CN109085285B

CN109085285B - 一种肠炎宁颗粒的质量控制方法

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Publication number: CN109085285B
Application number: CN201811190497.2A
Authority: CN
Inventors: 刘景萍; 刘全国; 陈克领; 林果
Original assignee: Hainan Huluwa Pharmaceutical Group Co ltd
Current assignee: Hainan Huluwa Pharmaceutical Group Co ltd
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: CN109085285A

Abstract

本发明属于医药质量检测技术领域，具体公开了一种肠炎宁颗粒的质量控制方法，采用薄层色谱法对肠炎宁颗粒中地锦草进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定肠炎宁颗粒中的地锦草、金毛耳草、枫香树叶的活性成分没食子酸的含量进行定量控制。本发明方法简单、分离度好、专属性强、重现性好、含量高，有效的保障了肠炎宁颗粒的质量和疗效，具有很强的实用性。

Description

一种肠炎宁颗粒的质量控制方法

技术领域

本发明属于医药质量检测技术领域，具体涉及一种肠炎宁颗粒的质量控制方法。

背景技术

肠炎宁颗粒的组方为：地锦草、黄毛耳草、樟树根、香薷、枫树叶，具有清热利湿、行气的功能，用于急慢性胃肠炎，腹泻，细菌性痢疾，小儿消化不良，肠炎宁相关制剂还包括组方与肠炎宁颗粒一致的肠炎宁糖浆，肠炎宁糖浆的质量控制方法在2015版中国药典一部中有记载，具体为：

(1)地锦草的鉴别：取本品15ml，加水30ml，摇匀，用乙醚振摇提取3次，每次30ml，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液；另取地锦草对照药材2g，加水煎煮1小时，滤过，滤液浓缩至约30ml，同法制成对照药材溶液；照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(5:5:0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铁试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点。

(2)没食子酸的含量测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.5％磷酸溶液(10:90)为流动相，控制波长为270nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于2500；对照品溶液的制备：取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含20μg的溶液，即得；供试品溶液的制备：精密吸取本品2ml，置100ml量瓶中加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注人液相色谱仪，测定，即得。本品每lml含地锦草和金毛耳草以没食子酸(C₇H₆O₅)计，不得少于1.3mg。

但上述质量控制方法并不适用于肠炎宁颗粒，这是由于肠炎宁颗粒与肠炎宁糖浆为不同的剂型，在制法上有较大差别，需要按照不同的标准进行质量控制，对肠炎宁颗粒参考上述方法对地锦草进行鉴别，阴性有干扰，结果不稳定；对没食子酸含量进行测定，同样是阴性有干扰，含量偏低。

而肠炎宁颗粒目前并未纳入2015版中国药典，现有的肠炎宁颗粒鉴别项仅对其水溶液进行了荧光鉴别、使用醋酸铅产生沉淀、三氯化铁显色法以及利用东莨菪内酯为对照进行鉴别金毛耳草，其鉴别方法较简单，准确性差，难以保证肠炎宁颗粒的质量；此外，现有的肠炎宁颗粒仅仅采用分光光度法测定含量，选择总黄酮以芦丁计作为含量测定指标，而分光光度法专属性不强、控制结果不够准确，同样难以保证肠炎宁颗粒的质量。

而肠炎宁颗粒剂具有服用、携带、贮藏、运输方便，载药量较大的优点，值得进一步提高质量标准，提高产品质量可控性，因此，本发明对现有的质量控制方法进行了改进，可以排除干扰，使得到的结果准确。

发明内容

本发明提供了一种简单、专属性强且重复性好肠炎宁颗粒的质量控制方法，为肠炎宁颗粒的质量可靠提供了保障。

一种肠炎宁颗粒的质量控制方法，包括：采用薄层色谱法对肠炎宁颗粒中的地锦草进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对肠炎宁颗粒中的活性成分没食子酸进行定量鉴别；

所述地锦草的薄层色谱法条件为：以地锦草为对照药材，以体积比为8:8:0.2的环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，以10％的硫酸乙醇溶液为显色剂；

所述没食子酸的高效液相色谱法条件为：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈为流动相A、以0.3％的磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，控制波长为270nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于4000。

本发明先对处方中药材进行了细致的研究，考察了多种方法提取，采用多种展开系统展开，樟树根特征斑点均不明显，研究结果不甚理想，薄层鉴别重复性差；香薷均有较好的特征斑点，但多次试验发现其方法受干扰因素较多、稳定性、重复性差；枫香树叶也有较好的特征斑点，但均不能排除干扰。

但是实验发现：处方中地锦草和金毛耳草的薄层色谱鉴别斑点清晰，重现性好，阴性无干扰，故本发明对肠炎宁颗粒中的地锦草和金毛耳草利用薄层色谱法进行了定性鉴别。

而肠炎宁颗粒中地锦草、金毛耳草、枫香树叶三种药材都含有活性成分没食子酸，没食子酸又名五倍子酸，是一种多酚类化合物，大量研究证实其具有较为肯定的抗肿瘤、杀锥虫、抗炎、抑菌、抗病毒等作用，故将其作为本品含量测定的指标性成分。

为了有效控制药品质量，建立科学的质量控制方法，对地锦草、金毛耳草和枫叶树叶3味药材中的没食子酸进行定量控制，通过实验研究建立地锦草薄层鉴别项，分别对地锦草和金毛耳草进行的定性鉴别。

所述梯度洗脱的具体条件为：0～30min时流动相B的体积比为100％，＞30min～41min时流动相A的体积比为25％、流动相B的体积比为75％，＞41～60min时流动相B的体积比为100％。

本品为多种药材的组合处方，含有非常丰富的化学物质，若采用等度洗脱可能需要比较长的运行时间才能洗脱所有的化合物，而梯度洗脱方法则可避免，同时可缩短样品的洗脱时间。

所述地锦草的薄层色谱法鉴别的步骤包括：

(1)取肠炎宁颗粒3g，加水30ml，摇匀，用乙醚振摇提取1次，用量20ml，分取乙醚液，自然挥干，残渣加甲醇l ml使溶解，作为供试品溶液；

(2)取地锦草对照药材2g，加水150ml煎煮1h，滤过，滤液蒸干，加水10ml使溶解，同法制成对照药材溶液；

(3)照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，在体积比为8:8:0.2的环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸中展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液。

所述肠炎宁颗粒的质量控制方法还包括采用薄层色谱法对其中的金毛耳草进行定性鉴别，具体方法包括以下步骤：

(1)取肠炎宁颗粒1g，加甲醇5ml，超声处理10min，滤过，滤液作为供试品溶液；另取东莨菪内酯对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg东莨菪内酯的对照品溶液；

(2)吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10:8:1的三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm的紫外灯下检视。

采用薄层色谱法对肠炎宁颗粒中的地锦草和金毛耳草进行定性鉴别，所述供试品溶液的色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

所述肠炎宁颗粒的质量控制方法还包括：采用紫外-可见分光光度法对肠炎宁颗粒中的芦丁进行定量鉴别。

所述没食子酸的高效液相色谱鉴别方法包括：

(1)取没食子酸对照品10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀即得没食子酸对照品溶液；

(2)取装量差异下的肠炎宁颗粒，研细，精密称定0.1g，置25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声20min，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)吸取上述没食子酸对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定。

采用高效液相色谱法对肠炎宁颗粒中的没食子酸和芦丁进行定量鉴别，所述肠炎宁颗粒每2g含地锦草、金毛耳草、枫香树叶以没食子酸计，不得少于13mg；所述肠炎宁颗粒每2g含黄酮以芦丁计，不得少于50mg。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明利用改进过的薄层色谱法对肠炎宁喘颗粒中地锦草进行定性鉴别，得到的薄层色谱鉴别斑点清晰，阴性无干扰，结果较为满意且重复性、稳定性良好；

(2)本发明利用高效液相色谱法测定肠炎宁颗粒中没食子酸的含量，该方法具有分离效率高，选择性好，控制灵敏度高，操作自动化等优点，保证了本品的质量稳定均一性及疗效；

(3)本发明采用了薄层色谱法对肠炎宁颗粒中的地锦草和金毛耳草进行定性鉴别，同时还采用高效液相色谱法对肠炎宁颗粒中的没食子酸和芦丁进行定量鉴别，各部分鉴别方法相互配合，极大的保障了肠炎宁颗粒的质量和疗效，且方法简单、专属性强、重现性好，具有很强的实用性。

附图说明

图1为实施例1中地锦草的薄层色谱图，从左到右依次是：阴性对照品、供试品、对照药材；

图2为实施例1中没食子酸阴性供试品的高效液相色谱图；

图3为实施例1中没食子酸供试品的高效液相色谱图；

图4为实施例1中没食子酸对照品的高效液相色谱图；

具体实施方式

DIONEX UltiMate3000高效液相色谱仪，包括LPG-3400SD低压四元泵、WPS-3000RS自动进样器、VWD-3100单波长紫外控制器、TCC-3000RS柱温箱、戴安色谱工作站。

所用乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，溶液均用0.45μm滤膜滤过；对照品没食子酸以及对照药材地锦草均购自中国食品药品检定研究院。

实施例1

1、按照中国专利CN101664464A实施例1中所述肠炎宁颗粒的处方及制法，制得1002袋2g/袋分装的肠炎宁颗粒。

2、所述肠炎宁颗粒的薄层色谱鉴别方法

(1)地锦草的薄层色谱鉴别

称取3g肠炎宁颗粒，加水30ml，摇匀，用乙醚振摇提取1次，用量20ml，分取乙醚液，自然挥干，残渣加甲醇l ml使溶解，作为供试品溶液；称取3g研细后的地锦草阴性样品，同法制得阴性对照溶液；称取地锦草对照药材2g，加水150ml煎煮1小时，滤过，滤液蒸干，加水10ml使溶解，同法制成对照药材溶液；

按照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8:8:0.2)为展开剂，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在日光灯下检视。

鉴别结果如图1所示，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显示出了相同颜色的斑点；在阴性对照色谱中与对照药材色谱相应位置上，无相同颜色的斑点。

采用本发明特定的薄层色谱鉴别条件对肠炎宁颗粒中的地锦草进行定性鉴别，鉴别方法简单、可操作性强，鉴别结果准确、专属性强。

(2)金毛耳草的薄层色谱鉴别

取本品1g，加甲醇5ml，超声处理10min，滤过，滤液作为供试品溶液；另取东莨菪内酯对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg东莨菪内酯的对照品溶液；

吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸(10:8:1)为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm的紫外灯下检视，在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显示出了相同颜色的斑点。

3、所述肠炎宁颗粒含量的鉴别方法

(1)紫外-可见分光光度法控制芦丁含量

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，置50ml量瓶中，加50％甲醇制成每1ml中含0.2mg的溶液，即得。

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1ml、2mL、3ml、4ml、5ml，分别置10ml量瓶中，加50％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀；

精密量取50％甲醇溶液5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀得到空白溶液；

按照紫外-可见分光光度法，在510nm的波长处测定溶液吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

测定法：取装量差异项下的本品内容物研细，取0.5g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，置20ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，作为空白对照；

另精密量取1ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇至5ml，加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，再加10％硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液4ml，再加50％甲醇至刻度，摇匀，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中以芦丁计的总黄酮的量，计算，取得。

本品每袋含总黄酮以芦丁(C₂₇H₃₀O₁₆)计，得到本品每袋含芦丁80mg。

(2)高效液相法(HPLC)测定没食子酸含量

称取没食子酸对照品约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀即得没食子酸对照品溶液；

取装量差异下的本品内容物，研细，精密称定0.1g，置25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声20min(53KHz，250W)，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；按本品处方制法，制得缺味地锦草、金毛耳草和枫香树叶的阴性颗粒，同法制备得到阴性供试品溶液；

吸取没食子酸对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪进行测定，其中高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.3％磷酸溶液为流动相B，按下表1中的规定进行梯度洗脱，体积流量1.0ml/min，柱温30℃；控制波长为270nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于4000。

表1

控制得到的没食子酸对照品溶液、供试品溶液、阴性供试品溶液色谱图分别如图2～4所示，其峰形好看，没有出现拖尾现象，测定得到本品每袋含没食子酸19mg。

4、HPLC方法学考察

(1)专属性考察

在该色谱条件下，对照品溶液中没食子酸的色谱峰峰形良好；供试品溶液中没食子酸相应保留时间处的色谱峰峰形良好，没食子酸色谱峰与杂质峰的分离度大于1.5；阴性供试品溶液中在没食子酸色谱峰相应保留时间处无色谱峰出现，该色谱条件专属性良好。

(2)线性试验考察

精密称定没食子酸对照品20.71mg(含量为90.80％)，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，再量取适量此溶液，加甲醇稀释制成不同浓度的对照品溶液，摇匀，滤过，取续滤液10μl注入液相色谱仪。以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析。

结果表明，没食子酸对照品在15.04μg/ml～75.22μg/ml进样量范围内，与峰面积呈良好的线性关系(R²＝0.9998)。

(3)仪器精密度

用线性试验溶液的中间浓度样品，连续进样6次，得到的仪器精密度试验结果见下表2，由表2可知，不同仪器峰面积的相对标准差均小于2.0％，符合规定。

表2

(4)样品重复性试验

取6份样品，计算6份样品的没食子酸含量(mg/g)相对标准偏差，重复性试验结果见下表3，由表可知，本品的重复性符合要求。

表3

(5)溶液稳定性试验

供试品溶液室温下放置24h，分别于第0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时后进样，测定其峰面积，考察溶液的稳定性，溶液的稳定性试验结果见下表4，由表4可知，本品的重复性符合要求。

表4

(6)加样回收试验

取本品，按80％、100％和l20％分别制备三个浓度，每个浓度各制备三份样品，在9份样品中分别加入等比例的本品对照品，照上法分别制备9份供试品溶液，进行加样回收试验。精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。

结果显示：在80％～120％的浓度范围内，回收率为92.71％～94.36％，RSD为0.43％～2.47％，符合要求。

对比例1

(1)地锦草的薄层色谱鉴别

按照实施例1中所述的地锦草的薄层色谱鉴别方法对实施例1制得的肠炎宁颗粒进行鉴别，区别在于对比例1以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(5:5:0.5)为展开剂并喷以三氯化铁试液。

鉴别结果表明：供试品色谱中，阴性有干扰，结果不稳定。

(2)没食子酸的含量测定

按照实施例1中所述的高效液相控制没食子酸含量的方法对实施例1制得的肠炎宁颗粒进行测定，区别在于对比例1的高效液相色谱条件为：以甲醇-0.5％磷酸溶液(10:90)为流动相，理论板数按没食子酸峰计算应不低于2500。

鉴别结果表明：所得到的峰形不佳，出现拖尾现象，阴性有干扰，鉴别结果不准确。

对比例2

(1)地锦草的薄层色谱鉴别

按照实施例1中所述的地锦草的薄层色谱鉴别方法对实施例1制得的肠炎宁颗粒进行鉴别，区别在于对比例2以环己烷-乙酸乙酯(4:1)为展开剂并喷以三氯化铁试液。

鉴别结果表明：供试品色谱中，阴性有干扰，结果不稳定。

(2)没食子酸的含量测定

按照实施例1中所述的高效液相控制没食子酸含量的方法对实施例1制得的肠炎宁颗粒进行测定，区别在于对比例2的高效液相色谱条件为：以乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，理论板数按没食子酸峰计算应不低于2500。

鉴别结果表明：所得到的峰形不佳，出现拖尾现象，鉴别结果不准确。

Claims

1.一种肠炎宁颗粒的质量控制方法，其特征在于，采用薄层色谱法对肠炎宁颗粒中的地锦草和金毛耳草进行定性鉴别，采用高效液相色谱法对肠炎宁颗粒中的活性成分没食子酸进行定量鉴别，采用紫外-可见分光光度法对肠炎宁颗粒中的芦丁进行定量鉴别；

所述地锦草的薄层色谱法条件为：以地锦草为对照药材，以体积比为8:8:0.2的环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，以10%的硫酸乙醇溶液为显色剂；

所述金毛耳草的薄层色谱法鉴别的步骤包括：（1）取肠炎宁颗粒1g，加甲醇5ml，超声处理10min，滤过，滤液作为供试品溶液；另取东莨菪内酯对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg东莨菪内酯的对照品溶液；

（2）吸取供试品溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为10:8: 1的三氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，在365nm的紫外灯下检视；

所述没食子酸的高效液相色谱法条件为：采用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以乙腈为流动相A、以0.3%的磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱，控制波长为270nm，理论板数按没食子酸峰计算应不低于4000；所述梯度洗脱的具体条件为：0~30min时流动相B的体积比为100%，31min ~41min时流动相A的体积比为25%、流动相B的体积比为75%，42min~60min时流动相B的体积比为100%；

所述肠炎宁颗粒每2g含总黄酮以芦丁计，不得少于50mg；所述肠炎宁颗粒每2g含地锦草、金毛耳草、枫香树叶以没食子酸计，不得少于13mg。

2.根据权利要求1所述的肠炎宁颗粒的质量控制方法，其特征在于，所述地锦草的薄层色谱法鉴别的步骤包括：

（1）取肠炎宁颗粒3g，加水30ml，摇匀，用乙醚振摇提取1次，用量20ml，分取乙醚液，自然挥干，残渣加甲醇l ml使溶解，作为供试品溶液；

（2）取地锦草对照药材2g，加水150ml煎煮1h，滤过，滤液蒸干，加水10ml使溶解，同法制成对照药材溶液；

（3）照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，在体积比为8:8:0.2的环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸中展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液。

3.根据权利要求1所述的肠炎宁颗粒的质量控制方法，其特征在于，在所述金毛耳草的薄层色谱法鉴别的步骤（2）中，所述供试品溶液的色谱中，在与对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

4.根据权利要求2所述的肠炎宁颗粒的质量控制方法，其特征在于，在所述地锦草的薄层色谱法鉴别的步骤（3）中，所述供试品溶液的色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

5.根据权利要求1所述的肠炎宁颗粒的质量控制方法，其特征在于，所述没食子酸的高效液相色谱鉴别方法包括：

（1）取没食子酸对照品10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度线，摇匀，再精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀即得没食子酸对照品溶液；

（2）取装量差异下的肠炎宁颗粒，研细，精密称定0.1g，置25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声20min，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

（3）吸取上述没食子酸对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定。