CN101007030A - 一种山香圆叶及其制剂的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及山香圆叶及其制剂的质量控制方法，提供了一种以没食子酸、芹菜素－7－O－新橙皮糖苷、芹菜素－7－O－ 2′－鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷及芹菜素等成分为指标的质量控制方法，包括山香圆叶及含山香圆叶制剂的指纹图谱质量控制方法，与现有的质量控制技术相比，可以更综合评价山香圆叶药材及其制剂的质量，能更好保证制剂的安全有效，具有非常显著的意义。
Description
技术领域
本发明涉及山香圆叶及其制剂的质量控制方法，尤其是以山香圆叶及其制剂中没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素为检测指标的定性和定量质量控制方法。
背景技术
山香圆叶为省沽油科植物山香圆Turpinia arguta Seem.或Turpinia indochinensis的新鲜或干燥叶，具有清热泄火，利咽消肿的功效，到目前为止，研究文献确切报道的其化学成分主要有2α-羟基熊果酸、2α、19α-二羟基熊果酸、19α-羟基熊果酸、2α-过氧羟基熊果酸、熊果酸、α-香树脂醇、肉豆蔻酸、胡萝卜苷等(方乍浦，等，山香圆叶化学成分的研究，中草药，1987.18(7)：6)，多为小极性部分。已上市的山香圆叶制剂(如山香圆颗粒、山香圆片等)多采用以山香圆叶对照药材薄层色谱鉴别的质量控制方法，研究文献有对其熊果酸含量测定和薄层色谱鉴别及以芦丁为对照的分光光度法测定总黄酮含量(毛友昌等，薄层扫描法测定山香圆叶中熊果酸的含量，1997，17(3)：7；罗宪堂等，UV法测定山香圆叶中黄酮类成分含量，中医药研究，2002，18(5)：48)，但上述方法均难以综合反应和控制药材及制剂质量，且这些已上市的制剂中，提取工艺为水提或稀乙醇醇沉提取工艺，熊果酸等脂溶性成分提取率很低。
所以建立一个能综合反应药材及制剂质量的质量控制方法，具有很重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于建立一种山香圆叶及其制剂的质量控制方法，该方法可综合反应和控制药材及制剂的质量。
对山香圆叶药材进行系统的化学成分研究，分离并鉴定山香圆叶中含有没食子酸、邻苯三酚、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、香草酸、对羟基肉桂酸、α-呋喃甲酸等成分。
本发明的质量控制方法含以没食子酸、邻苯三酚、芹菜素-7-0-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、香草酸、对羟基肉桂酸、α-呋喃甲酸等成分为指标的质量控制方法，方法包括定性及定量方法，如薄层色谱(TLC)鉴别方法，紫外分光光度鉴别法，高效液相(HPLC)含量测定方法，指纹图谱质量控制方法等，优选HPLC法，可以选用紫外型检测器，也可以为蒸发光散射检测器，或HPLC-MS连用检测等方法，具体以达到上述成分良好的分离和测定为宜，比较简便可行的方法可以为HPLC法，选用紫外型检测器或蒸发光散射检测器。
综合山香圆叶及其制剂的各成分含量及成分的药理活性，优选以没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素等为指标的质量控制方法，其中以芹菜素为指标的质量控制方法，含芹菜素的苷(如芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷)水解成为苷元芹菜素的质量控制方法，水解可以为酸水解或酶水解，如供试样品的乙醇溶液，加等体积2mol/L盐酸溶液，在N2环境中加热水解得芹菜素苷元；或供试样品的pH5.0乙酸盐缓冲液，加入β-葡萄糖苷酶或苦杏仁酶，37℃放置，水解得到芹菜素苷元。
文献表明没食子酸具有抗炎、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗病毒、肝脏保护和抗乙肝病毒等的药理活性，而芹菜素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗血栓抗动脉硬化、抗焦虑等多方面作用，其抗炎、抗氧化、抗病毒作用均与山香圆叶及其制剂(如山香圆片、山香圆颗粒)的功能主治相关，可见以没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素作为质量控制指标，具有更好的合理性。
本发明是可以通过以下方式实现，包括但不仅限于：
一、供试品溶液的制备方法：可以用甲醇，乙醇、丙酮等极性溶剂直接提取的方法，溶剂也可以用它们的水溶液，提取方法可以为超声、回流、静置浸泡等，也可以用水提取液(或浓缩液)直接用乙酸乙酯、正丁醇萃取提取的方法，由于被测指标为均为有机酚酸类，萃取的水溶液要求在酸性条件下，如用酸调节pH在4.5以下，乙酸乙酯、正丁醇萃取液继续回收溶剂，残渣加甲醇溶解即得。具体的提取方法根据具体情况及剂型而不同，如对于液体制剂，调节pH到4，用适量正丁醇直接振摇提取更为简单方便，而对于药材及固体制剂，可以采用水提取(冷浸或回流等)成水提取液，然后采用液体制剂相同的方法制备，而更简单方便为溶剂直接提取，如采用甲醇、乙醇、丙酮、及含水溶剂提取(回流、冷浸等)的方法，为尽量富集有效成分并减少杂质干扰，一个更优化的方法为：取药材或制剂粉末适量，置索氏提取器中，加石油醚适量，回流提取1小时，弃去石油醚提取液，并挥去药材或制剂粉末的剩余石油醚，加甲醇，回流提取1小时，取甲醇提取液，浓缩，即得。或碱溶液提取，如0.01％～0.1％的氢氧化钠溶液、0.5％碳酸钠溶液浸泡提取，提取液用稀盐酸调节pH值至4，然后用乙酸乙酯或正丁醇振摇萃取；或采用大孔吸附树脂或聚酰胺柱精制，即药材或制剂提取水溶液(或酸水溶液)，缓缓通过大孔吸附树脂或聚酰胺柱，用水洗脱，弃去水洗脱液，继续用醇水溶液洗脱，也可以为其它极性溶剂的水溶液洗脱，如丙酮的水溶液，比较经济为醇水溶液，醇水溶液浓度根据不同的大孔吸附树脂或聚酰胺柱有所不同，一般可以为20％～90％的乙醇溶液，以上述指标成分洗脱完全为宜，收集洗脱液，回收溶剂，残渣加甲醇溶解，即得。
上述所述的供试品溶液制备具体操作方法，举例如下，所述例子只是更直观地说明供试品的制备方法，包括但不仅限于：
1、山香圆叶粉末1g或制剂适量(约相当于药材1g)，加石油醚索氏提取1小时，弃去石油醚，残渣挥去石油醚，加甲醇适量，回流提取1小时，取甲醇液，浓缩至2ml，即得。石油醚也可以用氯仿、乙醚等小极性、非极性溶剂代替。
2、山香圆叶粉末1g或制剂适量(约相当于药材1g)，加水30ml，回流煎煮1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至10ml，稀盐酸调节pH值至3～4，水饱和正丁醇萃取2～6次，每次10ml，合并正丁醇液，回收，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
3、山香圆叶粉末1g或制剂适量(约相当于药材1g)，加稀乙醇30ml，超声提取30分钟，滤过，滤液回收乙醇，残渣加甲醇2ml使溶解。
4、如3所述的稀乙醇提取液，浓缩，残渣加水5ml使溶解，稀盐酸调节pH值至3～4，水饱和乙酸乙酯萃取2～6次，每次10ml，合并乙酸乙酯液，回收，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
5、山香圆叶粉末1g或制剂适量(约相当于药材1g)，加0.05％氢氧化钠溶液30ml静置过夜，滤过，稀盐酸调节pH至3～4，浓缩至10ml，水饱和正丁醇萃取2～6次，每次10ml，合并正丁醇液，回收，残渣加甲醇1ml使溶解，即得。
6、山香圆叶粉末1g或制剂适量(约相当于药材1g)，加甲醇超声提取30分钟，滤过，即得。
7、如2得到的水提取浓缩液，与苯乙烯型大孔树脂拌匀，加入苯乙烯型大孔树脂柱(Φ2.5×12)，水洗脱除去杂质，60％乙醇洗脱并收集合并洗脱液，浓缩，残渣加甲醇2ml使溶解。苯乙烯型大孔树脂如D101型大孔吸附树脂，AB-8型大孔吸附树脂等。
8、如7，苯乙烯型大孔树脂换为聚酰胺。
9、如1所述的供试品乙醇溶液，加等体积2mol/L盐酸溶液，在充N2环境中加热回流3小时，减压回收乙醇，用水饱和乙酸乙酯或正丁醇萃取2～6次，每次10ml，合并乙酸乙酯或正丁醇液，回收，残渣加甲醇2ml使溶解，即得。
二、没食子酸定性鉴别：以没食子酸为定性质量控制指标，可以为TLC鉴别方法，HPLC鉴别方法等，以能达到良好分离并鉴别出没食子酸为宜。方法包括但不仅限于：
1、取供试品溶液、没食子酸对照品溶液(取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。)各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以36％醋酸为展开剂，展开，取出，凉干，喷以0.5％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
2、取供试品溶液、没食子酸对照品溶液(取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。)各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(3∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以三氯化铁试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
3、取供试品溶液、没食子酸对照品溶液(取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。)各2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)为展开剂，展开，取出，凉干，在紫外254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
上述方法中，达到相同鉴别目的展开剂可以不同，如1展开剂可以为稀乙醇、95％乙醇等，2展开剂可以为甲苯-乙酸乙酯-甲酸(6∶3∶1)、氯仿-乙酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)等，3展开剂可以为石油醚(60 90)℃-乙酸乙酯-冰醋酸-浓盐酸(35∶10∶5∶0.1)等。
4、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素的鉴别方法：
芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素均为黄酮类化合物，鉴别方法条件可以为卫生部药品标准11册山香圆片(WS3-B-2085-96)或卫生部药品17册山香圆颗粒(WS3-B-3139-98)项下鉴别方法。供试品溶液优选上述供试品溶液制备方法7、8的溶液，也可以将供试品进一步水解，使芹菜素-7-O新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷水解成苷元芹菜素。另取芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-Oβ-D-葡萄糖苷及(或)芹菜素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各2靗，分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。或取上述供试品溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5.3∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
三、定量测定方法
1、没食子酸
定量测定方法优选HPLC法，当然也可以用其它可行的定量测定方法，如定性鉴别项下1的色谱斑点在λ＝615nm进行TLC扫描测定，或2项下在λ＝530进行TLC扫描测定，或3项下λR＝370nm，λS＝280进行TLC扫描测定；或高效毛细管电泳法(祝馨怡，等.高效毛细管电泳法测定红景天中没食子酸的含量，中草药，2005(3)：443)；流动注射化学发光法(谢强，等.流动注射化学发光法测定没食子酸，分析试验室，2005(4)：70)等；TLC扫描法操作繁琐，受影响因素较多，精密度和稳定性不如HPLC法好，优选HPLC法进行没食子酸的含量测定。
波长选择：取没食子酸适量，加甲醇溶解，于200～400nm扫描测定，可见在216nm、269nm左右均有最大吸收，理论上只要有吸收就可以作为其检测波长，检测波长在远紫外区(＜220nm)时，由于很多杂质也有吸收而可能杂质测定，所以优选近紫外区，又由于芹菜素-7-O-新橙皮糖苷在269nm附近也有最大吸收，所以可选择检测波长269nm。也可以选择蒸发光散射检测器。
流动相：可以为有机溶剂-水、(有机溶剂-酸水)-酸水系统，包括但不仅限于甲醇-水(或酸水)、乙腈-水(或酸水)、甲醇-乙腈-水(或酸水)、甲醇-四氢呋喃-水(或酸水)等系统，其种类及其配比以能使供试品中没食子酸达到良好分离检测效果为宜，所述的酸水指pH值小于正常水的pH的水，如磷酸、冰醋酸的水溶液，也可以为缓冲液、酸和碱的混合液等，如含0.1％三乙胺的0.1％磷酸水溶液，优选有机溶剂-酸水系统，如乙腈-0.1％磷酸溶液、甲醇-0.05％磷酸溶液、甲醇-0.2％冰醋酸溶液等。流动相配比如甲醇--0.05％磷酸溶液(5∶95)、乙腈-0.05％磷酸溶液(4∶95)，均可以达到良好的检测效果。
检测柱温可以为室温，较优选温度25℃-35℃。
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂或苯基键合硅胶为填充剂等。
色谱条件可以为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸溶液(4∶96)为流动相；检测波长：269nm，柱温：30℃。
供试品溶液可以直接为上述供试品溶液的制备方法所得或用相同溶剂稀释后得到的供试品溶液，优选供试品溶液制备方法为方法1、2、4、7、8，方法2、4正丁醇或乙酸乙酯溶剂萃取次数以4～6次较好，对于最后的供试品溶液的溶解溶剂，可以为提取溶剂，优选用流动相溶剂。
没食子酸对照品溶液的制备：取没食子酸对照品，加流动相制成每1ml含50μg的溶液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述方法只是更好地说明具体检测方法，实际测定不受上述列举方法限制，以可以达到良好分离和检测为宜。
2、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷及芹菜素
芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O- 2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷及芹菜素的测定方法很多，可以为TLC扫描法，毛细管区带电泳法(王月伶，等.毛细管区带电泳法测定芹菜素木犀草素和异槲皮甙，理化检验：化学分册，2005(8)：544)、流动注射化学发光法(刘泽敏，等.流动注射化学发光法测定芹菜素，西南师范大学学报：自然科学版，2006(3)：89)、HPLC法等，优选采用HPLC法测定。
波长选择：取芹菜素-7-O-新橙皮糖苷适量，加甲醇溶解，于200～400nm扫描测定，可见在214nm、268nm、334nm左右均有最大吸收，理论上只要有吸收就可以作为其检测波长，检测波长在远紫外区(＜220nm)时，由于很多杂质也有吸收而可能杂质测定，所以优选近紫外区，芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷与芹菜素-7-O-新橙皮糖苷具有相同的苷元-芹菜素，只是取代的糖不同，可选择检测波长269nm。
流动相：可以为上述没食子酸高效液相测定项下任一有机溶剂-水(或酸水)系统，其种类及其配比以能使供试品中芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O- 2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素达到良好分离检测效果为宜，如乙腈-0.1％磷酸溶液(15∶85)、甲醇-0.3％冰醋酸溶液(30∶70)，在一定条件下，还可以达到同时测定没食子酸的目的，见指纹图谱质量控制方法部分。
检测柱温可以为室温，较优选温度25℃-35℃。
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂或苯基键合硅胶为填充剂等。
色谱条件可以为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05％磷酸溶液(4∶96)为流动相；检测波长：269nm，柱温：30℃。
供试品溶液可以直接为上述供试品溶液的制备方法所得或用相同溶剂稀释后得到的供试品溶液，优选供试品溶液制备方法为方法1、2、4、7、8，方法2、4正丁醇或乙酸乙酯溶剂萃取次数以4-6次较好，对于最后的供试品溶液的溶解溶剂，可以为提取溶剂，优选用流动相溶剂。也可以将供试品进一步水解，使芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷等成分水解成苷元芹菜素而统一测芹菜素含量。
对照品溶液的制备：取芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素对照品，加流动相制成每1ml含50μg的溶液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述方法只是更好地说明检测方法，实际可以不受上述列举方法限制，以可以达到良好分离和检测为宜。
四、指纹图谱质量控制方法
指纹图谱是某种中药材或制剂中共有的成分在一定检测条件下所具有的明显区别特征的色谱或光谱图谱，指纹图谱可以对药材或制剂进行同时定性和定量，可以有效控制药材或制剂质量，是中药现代化关键技术之一，对有效控制药材和制剂质量，保证制剂安全、有效、质量稳定有非常重要的意义。
指纹图谱技术含以没食子酸、邻苯三酚、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素、香草酸、对羟基肉桂酸、α-呋喃甲酸等成分为指标，方法可以为TLC法、HPLC法、HPLC-MS法、毛细管区带电泳法等。
优选采用HPLC法，以没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-0-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素为对照，该方法也可以用于药材及制剂中没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素的鉴别和含量测定。
流动相：采用梯度洗脱，系统可以同上述定量测定方法，优选乙腈-酸水系统，如乙腈-0.1％磷酸溶液。
供试品溶液的制备：可以为上述供试品制备任一方法，优选的方法为供试品溶液的制备方法2、4，方法2、4正丁醇或乙酸乙酯溶剂萃取次数以4-6次较好，对于最后的供试品溶液的溶解溶剂，可以为提取溶剂，优选用流动相溶剂(初始梯度)。也可以将供试品进一步酸水解，使芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D葡萄糖苷水解成苷元芹菜素而统一测芹菜素含量。
检测波长可以为210～360nm，优选269nm；检测柱温可以为室温，较优选温度25℃～35℃。
对照品溶液的制备：取没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素对照品，分别加流动相制成每1ml含50μg的溶液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
对采自江西、湖南、福建、广东、广西等地的10批山香圆叶进行测定，并测定山香圆颗粒、山香圆片指纹图谱，参见实施例12、实施例13，表明不同产地山香圆叶指纹图谱具有较大相似性，但含量略有差别，同时表明山香圆叶指纹图谱与制剂的指纹图谱具有相似性。
比较10批不同产地山香圆叶药材、山香圆叶对照药材(1230-0301，中国药品生物制品检定所)、山香圆颗粒(江西山香药业有限公司)及山香圆片(江西山香药业有向公司)指纹图谱，可确定附图1、附图4为山香圆叶标准指纹图谱，附图7可为山香圆叶制剂的标准指纹图谱。
如实施例12、13，山香圆叶药材指纹图谱中，比较10批不同产地山香圆药材，可确定山香圆叶药材至少含6个共有色谱峰，并含没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷色谱峰，所述的6个药材共有色谱峰如附图1保留时间(min)为9.223(1，没食子酸)、46.573(2)、48.607(3)、50.573(4)、55.940(5，芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷)、61.307(6，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷)等；如附图4保留时间为5.432(1，没食子酸)、37.632(2)、40.898(3)、41.832(4)、49.765(5，芹菜素-7-O- 2′-鼠李糖基芸香糖苷)、55.698(6，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷)等。
比较山香圆颗粒及山香圆片指纹图谱，确定山香圆颗粒、山香圆片等制剂指纹图谱至少含有5个共有色谱峰，并含没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷色谱峰，所述的5个制剂共有色谱峰如附图7保留时间为5.432(1，没食子酸)、40.932(3)、41.865(4)、49.865(5，芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷)、55.765(6，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷)等。
比较山香圆叶药材和制剂的指纹图谱(如附图7、附图8)，可见制剂含有的峰，其5、6号峰(芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷)峰面积比与药材的相似，也证明这两成分相对比较稳定，其成分及配比可作为进一步的质量控制指标，而没食子酸等其他成分含量及其组分与制剂的比较产生有一定变化，原因为制剂制药过程中提取、浓缩、干燥、成型过程中化学成分产生变化，提示制药过程中要尽可能采用先进合理工艺而尽可能的保留药效成分，如低温提取(如渗漉提取)、减压浓缩、包合工艺、喷雾干燥等。
具体实施方式
以下实施例只是更具体地说明本发明，但本发明并不限于以下实施例的内容。
实施例1：山香圆叶粉末1g或制剂适量(如山香圆降糖颗粒1g、山香圆片1片或约相当于药材1g的制剂)，加石油醚索氏提取1小时，弃去石油醚，残渣挥去石油醚，加甲醇适量，回流提取1小时，取甲醇液，浓缩至2ml，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以36％醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5％三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
实施例2：山香圆叶粉末1g或制剂适量(如山香圆降糖颗粒1g山香圆片1片或约相当于药材1g的制剂)，加水30ml，回流1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至10ml，稀盐酸调节pH值至3～4，水饱和正丁醇萃取4次，每次10m1，合并正丁醇液，回收正丁醇液，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(3∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铁试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
实施例3：照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取实施例2项下供试品溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外254nm下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
实施例4：取芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取实施例2项下供试品溶液、芹菜素对照品溶液各2μl，分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例5：山香圆叶粉末1g或制剂适量(如山香圆降糖颗粒1g山香圆片1片或约相当于药材1g的制剂)，加水30ml，回流1小时，滤过，合并滤液，通过聚酰胺柱(Φ2.5×12)，5％乙醇100ml缓缓洗脱，80％乙醇150ml洗脱，收集合并洗脱液，浓缩，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取实施例2项下供试品溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5.3∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例6：照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(4∶96)为流动相；检测波长269nm。理论板数以没食子酸峰计算应不低于2000，流速1ml/min，柱温：室温。采用Agilent 1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
供试品溶液的制备取山香圆叶粉末0.5g或制剂适量(山香圆降糖颗粒0.3g、山香圆片半片或约相当于药材0.5g的制剂)，精密称定，置索氏提取器中，加氯仿适量回流1小时，弃去氯仿液，残渣挥去氯仿，加甲醇适量，回流提取1小时，取甲醇液，转移并定容至50ml量瓶中，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液。
测定法精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例7：照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1％冰醋酸(5∶95)为流动相；检测波长220nm。理论板数以没食子酸峰计算应不低于2000，流速1ml/min，柱温：30℃。采用Agilent1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
供试品溶液的制备取山香圆叶粉末0.5g或制剂适量(山香圆降糖颗粒0.3g、山香圆片半片或约相当于药材0.5g的制剂)，精密称定，加水30ml，回流1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至约10ml，稀盐酸调节pH值至3-4，水饱和正丁醇萃取6次，每次10ml，合并正丁醇液，回收，残渣加甲醇使溶解，转移并定容至50ml量瓶中，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液。
测定法精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例8：同实施例6，检测波长为220nm。
实施例9：同实施例7，检测波长为270nm。
实施例10：照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(15∶85)为流动相；检测波长270nm。理论板数以芹菜素-7-O-新橙皮糖苷峰计算应不低于2000，流速1ml/min，柱温：室温。采用Agilent1100型高效液相色谱仪，DAD检测器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
供试品溶液的制备取山香圆叶粉末0.5g或制剂适量(山香圆降糖颗粒0.3g、山香圆片半片或约相当于药材0.5g的制剂)，精密称定，加水30ml，回流1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至约10ml，稀盐酸调节pH值至3-4，水饱和正丁醇萃取6次，每次10ml，合并正丁醇液，回收，残渣加甲醇使溶解，转移并定容至50ml量瓶中，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷对照品，加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液。
测定法精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得
实施例11：除检测波长为330nm外，其他同实施例10。
实施例12：
指纹图谱：
照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B；按表1进行梯度洗脱，检测波长为270nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000，流速1ml/min，柱温：室温。采用岛津LC-10Atvp高效液相色谱仪，紫外检测器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
表1流动相梯度洗脱分配表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～30 | 5→15 | 95→85 |
| 30～70 | 15→25 | 85→75 |
供试品溶液的制备取山香圆叶粉末0.5g或制剂适量(山香圆降糖颗粒0.3g、山香圆片半片或约相当于药材0.5g的制剂)，精密称定，加水30ml，回流1小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩至约10ml，稀盐酸调节pH值至3-4，水饱和正丁醇萃取6次，每次10ml，合并正丁醇液，回收，残渣加甲醇使溶解，转移并定容至量瓶中，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备取没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含25～500μg的溶液，作为对照品溶液。
测定法精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
色谱图如附图1、附图2、附图3。
附图1为山香圆叶药材1(山香圆叶对照药材，中国药品生物制品检定所)的HPLC指纹色谱图；
附图2为没食子酸的HPLC色谱图；
附图3为芹菜素-7-O-新橙皮糖苷的HPLC色谱图。
实施例13：
指纹图谱：
照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B；按表2进行梯度洗脱，检测波长为270nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000，流速1ml/min，柱温：室温。采用岛津LC-10Atvp高效液相色谱仪，紫外检测器，Hypersil ODS柱(4.0×250mm，5μm)。
表2流动相梯度洗脱分配表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～70 | 10→25 | 90→75 |
测定法精密吸取上述实施例12项下供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
色谱图如附图4、附图5、附图6、附图7、附图8。
附图4为山香圆叶药材1(山香圆叶对照药材，中国药品生物制品检定所)的HPLC指纹色谱图；
附图5为山香圆叶药材2的HPLC指纹色谱图；
附图6为山香圆叶药材6的HPLC指纹色谱图；
附图7为山香圆颗粒(江西山香药业有限公司)的HPLC指纹色谱图。
附图8为山香圆片(江西山香药业有限公司)的HPLC指纹色谱图。
实施例14：
复方山香圆含片(见发明专利“一种防治病毒性感冒及咽喉疾病的中药组合物及其制备方法”具体实施方式实施例1，发明专利申请申请号：200610200334.9)山香圆叶的质量控制方法。
1、取本品1片，研细，加热水30ml使溶解，滤过，合并滤液，浓缩至10ml，稀盐酸调节pH值至3.6，水饱和正丁醇萃取4次，每次10ml，合并正丁醇液，回收正丁醇液，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取上述供试品溶液、对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(3∶6∶1∶1)为展开剂，展开，取出，凉干，喷以三氯化铁试液，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点。
2、取本品1片，研细，加热水30ml使溶解，放冷，滤过，通过聚酰胺柱(Φ2.5×12)，5％乙醇100ml缓缓洗脱，80％乙醇150ml洗脱，收集合并洗脱液，浓缩，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法(《中国药典》2005版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各2靗，分别点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(6∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
3、照高效液相色谱法(中国药典2005版一部附录VID)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸水溶液为流动相B；按表3进行梯度洗脱，检测波长为270nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于2000，流速1ml/min，柱温：30℃。
表3流动相梯度洗脱分配表
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～30 | 5→15 | 95→85 |
| 30～90 | 15→25 | 85→75 |
供试品溶液的制备取本品1片，研细，加热水30ml使溶解，放冷，滤过，浓缩至约10ml，稀盐酸调节pH值至3.6，水饱和正丁醇萃取6次，每次10ml，合并正丁醇液，回收，残渣加甲醇使溶解，转移并定容至量瓶中，作为供试品溶液。
对照药材溶液的制备：取山香圆叶对照药材(中国药品生物制品检定所)1g，同供试品溶液制备方法，同法制成对照药材溶液。
对照品溶液的制备取没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷对照品，分别加甲醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液。
测定法精密吸取上述供试品溶液、对照品溶液、对照药材溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，并计算没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷含量，即得。
本品指纹图谱色谱图与对照药材色谱图谱比较，至少含5个相应色谱峰，含没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷色谱峰。
用实施例14的指纹图谱质量控制方法对采自江西、湖南、福建、广东、广西等地的10批山香圆叶和山香圆颗粒、山香圆片中没食子酸(A)、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷(B)、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷(C)等成分进行含量测定，结果见表4。
表4山香圆叶及其制剂含量测定结果表
| 样品名称 | A(mg/g) | B(mg/g) | C(mg/g) |
| 江西1 | 1.87 | 2.45 | 2.05 |
| 江西2 | 2.07 | 3.31 | 1.96 |
| 江西3 | 1.60 | 2.54 | 2.18 |
| 江西4 | 1.91 | 2.90 | 1.82 |
| 江西5 | 1.56 | 1.87 | 1.73 |
| 福建1 | 1.86 | 2.36 | 1.67 |
| 福建2 | 1.59 | 2.53 | 1.94 |
| 广东 | 1.45 | 1.94 | 1.82 |
| 广西 | 1.32 | 1.76 | 1.48 |
| 湖南 | 1.72 | 2.68 | 1.65 |
| 山香圆颗粒(mg/袋) | 14.82 | 18.43 | 12.64 |
| 山香圆片(mg/片) | 0.34 | 1.31 | 2.19 |
由表4可见，不同产地、不同批号的山香圆叶三种指标成分含量有一定差别，为控制药品质量，保证安全有效，可定含量指标为：折算成山香圆叶以干品计，含没食子酸不低于0.12％，芹菜素-7-O-新橙皮糖苷不低于0.16％，芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷不低于0.12％。
Claims (10)
1.一种山香圆叶及其制剂的的质量控制方法，其特征在于含有以没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素为指标成分的质量控制方法。
2.根据权利要求1所述的山香圆叶及其制剂的的质量控制方法，其特征在于含有以没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷及芹菜素为指标成分的指纹图谱控制方法。
3.根据权利要求2所述的山香圆叶及其制剂的的指纹图谱质量控制方法，其特征在于是高效液相色谱法，采用梯度洗脱，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以有机溶剂酸水溶液为流动相；紫外检测器或蒸发光散射检测器检测。
4.根据权利要求3所述的山香圆叶及其制剂的的指纹图谱质量控制方法，其特征在于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；在0～70分钟，流动相A从10％～25％，流动相B从90％～75％；检测波长：269±1nm。供试品溶液的制备：取山香圆叶粉末1g或制剂适量(相当于山香圆叶药材1～2g)，加热水适量，振摇，超声提取45分钟，滤过，收集滤液，用稀盐酸调节pH值3～4，用水饱和正丁醇提取2～6次，合并正丁醇提取液，减压回收正丁醇，残渣加甲醇适量使溶解，作为供试品溶液。吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪器，检测，并与药材标准图谱对照，药材至少有6个相应特征峰，制剂至少有5个相应特征峰，应含没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷色谱峰。
5.根据权利要求3所述的山香圆叶的指纹图谱质量控制方法，其特征在于以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；在0～30分钟，流动相A从5％～15％，流动相B从95％～85％，在30～70分钟，流动相A从15％～25％，流动相B从85％～75％；或在0～30分钟，流动相A从5％～15％，流动相B从95％～85％，在30～90分钟，流动相A从15％～25％，流动相B从85％～75％；检测波长：269±1nm。分别吸取权利要求4项下供试品溶液10μl，注入液相色谱仪器，检测，与药材标准图谱对照，药材至少有6个相应特征峰，制剂至少有5个相应特征峰，应含没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷色谱峰。
6.根据权利要求1所述的山香圆叶及其制剂的质量控制方法，其特征在于以没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素为指标成分的定性和定量控制方法。
7.根据权利要求6所述的山香圆叶及其制剂的定量控制方法，其特征在于是高效液相色谱法。
8.根据权利要求6所述的山香圆叶及其制剂的定量控制方法，其特征在于折算成山香圆叶干品计，含没食子酸不低于0.12％、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷不低于0.16％、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷不低于0.12％。
9.根据权利要求6所述的山香圆叶及其制剂的定性质量控制方法，其特征在于以没食子酸、芹菜素-7-O-新橙皮糖苷、芹菜素-7-O-2′-鼠李糖基芸香糖苷、芹菜素为指标成分的薄层色谱鉴别法。
10.根据权利要求1～9山香圆叶及其制剂的质量控制方法，在含山香圆叶的复方制剂中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |