CN108295114A - 丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，该方法包括步骤：提取、上样液制备和大孔吸附树脂柱谱纯化。具体方法为：取丹参茎叶粉碎过筛，加8倍量的体积浓度50％乙醇，回流提取3次，每次1h，过滤，合并滤液，得提取液；将所述提取液减压浓缩至浓度为1.0g·ml‑1，即得上样液；将所述上样液上样AB‑8型大孔吸附，用3‑4BV水除杂后，再用3BV的40％(v/v)乙醇洗脱；减压干燥至粉末或浸膏。本发明提供丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，通过大量实验筛选得到最佳的工艺，可提高丹参茎叶的经济价值，不仅具有变废为宝的环保价值，且具有很好的应用前景。

Description

丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法
技术领域
本发明属于提取工艺技术领域，具体涉及一种丹参茎叶中提取纯化酚酸类及黄酮类成分的方法。
背景技术
中药丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，其味苦，性微寒，具有活血调经、祛瘀止痛、除烦安神、凉血消痈等功效，用于胸痹心痛，热痹疼痛，痛经经闭，疮疡肿痛。以丹参为主药的复方制剂如复方丹参滴丸、复方丹参片、丹参注射液等在临床上广泛应用于心脑血管疾病的治疗。随着临床药用范围的扩大，丹参药材需求量的不断增长，采收其药用部位的同时也产生了大量的丹参茎叶等非药用部位，对其进行开发利用可减少资源浪费，提高丹参植物资源的利用效率。
丹参茎叶中主含酚酸类、黄酮类、三萜皂苷类及香豆素类成分，其中酚酸类成分是丹参茎叶与丹参药用部位相似的成分。丹酚酸类成分是一类含有酚羟基的有机酸类化合物。多数丹酚酸类成分抗氧化作用强度高于维生素C、维生素E、甘露醇，是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一，具有抗血栓、改善微循环、保肝等药理活性，对心脑血管疾病具有良好的治疗作用。黄酮类成分如异槲皮苷、芦丁等具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等药理作用。然而，目前的研究多偏重于对丹参药用部位中的化合物进行分离纯化，未对丹参茎叶中的总酚酸及黄酮类成分进行提取纯化，这使得丹参茎叶中活性成分不能得到同时利用，丹参的资源利用价值得不到充分体现。因此在现有研究基础上，系统开展丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分纯化制备方法及应用开发研究，以拓展丹参茎叶资源的利用途径，促进丹参药用生物资源的循环利用。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种从丹参茎叶获得高纯度酚酸类及黄酮类成分的提取与纯化方法，为实现丹参茎叶的资源化利用与产业化开发提供技术支撑。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案包括以下步骤：
丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，包括以下步骤：
(1)提取：取丹参茎叶药材粉碎过筛，加8-20倍量体积浓度30-90％的乙醇，提取1-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，得提取液，备用；
(2)上样液制备：将步骤(1)所得提取液，减压浓缩至浓度为0.25-1.0g/mL作为上样液；
(3)纯化：将步骤(2)所得上样液，上大孔吸附树脂，先用水洗脱除杂，然后用乙醇洗脱，得乙醇洗脱物，减压干燥至粉末或浸膏，即得总丹参茎叶酚酸及黄酮类成分。
作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，步骤(3)所述丹参茎叶与树脂用量比为0.5g/g，用3-4大孔树脂柱体积水除杂后，再用1-6大孔树脂柱体积的10-90％乙醇洗脱，减压干燥至粉末或浸膏，即得总丹参茎叶酚酸及黄酮类成分。
作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，步骤(1)提取过程中，加入的丹参茎叶药材的重量与乙醇的体积比为1：8g/mL。
作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，步骤(1)所用乙醇浓度为50％。
作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，步骤(1)提取方法为回流提取法，提取次数为3次，每次1h。
作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，将步骤(1)所得提取液，减压浓缩至浓度为1.0g/mL作为上样液。
作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，步骤(3)所述的大孔吸附树脂型号为AB-8型大孔吸附树脂。
作为优选方案，以上所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，洗脱剂乙醇的体积浓度为40％，洗脱剂的用量为3倍大孔吸附树脂柱体积。
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的提取方法可有效地提高丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取效率，降低生产成本；且本发明利用丹参植物的地上茎叶部分为原料，综合利用丹参的非药用部位，减少资源浪费，提高丹参植物利用效率。
本发明提供的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的制备及纯化方法，制备工艺设计合理，可操作性强，成本低廉且制备得到的有效部位中活性成分含量高，提高了丹参茎叶的经济价值，拓宽了其应用领域。
附图说明
图1不同洗脱溶剂对丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的洗脱率考察；
图2 AB-8型大孔树脂对丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的动态吸附曲线；
图3丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的洗脱曲线；
图4丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分测定色谱图
具体实施方式
本发明提供丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分提取工艺优选
(1)丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分提取方法的优选
取丹参茎叶样品分为若干份，适当粉碎后，称重，分别采用超声提取法、乙醇回流法、乙醇回流+水煎煮法提取。过滤，取上清液，以液相色谱法测定提取液中酚酸类及黄酮类成分含量。结果表明，乙醇回流法对指标成分的提取率最高，故选择乙醇回流法提取丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分。
(2)丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分提取单因素的优选
取丹参茎叶样品分为若干份，适当粉碎后，称重，以水及不同乙醇浓度(30％、50％、60％、70％、90％)提取，加入料液比(1:8、1:10、1:12、1:15、1:20)的提取溶剂，提取(1h、1.5h、2h、2.5h、3h)，提取1次、2次、3次、4次。过滤，取上清液，以液相色谱法测定提取液中酚酸类及黄酮类成分含量。优选因素指标结果见表1。
表1单因素分析
(3)丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分提取正交优选
以提取溶剂、料液比、提取时间、提取次数为考察因素，选取单因素优选的因素水平，通过正交试验确定最优提取方案本。以丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分总含量及浸膏得率为评价指标，运用综合加权评分法进行数据处理。设定满分为100分，其中指标成分总含量权重系数0.9，浸膏得率权重系数0.1，在此基础上进行总加权评分，以综合评分值对正交试验结果进行方差分析。综合评分＝总含量/MAX(总含量)×0.9×100+浸膏得率/MAX(浸膏得率)×0.1×100。因素水平见表2，试验结果见表3，方差分析见表4。
表2正交试验因素与水平
表3丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分提取工艺正交试验设计及结果
表4正交试验方差分析
注：f＝2，F0.05(2,2)＝19.00，F0.01(2,2)＝99.00
正交试验结果表明，以极差最小的B因素为误差项进行方差分析，各因素作用主次为提取次数(D)>提取时间(C)>乙醇浓度(A)>料液比(B)，影响指标成分提取的主要因素为提取次数(P<0.01)、乙醇浓度(P<0.05)、提取时间(P<0.05)。极差分析结果显示，料液比对提取率的影响最小且各水平间无明显差异。结合各因素的K值并考虑生产成本问题，确定丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分最佳提取工艺为A1B1C1D3，即乙醇浓度50％，料液比为1:8，提取1h，提取3次。
实施例2丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分纯化工艺优选
(1)树脂的预处理
取大孔吸附树脂适量，用2倍体积的95％乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装柱，用约5倍体积的去离子水清洗至无醇味，备用。
(2)大孔树脂型号筛选
采用静态吸附法，筛选丹参茎叶酚酸类及黄酮类成分纯化最适树脂。精密称取D-101、HDP 100、X-5、AB-8、HDP-450、S-8、NKA-9湿树脂各1.0g(抽滤至不滴水时质量)，置于50mL具塞磨口三角烧瓶中，分别加入最佳工艺丹参茎叶浓缩提取液10mL，置水平摇床振摇24h(140r·min-1)，使目标成分充分被吸附，滤过，测定滤液中黄酮类和酚酸类成分含量，计算各树脂在室温下的饱和吸附量。将经静态饱和吸附的树脂滤出，精密加入50％乙醇10mL，再次置于摇床同法振摇24h后，测定解吸液中黄酮类和酚酸类成分含量，计算各树脂的解吸率，结果见表5。
表5不同型号树脂的静态吸附量和解析率测定结果
注：饱和吸附量(mg/g干树脂)＝(吸附前溶液成分含量-吸附后溶液成分含量)/干树脂量(g)
洗脱率(％)＝洗脱液总黄酮质量浓度×吸附液体积/饱和吸附量×100％
结果表明，静态吸附及解吸效果较好的3种树脂为HDP100、X-5和AB-8，三者间无明显差异；且AB-8是比较常见的市售药用级大孔吸附树脂，成本较低，故选择AB-8型大孔吸附树脂作为本次实验纯化丹参茎叶提取液的树脂型号。
(3)洗脱剂浓度考察
取预处理好的AB-8型大孔树脂1g，共9份，分别置于50mL具塞锥形瓶中，各精密加入最佳工艺丹参茎叶浓缩提取液10mL，置水平摇床振摇24h(140r·min-1)，使其达到饱和吸附，分离树脂，吸干表面水分。对应加入体积分数为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液各10mL，同法震荡洗脱24h后滤过，测定洗脱液中黄酮类和酚酸类成分含量，结果见图1。结果表明，以酚酸类及黄酮类成分为指标时，40％，50％，60％乙醇解吸附率均较高，故选择40％乙醇为洗脱剂。
(4)上样液质量浓度考察
称取3份处理好的AB-8型树脂10g，湿法装柱，分别加入1.0g·mL-1药液5mL，0.5g·mL-1药液10mL，0.25g·mL-1药液20mL上柱，每份药液折合生药量均为5g生药，黄酮类和酚酸类含有量均为308.52mg。待完全吸附后，以3BV水除杂，40％乙醇100mL以1mL·min-1进行洗脱，收集洗脱液，分别测定洗脱液中黄酮类和酚酸类的含量。计算结果表明，不同质量浓度药液洗脱后转移率分别为90.51％、74.95％、66.50％。故选择1.0g·mL-1药液上样。
(5)最大上样量考察
取预处理好的AB-8型大孔树脂约10g(抽滤至不滴水的重量)，湿法装柱。量取上样液(0.25g·mL-1)70mL上样，以1mL·min-1流速进行动态吸附，收集过柱液，每10mL接一管，共收集7管，测定各过柱液中黄酮及酚酸的泄漏量。以5％为界限，计算泄露率，确定最大上样量并绘制泄露曲线，见图2。结果表明，第4份流出液时开始大量泄漏，同时第1份多为树脂间水分，扣去树脂间水分10mL，故确定每克树脂上样量应小于等于0.5g生药。
(6)洗脱剂用量考察
取预处理好的AB-8型大孔树脂10g，湿法装柱，量取1.0g·mL-1样品液5mL上柱，用3BV水除杂，加40％乙醇，以1mL·min-1流速进行洗脱，收集洗脱液，每一个柱体积为1份，测定各洗脱液中黄酮及酚酸的含量，计算其累积洗脱量，洗脱曲线见图3。结果表明，3BV后洗脱液中酚酸类及黄酮类成分含量均基本不再增加，故选择以3BV 40％乙醇洗脱。
实施例3
从丹参地上茎叶中制备酚酸类及黄酮类成分的方法中，它包括以下步骤：
提取过程：取丹参地上茎叶的干燥粉末50g(过40目筛)，用8倍量50％乙醇回流提取总酚酸类及黄酮类成分，乙醇回流提取3次，每次提取1h，合并滤液，浓缩蒸干溶剂，得到浸膏。
大孔吸附树脂预处理：用2倍体积的95％乙醇浸泡树脂(AB-8型)24h，使其充分溶胀，湿法装柱，将2-4倍的乙醇通过树脂层，洗至洗出液加适量的水无白色浑浊现象，用约5倍体积的去离子水清洗至无醇味，备用。
纯化过程：称取已处理好的AB-8型大孔吸附树脂130g，湿法装柱，取1.0g·mL-1丹参茎叶浓缩液50mL上柱，用3BV水洗除杂，3BV 40％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥至恒重。
实验结果：纯化后样品纯度可达到81.83％，得率29.07％。如图4所示，所得纯化物中酚酸类成分质量分数为86.07％，其中迷迭香酸、丹酚酸B分别占比35.23％、58.69％；黄酮类成分质量分数为13.93％，其中芦丁、异槲皮苷分别占比62.02％、22.68％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取：取丹参茎叶药材粉碎过筛，加8-20倍量体积浓度30-90％的乙醇，提取1-3次，每次1-3h，过滤，合并滤液，得提取液，备用；
(2)上样液制备：将步骤(1)所得提取液，减压浓缩至浓度为0.25-1.0g/mL作为上样液；
(3)纯化：将步骤(2)所得上样液，上大孔吸附树脂，先用水洗脱除杂，然后用乙醇洗脱，得乙醇洗脱物，减压干燥至粉末或浸膏，即得总丹参茎叶酚酸及黄酮类成分。
2.根据权利要求1所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述丹参茎叶与树脂用量比为0.5g/g，用3-4大孔树脂柱体积水除杂后，再用1-6大孔树脂柱体积的10-90％乙醇洗脱，减压干燥至粉末或浸膏，即得总丹参茎叶酚酸及黄酮类成分。
3.根据权利要求1所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)提取过程中，加入的丹参茎叶药材的重量与乙醇的体积比为1：8g/mL。
4.根据权利要求1所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)所用乙醇浓度为50％。
5.根据权利要求1所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，步骤(1)提取方法为回流提取法，提取次数为3次，每次1h。
6.根据权利要求1所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，将步骤(1)所得提取液，减压浓缩至浓度为1.0g/mL作为上样液。
7.根据权利要求1所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述的大孔吸附树脂型号为AB-8型大孔吸附树脂。
8.根据权利要求1所述的丹参茎叶中酚酸类及黄酮类成分的提取纯化方法，其特征在于，步骤(3)洗脱剂乙醇的体积浓度为40％，洗脱剂的用量为3倍大孔吸附树脂柱体积。
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