CN101703669A - 菝葜有效部位群及其提取纯化工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种药用植物菝葜有效部位群及其提取纯化工艺，具体涉及中药菝葜有效部位群的提取纯化方法及其提取物产品。所述提取方法包括以下步骤：a.菝葜用水提取，提取液浓缩，滤过；b.滤液通过大孔吸附树脂吸附，先用水洗脱，继用乙醇洗脱；c.收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

Description

菝葜有效部位群及其提取纯化工艺

技术领域

本发明涉及一种药用植物有效部位群的提取纯化方法，具体涉及中药菝葜有效部位群的提取纯化方法及其提取物产品。

背景技术

菝葜为百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根茎，又名金刚藤，为传统中药，《中国药典》2005年版一部收载，菝葜具有祛风利湿，解毒散瘀的功效，用于筋骨酸痛、小便淋漓、带下量多、疔疮痈肿。中医临床除用于治疗妇科炎症疾患外，还用于治疗肿瘤，并取得了很好的疗效。目前国内有多家中药企业以菝葜药材为原料制成的传统中药制剂主要有金刚藤胶囊、金刚藤糖浆、金刚藤颗粒和金刚藤片剂等剂型，临床用于治疗附件炎、慢性盆腔炎等妇科炎症，由于疗效肯定、作用显著而倍受广大医务工作者和患者欢迎，市场销售良好，其中湖北福人药业公司生产的金刚藤胶囊单品种的年销售额连续多年过亿元。但是，上述中药品种均为传统生产工艺制备，尚存在着药效物质基础不明确，质量控制标准不完善，临床疗效不稳定，临床服用剂量过大等弊端，不符合现代临床用药要求。

菝葜属的植物化学成分的研究较多，至今已从该属植物中分离得到80余种化合物，其中主要有黄酮类、甾体皂苷类、鞣质等类型化合物。药理试验研究表明，黄酮类化合物和甾体皂苷类化合物具有明显抗炎药理活性，鞣质具有显著的抗菌作用。

菝葜属植物普遍含有黄酮类化合物，现已从该属植物中分离并鉴定了20余种黄酮类化合物，这些黄酮类化合物的基本母核为：黄酮和黄酮醇类、二氢黄酮和二氢黄酮醇类、查尔酮类、儿茶素类。

迄今为止，从菝葜属植物中分离得到30多种甾体皂苷化合物。这些甾体皂苷类化合物，按皂苷元结构不同，可分为三种类型：螺甾烷醇型(spirostanols)、异螺甾烷型(isospirostanols)和呋喃甾烷醇型(furostanols)，主要是螺甾烷醇型化合物。皂苷中所含的糖主要有4种：D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖，它们以不同的方式与皂苷元结合构成种类繁多的皂苷。

目前菝葜的药效物质的提取纯化方法有水提醇沉法和乙醇提取-大孔树脂纯化法等。水提醇沉法属于传统提取工艺，其提取物的有效物质基础不明确，质量标准难以控制，临床用药量过大；乙醇提取-大孔树脂纯化法，是采用乙醇作为提取溶媒，存在提取纯化过程繁琐，生产成本较高，环境污染严重，安全隐患较大等弊端，不符合中药产业现代化要求。本发明采用水作为提取溶媒，提取液通过大孔吸附树脂纯化，得到较高含量的黄酮类、皂苷类和鞣质类有效部位群，该提取纯化技术国内外未见相关资料报道。其提取纯化工艺流程简单，有效物质含量较高，降低了生产成本，节约了能源，降低了环境污染，减少了生产中的安全隐患，符合中药产业现代化的要求。

本发明采用正交设计试验和单因素相结合的方法，对菝葜中的黄酮类、皂苷类和鞣质类成分的水提取工艺及D101大孔树脂纯化工艺进行了全面系统的研究，获得了可靠的技术参数，进行了中试验证，可过渡到产业化。其提取纯化工艺具有较强的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种菝葜有效部位群物质的提取、纯化和提取物的干燥方法。

本发明的又一目的在于提供了采用上述提取方法得到的菝葜有效部位群提取物产品。

本发明的一种菝葜有效部位群的提取纯化方法包括以下步骤：

a.菝葜用水提取，提取液浓缩，滤过；

b.滤液通过大孔吸附树脂吸附，先用水洗脱，继用乙醇洗脱；

c.收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

本发明的菝葜药材提取物的优选的提取步骤如下：

a.取菝葜饮片，加8～12倍药材量的水浸泡2～6小时，提取1～3次，每次1～3小时，合并水提取液；将水提取液浓缩至一定体积，使药液体积为5～25倍药材量，静置过滤后，得到滤液；

b.滤液以每小时1～3倍柱床体积的流速通过大孔吸附树脂柱，先用2～4倍树脂量的水洗脱除去杂质，再用2～5倍柱床体积的40～95％的乙醇以每小时1～3倍柱床体积的流速进行洗脱，得到乙醇洗脱液；

c.将乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.01～1.10，浓缩液经干燥，得到菝葜提取物产品。

提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量之和可达70％～90％。

收集干燥的提取物，密封，称重，置干燥处保存。

本发明的菝葜药材提取物的进一步优选的提取方法为：

a.取菝葜饮片，加10倍药材量的水浸泡4小时，提取三次，第一、二次分别为2小时，第三次为1小时，合并提取液；将提取液浓缩至一定体积，使药液体积为10倍药材量，静置过滤后，得到滤液；

b.滤液以每小时2倍柱床体积的流速通过大孔吸附树脂柱，然后用3倍树脂量的水洗脱，最后用3倍柱床体积的70％的乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，得到洗脱液；

c.将洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03的浓缩液；浓缩液经喷雾干燥得到菝葜有效部位群提取物产品，喷雾干燥条件为：进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为20000转/分钟。

本发明的菝葜药材提取物提取中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量之和可达72.26％。

本发明中所述的乙醇浓度是指100mL体积乙醇水溶液中含乙醇体积分数。

本发明还包括提取物的药物组合物，即总黄酮、总皂苷和总鞣质，以及本发明的提取物在制备一种抗菌消炎药物中的应用。

本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂.

本发明的药物组合物，在制备成药剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体可以是：淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素类及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、聚山梨酯80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的药物组合物，包括含0.1-99.9％重量百分比的本发明的提取物，其余为药物可接受的载体。

在使用时根据病人的情况确定用法用量，一般为每日服三次，每次1-10片/或粒。

本发明的组合物在制备抗菌消炎药物中的应用。

和现有的菝葜提取纯化技术比较，本发明具有以下优势：

1.本发明采用水作为提取溶媒，主要创新点在于用水作为提取溶媒提取菝葜药材，提取液用大孔吸附树脂纯化得到菝葜有效部位群，与水提醇沉传统提取工艺法比较，其提取物的有效物质基础明确，质量标准可控。与乙醇提取-大孔树脂纯化法比较，工艺流程简单，有效物质含量较高，降低了生产成本，节约了能源，控制了环境污染，减少了生产中的安全隐患，符合中药产业现代化的要求。

2.本发明采用D-101大孔吸附树脂技术提取纯化有效部位群，具有工艺简单，成本较低，树脂可反复使用，适合工业生产的特点。而且本发明对相应的技术参数进行了细致周密的考察，优选出最佳条件，进行了中试验证，可过渡到产业化，提高了有效物质的纯度，提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量可以达到70％～90％。

综上所述，本发明的提取方法具有成本低，工艺简单，稳定性好，提取率高，环境污染小，质量可控，适合大规模生产等特点。

附图说明：

图1菝葜有效部位群的提取纯化工艺流程图

图2菝葜样品溶液上D101大孔树脂柱吸附总黄酮的泄露曲线

图370％乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总黄酮的洗脱曲线

图470％乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总皂苷的洗脱曲线

图570％乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总鞣质的洗脱曲线

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。

实施例1菝葜有效部位群以水作溶媒的提取工艺试验

(1)水回流提取工艺试验：采用L₉(3⁴)正交试验法，以菝葜总黄酮、总皂苷和总鞣质为考察指标，确定浸泡时间、加水量(菝葜药材量的倍数)及提取时间-次数等因素的工艺参数，并采用紫外-可见分光光度法对提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量进行测定，并以总黄酮、总皂苷和总鞣质含量及干膏得率为评价指标进行比较分析。结果见表1-表7。

表1  试验因素水平表

表2  正交试验设计及结果分析

其中：权重系数：总黄酮、总皂苷各占30％，总鞣质、干膏得率各占20％。

公式为：综合评分＝总黄酮测定值/总黄酮测定最大值*30+总皂苷测定值/总皂苷测定最大值*30+总鞣质测定值/总鞣质测定最大值*20+干膏测定值/干膏测定最大值*20

表3  总黄酮量的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00  F0.01(2，2)＝99.00

表4  总皂苷量的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00  F0.01(2，2)＝99.00

表5  总鞣质量的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00  F0.01(2，2)＝99.00

表6  干膏得率的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00  F0.01(2，2)＝99.00

表7  综合评分的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00  F0.01(2，2)＝99.00

正交试验结果表明，影响因素最大的为提取时间-次数，且具有显著性差异，而浸泡时间和加水量无显著影响。结合提高生产效率和降低成本，确定最佳工艺为A₃B₃D₂，即选定的最佳工艺条件为：10倍量水浸泡4小时，提取3次，提取时间分别为2小时，2小时，1小时。

(2)验证试验：取菝葜饮片，共3份，按照优选提取工艺进行验证试验。试验结果见表8。

表8  菝葜水提取验证试验

验证结果表明优选的提取工艺稳定可行。

实施例2  菝葜有效部位群的大孔树脂纯化工艺试验

用前述优选提取条件提取得到的菝葜提取液进行如下试验：

(1)大孔树脂的筛选试验

树脂来源：D101树脂(天津市海光化工有限公司)，AB-8、HPD100树脂(河北宝沧有限责任公司)。

①不同大孔吸附树脂对样品溶液中总黄酮和总皂苷的静态饱和吸附和解吸附洗脱试验

精密称取已处理好的大孔吸附树脂1g(抽滤至不滴水为止)，置100mL磨口三角瓶中，精密加入供试品药液50mL，置振荡器上持续振摇24h，使其充分吸附后，取上层液分别测定总黄酮和总皂苷的浓度。并按下式计算树脂饱和吸附量：饱和吸附量＝[(初始浓度-吸附后浓度)×吸附液体积]/树脂量]，洗脱率＝(洗脱液浓度×洗脱液体积)/饱和吸附量×100％，结果见表9。

表9  三种树脂静态饱和吸附与解吸附测定结果

结果表明，在静态吸附和解吸附试验中，D101、AB-8、HPD100型大孔吸附树脂对样品中总黄酮、总皂苷的饱和吸附量以及洗脱量和洗脱率比较接近，对这三种树脂进行进一步的动态吸附和解吸附性能的考察。

②三种大孔树脂对样品溶液中总黄酮和总皂苷的动态饱和吸附及解吸附性能试验

精密称取已处理好的上述三种大孔吸附树脂各2g，上柱备用，分别用100mL供试品药液以1mL·min-1通过树脂柱，过柱液重复吸附一次，再用一定体积的水洗，分别测量流出液中总黄酮、总皂苷的含量，并按下式计算树脂比吸附量：比吸附量＝[(上柱液中物质的含量-下柱液中物质的含量-水洗脱液中物质的含量)/树脂量]，比洗脱量＝[洗脱液浓度×吸附液体积/树脂量]。实验结果见表10。

表10  三种大孔树脂动态筛选结果

试验结果表明：D101、HPD100两种型号大孔树脂对菝葜总黄酮、总皂苷和总鞣质的比吸附量和洗脱率均较好，两者效果差异不是很明显。由于D101型大孔树脂价格较低，且安全性较高，是目前国内药品生产行业应用最多的一种大孔树脂，故本研究选用D101型大孔树脂同时纯化菝葜总黄酮、总皂苷和总鞣质。

(2)D101大孔树脂纯化工艺试验

①吸附条件优选试验

采用正交试验方法以上样流速、药液的浓度(以样品中所含有的原药材量计)及径高比作为考察因数，应用L₉(3⁴)正交表安排试验，因素及水平安排见表11。对以下9组试验分别测定总黄酮、总皂苷、总鞣质含量，计算其比吸附量，并进行综合评价。分析结果见表12～16。

表11  因素水平表

表12  正交试验结果

注：权重系数：总黄酮、总皂苷各占35％，总鞣质占30％，

公式为：综合评分＝总黄酮比吸附量/总黄酮比吸附量最大值*35+总皂苷比吸附量/总皂苷比吸附量最大值*35+总鞣质比吸附量/总鞣质比吸附量最大值*30

表13  菝葜总黄酮比吸附量的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00

表14  菝葜总皂苷比吸附量的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00

表15  菝葜总鞣质比吸附量的方差分析

F0.1(2，2)＝9.00，F0.05(2，2)＝19.00

表16  综合评分的方差分析

F0.05(2，2)＝19.00，F0.01(2，2)＝99.00

综合评分直观分析和方差分析结果表明，各因素对各指标性成分影响的大小顺序为B＞A＞D，其中A(上样浓度)与B(吸附流速)具有显著性差异。因此优选总黄酮、总皂苷和总鞣质的最佳吸附条件为：A₂B₁D₂，即上样浓度为0.1g/mL，吸附速率为2BV/h，径高比为1∶8。

②上样量考察

取0.1g/mL样品溶液，加于20gD101树脂柱中(20mm×400mm)，以2Bv/h的流速通过。每个流份收集20mL，测定并计算流份中总黄酮的浓度，并绘制泄露曲线，结果见图2。图中可以看出当上样量为120mL(约为6倍树脂量)时，总黄酮开始泄漏，上样量为800mL时(约为40倍树脂量)达到吸附饱和状态。

③水洗条件考察

按上述最佳吸附条件进行上样吸附，上样量为120mL，再用水冲洗，每10mL下柱液为1流份，用F_eCL₃反应、Liebermann反应检识，同时测定干膏重，水洗60mL后F_eCL₃反应、Liebermann反应均呈阴性，干膏重量不再变化，结果表明，用60mL水洗(约3倍树脂量)后树脂柱上的糖类可以基本除去。

④乙醇洗脱浓度考察

另取20g树脂共五份上柱，按上述吸附条件和水洗条件进行吸附和去杂，再各用10％，30％，50％，70％，90％的乙醇90mL，以相同的流速进行洗脱，测定，计算总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量及解吸率，结果见表17、18、19。

表17  菝葜总黄酮乙醇洗脱浓度考察结果

表18  菝葜总皂苷乙醇洗脱浓度考察结果

表19  菝葜总鞣质乙醇洗脱浓度考察结果

以上试验结果表明，当乙醇浓度为50％以上时，总黄酮、总皂苷和总鞣质解吸率和含量都较高，其中90％乙醇洗脱液总皂苷解吸率最高，而70％的乙醇洗脱液中总黄酮、总鞣质含量最高，考虑到70％乙醇的解吸率和90％乙醇相差不大，而且生产成本也较低，故本试验选70％乙醇为洗脱溶剂。

⑤洗脱速率考察

按上述条件进行动态吸附，以70％乙醇为洗脱剂，分别以1，2，4倍柱体积/小时的速度洗脱，收集乙醇洗脱液，测定，计算总黄酮、总皂苷、总鞣质的含量与解吸率，结果见表20、21、22。

表20  菝葜总黄酮乙醇洗脱流速考察结果

表21  菝葜总皂苷乙醇洗脱流速考察结果

表22  菝葜总鞣质乙醇洗脱流速考察结果

结果表明：洗脱速率为1倍柱体积/小时和2倍柱体积/小时时相差不大，考虑生产效率，选用2Bv/h的洗脱流速较合理。

⑥乙醇洗脱量考察

按上述条件进行动态吸附，以70％乙醇为洗脱剂进行洗脱，定量收集流出液并测定其中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量。结果见图3，图4，图5。

结果表明：用80mL(约4倍树脂量)70％乙醇可以完全洗脱20g树脂所吸附的黄酮类成分；用90mL(约3倍树脂柱体积)70％乙醇可以完全洗脱20g树脂所吸附的皂苷类成分；用90mL(约3倍树脂柱体积)70％乙醇可以完全洗脱20g树脂所吸附的皂苷类和鞣质类成分。因此采用90mL(3倍树脂柱体积)70％乙醇以2Bv/h的流速可以使20g树脂所吸附的黄酮类、皂苷类及鞣质类成分完全洗脱。

实施例3  中试放大试验

取12Kg菝葜饮片，加10倍量水浸泡4小时，加热回流提取3次，第一、二次各2小时，第三次1小时，合并滤液，浓缩至药液体积为10倍药材量，抽滤得上样药液。

将20Kg药用级D101型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法装柱，处理后备用。

以2Bv/h的加样流速进行吸附，树脂床径高比为1∶8，吸附完毕后，用3倍树脂量的蒸馏水，以2Bv/h的流速洗脱至Molish反应为阴性，然后以3倍树脂柱体积的70％乙醇，以2Bv/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03，喷雾干燥(进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为2000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置阴凉处保存。

采用紫外-可见分光光度法测量提取物中物质的含量，计算转移率(转移率＝提取物中物质的含量/原药材中物质的含量×100％)和收膏率(收膏率＝提取物总重量/原药材总重量×100％)。

采用上述方法，取12Kg菝葜饮片，共4批，进行菝葜有效部位群提取纯化中试放大试验，结果见表23。

表23  中试试验结果

结果表明：四批提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质的含量之和可达70％以上。表明本试验研究的工艺参数可行，工艺条件经中试进一步调整后，可过渡到产业化生产。

实施例4、本发明的提取方法

本发明菝葜有效部位群提取物的制备方法：

取12Kg菝葜饮片，加10倍量水浸泡4小时，加热回流提取3次，第一、二次各2小时，第三次1小时，合并滤液，浓缩至药液体积为10倍药材量(120L)，抽滤得上样药液，备用。滤液以2Bv/h的加样流速进行吸附(树脂床径高比为1∶8)，吸附完毕后，用3倍树脂量的蒸馏水以2Bv/h的流速冲洗，然后以3倍树脂柱体积的70％乙醇，以2Bv/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03，喷雾干燥，收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置阴凉处保存。(图1所示)

Claims (10)

1.一种菝葜有效部位群提取物的制备方法，所述提取物中总黄酮、总皂苷和总鞣质成分的含量之和为70～90％，其特征在于，所述方法，经过以下步骤制备：

a.菝葜用水提取，提取液浓缩，滤过；

b.滤液通过大孔吸附树脂吸附，先用水洗脱，继用乙醇洗脱；

c.收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，即得。

2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，经过以下步骤制备：

a.取菝葜饮片，加8～12倍药材量的水浸泡2～6小时，提取1～3次，每次1～3小时，合并水提取液；将水提取液浓缩至一定体积，使药液体积为5～25倍药材量，静置过滤后，得到滤液；

b.滤液以每小时1～3倍柱床体积的流速通过大孔吸附树脂柱，先用2～4倍树脂量的水洗脱除去杂质，再用2～5倍柱床体积的40～95％的乙醇以每小时1～3倍柱床体积的流速进行洗脱，得到乙醇洗脱液；

c.将乙醇洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.01～1.10，浓缩液经干燥，得到菝葜提取物产品。

3.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，经过以下步骤制备：

a.取菝葜饮片，加10倍药材量的水浸泡4小时，提取三次，第一、二次分别为2小时，第三次为1小时，合并提取液；将提取液浓缩至一定体积，使药液体积为10倍药材量，静置过滤后，得到滤液；

b.滤液以每小时2倍柱床体积的流速通过大孔吸附树脂柱，然后用3倍树脂量的水洗脱，最后用3倍柱床体积的70％的乙醇以每小时2倍柱床体积的流速进行洗脱，得到洗脱液；

c.将洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03的浓缩液；浓缩液经喷雾干燥得到菝葜有效部位群提取物产品，喷雾干燥条件为：进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为20000转/分钟。

4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，经过以下步骤制备：

取12Kg菝葜饮片，加10倍量水浸泡4小时，加热回流提取3次，第一、二次各2小时，第三次1小时，合并滤液，浓缩至药液体积为10倍药材量(120L)，抽滤得上样药液，备用。滤液以2Bv/h的加样流速进行吸附(树脂床径高比为1∶8)，吸附完毕后，用3倍树脂量的蒸馏水以2Bv/h的流速冲洗，然后以3倍树脂柱体积的70％乙醇，以2Bv/h的流速进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.03，喷雾干燥，收集干燥提取物，密封，称重，置阴凉处保存。

5.根据权利要求1-4所述的任意一种制备方法制备得到的提取物。

6.含有权利要求5所述的提取物的药物组合物，包括含0.1-99.9％重量百分比的本发明的提取物，其余为药物可接受的载体。

7.权利要求6所述的组合物，其特征在于，是任何可药用的剂型。

8.权利要求6所述的组合物，其特征在于，在制备成药剂时加入药物可接受的载体。

9.权利要求6所述的组合物在制备抗菌消炎药物中的应用。

10.权利要求6所述的组合物，其特征在于，选自片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂.

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