL/min；

检测波长：237 nm；

进样量：10～20μL。

本发明的原理是：本发明首先采用对照品标定六味地黄丸对照中成药提取液中的5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量，并注明批号和5个成分的含量，以此为标准物质，采用高效液相色谱法，对商品六味地黄丸中的5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚5个成分同时进行含量测定。

本发明的有益效果是：① 本发明和现有的质量控制方法相比，能同时对多成分含量进行测定，简化检验过程，大大地降低检验成本，由目前每批次上千元的检验成本降低为几十元，只需用较少的对照品就可以标定出一大批对照中成药提取液。同时对照提取液的制备方法简便，利于推广应用。② 采用本发明的方法，样品中5个成分的分离度和稳定性高，以此方法对全国各地收集的六味地黄丸26批次样品，进行了含量测定，并与直接应用对照品进行含量测定的方法进行比较，RSD值均符合要求。③ 针对目前药品市场存在的假药问题，经常有知情人举报是假药，而按现有标准检验却符合规定的情况发生，这是由于不法企业不按制备工艺生产，仅添加检验标准中要求的一个或两个对照品或药材提取物，这一问题已经是目前中成药质量监管中的突出问题。但是采用本发明的以六味地黄丸对照中成药提取液为标准物质进行检测，同时对5个成分的含量进行测定，可以在技术上制约企业的造假行为，对于节约检验成本，提升中药的质量控制水平具有重要的现实意义。

附图说明

图1是实施例1中对照品5-羟甲基糠醛的HPLC图。

图2是实施例1中对照品莫诺苷的HPLC图。

图3是实施例1中对照品马钱苷的HPLC图。

图4是实施例1中对照品芍药苷的HPLC图。

图5是实施例1中对照品丹皮酚的HPLC图。

图6是实施例1中六味地黄丸对照中成药提取液的HPLC图。

图7是实施例2中第1批次的商品六味地黄丸的HPLC图。

具体实施方式

实施例1 六味地黄丸对照中成药提取液

（一）六味地黄丸对照中成药提取液的制备

1）六味地黄丸对照中成药的制备：取熟地黄160g、酒萸肉80 g、牡丹皮60 g、山药80 g、茯苓60 g和泽泻60 g，粉碎成细粉，过40目筛，混匀；每100g粉末加炼蜜100g制成六味地黄丸对照中成药；

2）六味地黄丸对照中成药提取液的制备：取六味地黄丸对照中成药15g，置具塞锥形瓶中，加甲醇200mL，超声提取25分钟，滤过，滤液加在中性氧化铝柱（100～200目，10g，内径1cm）上，用100mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸至50mL，转移至100mL量瓶中，加甲醇至刻度，用微孔滤膜过滤至安瓶中，充氮气，熔封；

3）标定：采用高效液相色谱仪；检测条件如下：

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（4.6 mm×250 mm，5 μm）；

流动相：乙腈（流动相A）- 0.05%磷酸水（流动相B）；

梯度洗脱：0-30 min，流动相B的配比由95%至80%；

30-80 min，流动相B的配比由80%至30%；

80-85 min，流动相B的配比由30%至95%；

柱温：35℃；

流速：1 mL/min；

检测波长：237 nm；

进样量：10 μL。

对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解，分别制成90 μg/ml、90 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、40 μg/mL的对照品溶液；理论板数分别按5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚计算均不低于3000。

方法学研究

线性关系考察：精密吸取5-羟甲基糠醛对照品溶液2、5、10、15、20 μL进样，以对照品进样量为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线得回归方程 Y = 967.15X+2.02（r = 0.9999）, 结果表明，5-羟甲基糠醛进样量在0.184~1.84 μg与峰面积的线性关系良好。精密吸取莫诺苷对照品溶液1、2、5、8、10 μL进样，回归方程 Y = 143.78X+10.72（r = 0.9997），结果表明，莫诺苷进样量在0.090~0.90 μg与峰面积的线性关系良好。精密吸取马钱苷对照品溶液2、5、8、10、15 μL进样，回归方程 Y = 1552.78X+23.29（r = 0.9995），结果表明，马钱苷进样量在0.0989~0.7416 μg与峰面积的线性关系良好。精密吸取芍药苷对照品溶液2、4、6、8、10 μL进样，回归方程 Y = 1154.52X-3.42（r = 0.9995），结果表明，芍药苷进样量在0.076~0.379 μg与峰面积的线性关系良好。精密吸取丹皮酚对照品溶液2、5、10、15、20 μL进样，回归方程Y=90.183X+25.265（r =0.9995），结果表明，丹皮酚进样量在0.0793~0.793 μg与峰面积的线性关系良好。

精密度试验：精密吸取5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚对照品溶液各10 μL，连续进样6次，测得5-羟甲基糠醛的RSD为1.2%，莫诺苷的RSD为1.1%, 马钱苷的RSD为1.2%，芍药苷RSD为1.0% ，丹皮酚的RSD为1.0%。

稳定性试验：取制备的六味地黄丸对照中成药提取液，进行24个月的常温稳定性实验研究。结果见表1。

以上实验结果显示，本发明的方法分离度良好，5个成分的稳定性在常温条件下24个月的浓度值RSD均小于1.0%。在甲醇溶液中，氮气密封的条件下，5种成分的稳定性良好。

本发明，六味地黄丸对照中成药提取液中5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚5个成分达到基线分离，确定了线性范围，进行了精密度、稳定性、重复性试验，含量测定结果均小于3.0%， 5个成分的稳定性在常温条件下24个月的浓度值RSD均小于1.0%，在甲醇溶液中，氮气密封的条件下，5种成分的稳定性良好，说明以该对照提取物对六味地黄丸进行质量控制是可行的。

含量测定结果：提取液中，每毫升含有：5-羟甲基糠醛33.41μg，莫诺苷61.11μg，马钱苷39.03μg，芍药苷25.42μg，丹皮酚80.53 μg。

实施例2 商品化的六味地黄丸成分含量的检测

1）采用实施例1制备的六味地黄丸对照中成药提取液为标准物质进行检测；

2）商品六味地黄丸样品的处理：分别称取市购的不同厂家的26批次商品六味地黄丸1g，置具塞锥形瓶中，加甲醇30mL，超声提取25分钟，滤过，滤液蒸至5mL，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得供试液；

3）检测：采用高效液相色谱仪检测，检测条件如下:

色谱柱：以十八烷基键合硅胶为填充剂；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为 0.05%磷酸水；

梯度洗脱：0-30 min，流动相B的配比由95%至80%；

30-80 min，流动相B的配比由80%至30%；

80-85 min，流动相B的配比由30%至95%；

柱温：35℃；

流速：1 mL/min；

检测波长：237 nm；

进样量：10～20μL。

理论板数分别按5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚计算,均不低于3000；结果见表2。

4）对比试验：同时采用传统的方法检测。对照品溶液的制备：取5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷、丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇使溶解，分别制成90 μg/ml、90 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、40 μg/mL的对照品溶液；结果见表2；

如表2所示，通过对26批次的商品六味地黄丸进行检测，本发明的方法和现行的质量控制方法相比，结果一致。而且本发明的方法能同时对多成分进行控制，简化检验过程，大大地降低检验成本，符合中药检验领域技术发展趋势。而且对照提取液的制备方法简便，利于推广应用，实用性强。

Claims

1.商品六味地黄丸中成分的定量检测方法，其特征在于步骤如下：

1）采用高效液相色谱法，利用标准对照品5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚标定六味地黄丸对照中成药提取液中的5-羟甲基糠醛、莫诺苷、马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量，以此作为标准物质；

2）商品六味地黄丸样品的处理：取商品六味地黄丸1～2.5g，置具塞锥形瓶中，加甲醇30～40mL，超声提取25～40分钟，滤过，滤液蒸至5～9mL，转移至10～25mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得供试液；

3）检测：采用高效液相色谱仪；

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为 0.05%磷酸水；

梯度洗脱：0-30 min，流动相B的配比由95%至80%；

30-80 min，流动相B的配比由80%至30%；

80-85 min，流动相B的配比由30%至95%；

柱温：35℃；

流速1 mL/min；

检测波长：237 nm；

进样量：10～20μL；

其中，所述的六味地黄丸对照中成药提取液为：每毫升提取液中含有：16.71～66.82μg 5-羟甲基糠醛、30.56～122.22μg 莫诺苷、19.52～78.06μg 马钱苷、12.71～50.84 μg 芍药苷和40.27～161.06 μg 丹皮酚；

所述的六味地黄丸对照中成药提取液的制备方法如下：

1）六味地黄丸对照中成药的制备：取熟地黄160份、酒萸肉80份、牡丹皮60份、山药80份、茯苓60份和泽泻60份，粉碎成细粉，混匀；每100g粉末加炼蜜35～50g与适量的水，制得六味地黄丸对照中成药；或每100g粉末加炼蜜80～110g制成六味地黄丸对照中成药；

2）六味地黄丸对照中成药提取液的制备：取六味地黄丸对照中成药15～30g，置具塞锥形瓶中，加甲醇200～400mL，超声提取25～40分钟，滤过，滤液加在中性氧化铝柱上，用100～200mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸至50～90mL，转移至100～200mL量瓶中，加甲醇至刻度，用微孔滤膜过滤至安瓶中，充氮气，熔封。