CN105412083B - 异虎耳草素的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药技术领域，本发明公开异虎耳草素在保护肾损伤细胞中的应用，从而为临床上防止肾损伤提供多一种安全有效的用药选择。异虎耳草素在安全剂量内能够有效地保护肾损伤细胞，可进一步开发为肾损伤保护药物，具有广泛的应用前景。

Description

异虎耳草素的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及异虎耳草素的应用。
背景技术
肾脏是人体的重要器官，用于保证机体内环境的稳定，是新陈代谢得以正常进行。肾损伤时泌尿外科常见的急症之一，对肾损伤做出适当的治疗方案，对减轻患者的伤情，改善预后情况至关重要。因此，近年来肾损伤保护药物在不断的研究和开发中。
研究发现中药对肾损伤具有明显的保护作用，而且相对于西药来说，中药更加温和安全，副作用较小。羌活，伞形科、羌活属植物，性温，散表寒；祛风湿；利关节；止痛。主外感风寒；头痛无汗；风水浮肿；疮疡肿毒。用于阳痿遗精，遗尿尿频，腰膝冷痛，肾虚作喘，五更泄泻；外用治白癜风，斑秃。解表散寒，祛风胜湿，止痛。羌活中含有多种活性物质，如凯林内酯、紫花前胡苷元、异虎耳草素、茴香酸对羟基苯乙酯、比克白芷内酯、佛手酚等，这些活性物质具有多种药用作用。其中，异虎耳草素被报道作为制备抗肿瘤药物以及抗癌逆转剂方面的应用，如中国专利CN103893168A公开了以异虎耳草素作为制备制备抗肿瘤药物以及抗癌逆转剂方面的应用。但是，目前并未见文献报道异虎耳草素具有防止肾损伤的功效。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供异虎耳草素的新应用，异虎耳草素具有防止肾损伤、保护肾损伤细胞的功效，使其能够应用于肾损伤保护药物的制备中。
异虎耳草素化学结构如下：
其中，作为优选，所述肾损伤为顺铂所致肾损伤。
异虎耳草素获取途径既可以从含有该成分的天然物质如蛇床、羌活中提取，也可以利用化学合成方法加以人工合成。作为优选，本发明所述异虎耳草素从羌活中提取获得，更进一步优选地，采取以下方法获得：
步骤1、粉碎羌活根茎，加入乙醇溶液提取，提取液过滤、浓缩后加盐酸调节pH为2，加热回流并浓缩蒸干获得粗提物；
步骤2、粗提物加入乙醇溶液复溶，通过大孔树脂柱吸附，依次水洗脱4个柱体积，40％乙醇洗脱3个柱体积，60％乙醇洗脱6个柱体积，收集60％乙醇洗脱液，除去溶剂，浓缩至浸膏，然后加入乙酸乙酯溶解、过滤，滤液除去溶剂，浓缩、干燥，获得羌活提取物；
步骤3、羌活提取物加甲醇溶解后，加入等量的粗硅胶中搅拌均匀，烘干后倒入到含4～5倍量的200-300目硅胶柱中；石油醚平衡D-101柱子以后，利用石油醚-乙酸乙酯50:1、20:1、10:1各洗脱4个柱体积，收集10:1洗脱部位浓缩蒸干，加甲醇溶解后，离心，取上清液，利用高压制备液相色谱进行制备分离，获得异虎耳草素。
其中，步骤1所述羌活根茎与乙醇溶液的体积质量比优选为1g:6-10mL。
高压制备液相色谱条件优选如下：
安捷伦1260型制备色谱仪，色谱柱为Fuji C18(250×50mm)；流动相为乙腈-水；检测波长为310nm；洗脱程序为0～60min，乙腈30％，水70％；流速为30mL·min-1；柱温为30℃。
步骤2所述粗提物加入乙醇溶液复溶优选为粗提物加入羌活根茎总重1倍量的40％乙醇溶液溶解。
述大孔树脂柱优选为D-101型大孔树脂柱。
所述大孔树脂柱重量优选为羌活根茎总重的2倍。
步骤1所述乙醇溶液的体积百分浓度优选为70％。
顺式异虎耳草素以及反式异虎耳草素在对顺铂所致HK-2细胞肾损伤模型的试验中均表现出对正常HK-2细胞的安全性以及对肾损伤细胞的保护作用。因此，本发明提供异虎耳草素在制备肾损伤保护药物中的应用。
由以上技术方案可知，本发明提供了异虎耳草素在保护肾损伤细胞中的应用，从而为临床上防止肾损伤提供多一种安全有效的用药选择。异虎耳草素在安全剂量内能够有效地保护肾损伤细胞，可进一步开发为肾损伤保护药物，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1所示为羌活提取物高压制备液相色谱图。
具体实施方式
本发明公开了异虎耳草素的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和制备方法以及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
以下就本发明所提供的异虎耳草素的应用做进一步说明。
实施例1：异虎耳草素的提取分离
将羌活根茎粉碎成粗粉，按体积/质量加入6～10倍的70％乙醇溶液提取两次，每次1.5小时，合并过滤液，浓缩至无醇味后加水至药材重量的1倍；浓缩液加入浓盐酸调节pH至2，加热回流0.5个小时，浓缩蒸干，加入药材重量1倍量的40％乙醇溶液使其完全溶解。水解液通过2倍药材重量的D-101大孔树脂柱(径高比为1:8)吸附后，水洗脱4个柱体积，40％乙醇洗脱3个柱体积，60％乙醇洗脱6个柱体积。60％乙醇洗脱液合并，回收溶剂，浓缩至浸膏。浸膏加入乙酸乙酯溶液，使其溶解完全，滤过，回收溶剂，浓缩至浸膏，60℃真空干燥，粉碎即得羌活提取物。
羌活提取物加适量甲醇溶解后，加入等量的粗硅胶(80-100目)中搅拌均匀，烘干后倒入到含4～5倍量的硅胶(200-300目)柱中。石油醚平衡D-101柱子以后，利用石油醚-乙酸乙酯50:1、20:1、10:1各洗脱4个柱体积，收集10:1部位浓缩蒸干。石油醚-乙酸乙酯10:1洗脱部位加甲醇溶解后，离心，取上清液，利用高压制备液相进行制备，收集异虎耳草素色谱峰，浓缩干燥后获得异虎耳草素。
高压制备液相色谱条件：安捷伦1260型制备色谱仪，色谱柱为FujiC18(250×50mm)；流动相为乙腈(A)-水(B)；检测波长为310nm；洗脱程序为0～60min，A30％，B70％；流速为30mL·min-1；柱温为30℃。
异虎耳草素鉴定结果如下：
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ:6.34(1H,d,J＝9.8Hz,H-3),8.18(1H,d,J＝9.8Hz,H-4),8.09(1H,d,J＝2.3Hz,H-2′),7.40(1H,d,J＝2.3Hz,H-3′),4.17(3H,s,5-OCH3),4.03(3H,s,8-OCH3)。13C NMR(100MHz,CD3OD)δ:160.1(C-2),112.9(C-3),140.2(C-4),144.7(C-5),114.8(C-6),149.9(C-7),127.6(C-8),143.5(C-9),107.2(C-10),146.8(C-2′),106.2(C-3′),61.8(5-OCH3),61.2(8-OCH3)。
实施例2：异虎耳草素对顺铂致HK-2细胞肾损伤模型的保护作用
1.材料与方法
1.1细胞人肾小管上皮细胞HK-2，购自中国典型培养物保藏中心。
1.2主要试剂及仪器
顺铂购自sigma公司；达尔伯克必需基本培养液(Dulbecco’s minimum essentialmedium，DMEM)/F12培养液、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶购自美国Gibco公司；MTT购自碧云天公司。
1.3 HK-2细胞的培养
HK-2细胞在含10％FBS的DMEM/F12培养液中进行常规培养，5％CO2，37℃培养至融合期的细胞用0.25％胰酶消化，传代，取对数生长的细胞进行实验。
1.4异虎耳草素对HK-2细胞生长的影响：
取对数生长期HK-2细胞，以1×104cells/100μl/孔接种于96孔培养板中，待细胞生长至80％以上，换为无血清培养基培养12h使处于同步状态，分别加入6.25，12.5，25，50，100，150μg/ml各种浓度异虎耳草素于常规条件下培养，对照组：在正常培养基中培养，24h后置于倒置显微镜下观察细胞形态变化，每孔加入MTT溶液10μl，在细胞培养箱中继续孵育4h，吸弃上清，加入150μlDMSO溶解甲瓒，使用酶标仪以570nm为检测波长，630nm为参比波长，读取吸光度值，每组设6个复孔，各组取平均值，实验重复3次，实验结果见表1。
表1异虎耳草素对正常HK-2细胞生长的影响OD值x±s
药物浓度(μg/mL) 异虎耳草素(n＝6)
control 0.64±0.04
6.25 0.64±0.04
12.5 0.65±0.02
25 0.65±0.01
50 0.68±0.02
100 0.66±0.03
150 0.64±0.01
与正常组比较*：P＜0.05
由表1结果可知，异虎耳草素对正常HK-2细胞的生长与对照组相比没有明显的影响，安全性高。
1.5药物保护作用
取对数生长期HK-2细胞，以1×104cells/100μl/孔接种于96孔培养板中，待细胞生长至80％以上，换为无血清培养基培养12h使处于同步状态，分别加人80μmol·L-1DDP，同时分别加入0，6.25，12.5，25，50，100，150μg/ml各种浓度异虎耳草素常规条件培养，对照组：在正常培养基中培养，24h后置于倒置显微镜下观察细胞形态变化，每孔加入MTT溶液10μl，在细胞培养箱中继续孵育4h，吸弃上清，加入150μlDMSO溶解甲瓒，使用酶标仪以570nm为检测波长，630nm为参比波长，读取吸光度值，每组设6个复孔，各组取平均值，实验重复3次，实验结果见表2。
表2异虎耳草素对肾损伤细胞的保护作用
药物浓度(μg/mL) 异虎耳草素(n＝6)
control 0.67±0.03
Model 0.50±0.05##
6.25 0.50±0.01
12.5 0.51±0.08
25 0.52±0.03*
50 0.55±0.01*
100 0.54±0.09*
150 0.47±0.00
与正常组比较##：P＜0.01；与模型组比较*：p<0.05；**：P＜0.01
由表2结果可知，模型组相比对照组具有显著差异，表明顺铂致HK-2细胞肾损伤模型构建成功。而在异虎耳草素药物浓度为25、50、100μg/ml时，其对肾损伤细胞具有显著的保护作用，表明异虎耳草素能够应用于肾损伤保护药物的制备中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.异虎耳草素在制备肾损伤保护药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述肾损伤为顺铂所致肾损伤。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述异虎耳草素从羌活中提取获得。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述异虎耳草素由以下方法提取分离获得：
步骤1、粉碎羌活根茎，加入乙醇溶液提取，提取液过滤、浓缩后加盐酸调节pH为2，加热回流并浓缩蒸干获得粗提物；
步骤2、粗提物加入乙醇溶液复溶，通过大孔树脂柱吸附，依次水洗脱4个柱体积，40％乙醇洗脱3个柱体积，60％乙醇洗脱6个柱体积，收集60％乙醇洗脱液，除去溶剂，浓缩至浸膏，然后加入乙酸乙酯溶解、过滤，滤液除去溶剂，浓缩、干燥，获得羌活提取物；
步骤3、羌活提取物加甲醇溶解后，加入等量的粗硅胶中搅拌均匀，烘干后倒入到含4～5倍量的200-300目硅胶柱中；石油醚平衡D-101柱子以后，利用石油醚-乙酸乙酯50:1、20:1、10:1各洗脱4个柱体积，收集10:1洗脱部位浓缩蒸干，加甲醇溶解后，离心，取上清液，利用高压制备液相色谱进行制备分离，获得异虎耳草素。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤1所述羌活根茎与乙醇溶液的体积质量比为1g:6-10mL。
6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤1所述乙醇溶液的体积百分浓度为70％。
7.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述高压制备液相色谱条件如下：
安捷伦1260型制备色谱仪，色谱柱为Fuji C18(250×50mm)；流动相为乙腈-水；检测波长为310nm；洗脱程序为0～60min，乙腈30％，水70％；流速为30mL·min-1；柱温为30℃。
8.根据权利要求4所述应用，其特征在于，步骤2所述粗提物加入乙醇溶液复溶为粗提物加入羌活根茎总重1倍量的40％乙醇溶液溶解。
9.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述大孔树脂柱为D-101型大孔树脂柱。
10.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述大孔树脂柱重量为羌活根茎总重的2倍。
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