CN107753531B - 文王一支笔提取物及其在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种文王一支笔提取物，该提取物为文王一支笔经水提取后再经醇沉处理所得到的醇溶物部位的提取物或文王一支笔经水提取后再经醇沉处理得到的上清液经醋酸乙酯萃取后得到醋酸乙酯部位的提取物或文王一支笔经水提取后再经醇沉处理得到的沉淀物经醇洗涤干燥后得到水提醇沉部位的提取物，本发明将其应用于制备治疗卵巢癌的药物上。实验表明在体外均能剂量依赖性抑制卵巢癌A2780及SKOV3细胞的生长；在体内均能明显抑制A2780裸鼠移植瘤的生长，具有较好的效果。

Description

文王一支笔提取物及其在制备抗癌药物中的应用
技术领域
本发明提供一种文王一支笔的多种提取物，并将该提取物应用于治疗卵巢癌的疾病的药物上。
背景技术
一直以来，恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康的常见病、多发病。据2015年CA期刊在《2012全球癌症统计》的统计数据，2012年全球约有1.41千万新发癌症病例，820万患者死于癌症。
卵巢癌是危害广大妇女健康最常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，但因卵巢癌致死者，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌早期症状不典型，早期诊断较困难；另外，卵巢癌具有很强的侵润和转移能力，因此卵巢癌患者生存率很低，5年存活率约为50％。卵巢癌的传统治疗方法以手术、化疗为主，但患者生存率仍不理想。卵巢癌仍然是全球女性死亡的一个主要疾病。因此，进一步研究和开发相应的新的卵巢癌治疗药物，具有重要的理论和现实意义。
近年来，随着自然科学的发展，卵巢癌等恶性肿瘤的临床与基础研究取得了可喜的成就，形成了手术治疗、放化疗、分子靶向治疗、中医药治疗等多种治疗方式。其中，中医药治疗体系中以中草药治疗卵巢癌的疗效受到越来越多的专家学者和临床医学的肯定。中草药种类繁多，功效各异，如扶正培本药、祛邪攻毒药等，这类中草药在卵巢癌的治疗过程中意义重大。目前国内外有文献报道了灵芝粉、莪术油、鸦胆子油乳、蝎毒多肽、银莲花素、威灵仙多糖等中草药及其有效组分，可分别通过不同的作用机制来发挥抑制卵巢癌细胞增殖并诱导其凋亡等抗作用。中药复方制剂如艾迪注射液、康艾注射液等，以及中药联合化学药物用于应用于卵巢癌的治疗手段，也在临床上得到了极大的推广和应用。然而，迄今为止，中草药尚未在国内外成为治疗卵巢癌等恶性肿瘤的首选药物，现有临床中草药的抗癌疗效有待进一步提高，发现、筛选和研发中草药抗癌药物是目前治疗卵巢癌等恶性肿瘤的一项重要研究任务。我国药用植物资源丰富，尚有很大部分的中药和民间草药亟待研究，从这些植物中寻找高效低毒的抗癌药物是近几来研究的热点之一。
文王一支笔又称鹿仙草、鸡心七，回春草，不老草，顶天柱等，属蛇菰科蛇菰属草本寄生植物；主要分布于亚洲、大洋洲的热带、亚热带地区；在我国主要分布于云南、四川、广东、江西、湖南、湖北及贵州等省区。该植物全株入药，是土家族、少数民族民间著名中草药，有清热解毒、止血、镇痛及消炎之功效，民间用以治疗外伤出血、胃病、痔疮及月经不调等疾病，疗效奇佳。我们在长期挖掘传统中医药的宝库中发现一些具有较好防治卵巢癌等恶性肿的中草药，本发明是其中之一，主要内容是发现文王一支笔的醇溶物(Frs)、水提醇沉部位(Frp)以及醋酸乙酯部位(Fre)在体内外均对卵巢癌有良好的抑制作用。
发明内容
文王一支笔系湖北土家族民间对蛇菰科蛇菰属药用植物筒鞘蛇菰BalanophoraInvolucrata及其他近似种，数种草本寄生植物来源的民间草药的称呼，因其外形像一支支毛笔而得名，被列为土家族四大名药之一。据《中国植物志》记载，蛇菰科植物均为一年生或多年生肉质草本，无正常根，靠根茎上的吸盘寄生于寄主植物的根上。本科植物共计18属约120种，分布于全世界热带至亚热带，我国产2属20种。其中蛇菰属Balanophora以花柱1 枚；胚珠悬垂，倒生，花序无盾状鳞片；花茎有鳞苞片；根茎内含大量的蜡质物(蛇菰素) 为特征，我国产19种，包括日本蛇菰B.japonica，印度蛇菰B.indica，粗穂蛇菰B.dioica，思茅蛇菰B.simaoensis，隐轴蛇菰B.cryptocaudex，长枝蛇菰B.elongata，彩丽蛇菰B.splendida，杯茎蛇菰B.subcupularis，海南蛇菰B.kainantensis，多蕊蛇菰B.polyandra，皱球蛇菰B.rugosa，疏花蛇菰B.laxiflora，穂花蛇菰B.spicata，筒鞘蛇菰B.involucrata，川藏蛇菰B.fargesii，红冬蛇菰B.harlandii，宜昌蛇菰B.henryi，红烛蛇菰B.mutinoides和鸟黐蛇菰B.tobiracola。《中华本草》中记载，粗穂蛇菰B.dioica的全草作鹿心草，红冬蛇菰B.harlandii的全草作葛蕈，筒鞘蛇菰B.involucrata的全草作寄生黄，疏花蛇菰B.laxiflora的全草作鹿仙草，红烛蛇菰B. mutinoides的全草作深山不出头，多蕊蛇菰B.polyandra的全草作通天蜡烛，穂花蛇菰B.spicata 全草作穂花蛇菰。根据我们对蛇菰属药用植物在湖北、四川、云南、广西等地的调查，认为它们作为药材的外观性状均相似，虽然各地对其习称有别，但民间应用相近。国内外相关研究的文献报道进一步指出，已有研究的各种蛇菰属药用植物之间的主要成分差异不大，均以松柏苷、甲基松柏苷等苯丙素类，蛇菰素A、蛇菰素B等三萜及甾类化学成分为主。为此，我们推定作为文王一支笔药材来源的蛇菰属各近似种之间具有类似的药理活性。本发明研究所采用的文王一支笔药物采集于湖北省十堰市大庙乡，经鉴定为筒鞘蛇菰Balanophora Involucrata的全草。采挖后除去泥土、杂质，切片后阴干。
针对上述技术问题，本发明提供一种文王一支笔的不同种的提取物，具体如下：
文王一支笔提取物，该提取物为文王一支笔经水提取后再经醇沉处理所得到的醇溶物部位的提取物(Frs)。
文王一支笔提取物，该提取物为文王一支笔经水提取后再经醇沉处理得到的上清液经醋酸乙酯萃取后得到醋酸乙酯部位的提取物(Fre)。
文王一支笔提取物，该提取物为文王一支笔经水提取后再经醇沉处理得到的沉淀物经醇洗涤干燥后得到水提醇沉部位的提取物(Frp)。
具体药物提取与制备
取文王一支笔药材，切碎或碾碎后，用水作为溶剂，加热回流提取，提取次数为1～3次，每次0.5～3小时，每次溶剂用量为药材重量的6～15倍，滤过，提取液加收溶剂，浓缩后过滤并定容。此时药液在室温下的相对密度为1.05～1.15。
取上述药液，于40～70℃保温和搅拌条件下，逐步加入80％～95％乙醇或工业酒精，使药液体系最终含醇浓度为30％～70％。随后于常温或低温(4～10℃)条件下静置12～36小时，分离上清液与沉淀物。取出部分上清液，经减压回收乙醇后，浓缩干燥，得到醇溶物(Frs)。取剩余的上清液，经减压回收乙醇后，加温水使之分散，并以醋酸乙酯进行萃取，萃取次数为1～4次，合并各次的醋酸乙酯萃取层，经减压回收溶剂后，浓缩干燥，得到醋酸乙酯部位 (Fre)。取出水提醇沉中的沉淀物，以80％～95％乙醇或工业酒精洗涤数次后，尽量去除乙醇，干燥后得到水提醇沉部位(Frp)。
本发明将所述的文王一支笔醇溶物部位的提取物在制备治疗卵巢癌的药物上的应用。
或将所述的文王一支笔醋酸乙酯部位的提取物在制备治疗卵巢癌的药物上的应用。
或将所述的文王一支笔水提醇沉部位的提取物在制备治疗卵巢癌的药物上的应用。
本发明所述的文王一支笔醇溶物部位的提取物、文王一支笔醋酸乙酯部位的提取物或文王一支笔水提醇沉部位的提取物的使用质量分数为0.1-10％。
文王一支笔各提取物，尤其是从水提取物中制备得到的醇溶物(Frs)、水提醇沉部位 (Frp)及醋酸乙酯部位(Fre)在体外均能剂量依赖性抑制卵巢癌A2780及SKOV3细胞的生长；在体内均能明显抑制A2780裸鼠移植瘤的生长；上述提取物在实验过程中，没有发现裸鼠死亡，也没有观察到小鼠明显的肝肾功能异常，这表明其具有较好的安全性。
利用本发明的提取方法所得文王一支笔各提取物均具有很好的抗癌效果，单独或与其他成分加工制成各种抗癌药物或防癌保健品，其剂型特征属于药酒、酊剂、混悬液、胶囊、片剂、丸剂、滴丸剂、粉剂、注射液中的任何一种，并且在其中含有10％～100％质量分数的文王一支笔提取物。
附图说明
图1为实施例1醇溶物部位的提取物(Frs)、醋酸乙酯部位的提取物(Fre)、水提醇沉部位的提取物(Frp)分别在245nm及210nm的高效液相特征图谱。
图2为实施例1醇溶物部位的提取物(Frs)、醋酸乙酯部位的提取物(Fre)、水提醇沉部位的提取物(Frp)对卵巢癌A2780及SKOV3细胞生长的影响(*p<0.05,n＝3)。
图3文王一支醇溶物部位的提取物(Frs)对卵巢癌A2780裸鼠移植瘤生长的影响(*p<0.05, n＝4).A:裸鼠移植瘤生长曲线；B、C：肿瘤生长体积。
图4文王一支笔水水提醇沉部位的提取物(Frp)对卵巢癌A2780裸鼠移植瘤生长的影响(*p <0.05,n＝4).A:裸鼠移植瘤生长曲线；B、C：肿瘤生长体积。
图5文王一支笔醋酸乙酯部位的提取物(Fre)对卵巢癌A2780裸鼠移植瘤生长的影响(*p< 0.05,n＝4).A:裸鼠移植瘤生长曲线；B、C：肿瘤生长体积。
图6文王一支笔醇溶物部位的提取物(Frs)对卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影响(*p<0.05,n＝ 4)。
图7文王一支笔水提醇沉部位的提取物(Frp)对卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影响(*p<0.05, n＝3)。
图8文王一支笔醋酸乙酯部位的提取物(Fre)对卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影响(*p<0.05, n＝4)。
具体实施方式
实施例1
药物提取与制备
取文王一支笔药材，切碎或碾碎后，用水作为溶剂，加热回流提取，提取次数为3次，每次2小时，每次溶剂用量为药材重量的10倍，滤过，提取液加收溶剂，浓缩后过滤并定容。此时药液在室温下的相对密度为1.15。
取上述药液，于50℃保温和搅拌条件下，逐步加入85％乙醇，使药液体系最终含醇浓度为45％。随后于低温6℃条件下静置24小时，分离上清液与沉淀物。
取出部分上清液，经减压回收乙醇后，浓缩干燥，得到文王一支醇溶物部位的提取物 (Frs)。
取剩余的上清液，经减压回收乙醇后，加70℃温水使之分散，并以醋酸乙酯进行萃取，萃取4次，合并各次的醋酸乙酯萃取层，经减压回收溶剂后，浓缩干燥，得到文王一支笔醋酸乙酯部位的提取物(Fre)。
取出水提醇沉中的沉淀物，以85％乙醇或工业酒精洗涤数次后，尽量去除乙醇，干燥后得到文王一支笔水提醇沉部位的提取物(Frp)。
文王一支笔各提取部位的特征谱图
对上述从文王一支笔药材的水提取物中制备得到的醇溶物(Frs)、醋酸乙酯部位(Fre) 和水提醇沉部位(Frp)进行HPLC特征图谱的研究。色谱柱采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(250×4.6mm，粒径5μm)。流动相体系以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序为0min，5％A；10min，15％A；35min，25％A；50min，30％A；70min， 65％A。柱温为30℃，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm和210nm。
文王一支笔各提取部位的抗卵巢癌研究
材料及方法
细胞培养与试剂
A2780和SKOV3细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、CO2体积分数为5％的培养箱中进行培养。DMEM培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司；BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
细胞增殖检测
将A2780及SKOV3细胞接种到96孔板(5×103个/孔)中，待24小时细胞贴壁后，分别加入不同质量分数的醇溶物(Frs)、醋酸乙酯部位(Fre)和水提醇沉部位(Frp)，质量分数为50μg/mL。然后对各提取部位分别在第1、2、3、4天用MTT法(5g/L MTT)，检测其 570nm吸光度(A570)，实验重复3次。
裸鼠移植瘤实验
取对数生长期A2780细胞，制成单细胞悬液，在裸鼠背侧皮下分别接种0.1mL(1×106) 细胞悬液；各组裸鼠分别单剂量灌胃给予醇溶物(Frs)和水提醇沉部位(Frp)，剂量均为400 mg/Kg·d，以及低高双剂量灌胃给予醋酸乙酯部位(Fre)，剂量分别为200mg/Kg·d及400 mg/Kg·d。灌胃每日一次；分别在接种后第7、14、21、28天用游标卡尺测量瘤体长径和短径，以长径和短径均值来计算肿瘤的体积(cm3)，并根据肿瘤体积绘制A2780细胞移植瘤生长曲线，其计算公式为V＝长×宽2×π/6。在第28天断颈处死裸鼠，小心剥离肿瘤，称取各组裸鼠肿瘤的重量。
免疫组织化学检测Ki-67的表达
对从各组裸鼠剥离下来的肿瘤，用4％多聚甲醛固定、石蜡包埋；石蜡切片经脱水、抗原修复及封闭后，孵育Ki-67一抗4℃过夜；PBS洗后孵育相应的二抗。同时，用PBS代替Ki-67 一抗，设立阴性对照实验。
统计学处理
实验结果以均数±标准差
Figure RE-GDA0001525163230000061
表示，使用统计软件SPSS11.5进行分析，多组间用单因素方差分析(One Way ANOVA)，以p＜0.05为差异有显著性。
文王一支笔各提取部位的特征图谱：结果见附图1。在254nm和210nm检视波长下，Frs均有5个特征色谱峰，按保留时间由小至大分别为峰1，峰2，峰3，峰4和峰5；Fre均有14个特征色谱峰，按保留时间由小至大分别为峰2，峰6，峰7，峰8，峰3，峰9，峰10，峰4，峰11，峰5，峰12，峰13，峰14和峰15；Frp均有6个特征色谱峰，按保留时间由小至大分别为峰1，峰2，峰16，峰3，峰4和峰5。
文王一支笔各提取部位对卵巢癌A2780及SKOV3细胞生长的影响
如附图2所示，在体外培养的A2780细胞中，当分别用100μg/mL的醇溶物(Frs)处理细胞2天后，用50μg/mL的水提醇沉部位(Frp)处理细胞2天后，用50μg/mL的醋酸乙酯部位(Fre)处理细胞1天后，与空白对照组比较，细胞生长明显减慢(p<0.05)。
在SKOV3细胞中，当分别用100μg/mL的醇溶物(Frs)处理细胞2天后，用100μg/mL的水提醇沉部位(Frp)处理细胞1天后，用50μg/mL的醋酸乙酯部位(Fre)处理细胞3天后，与空白对照组比较，细胞生长明显减慢(p<0.05)。
上述结果提示文王一支笔醇溶物(Frs)、水提醇沉部位(Frp)及醋酸乙酯部位(Fre)在体外均可抑制卵巢癌细胞生长。其中，尤以醋酸乙酯部位(Fre)的抑制作用最为明显。
文王一支笔各提取部位在体内对卵巢癌生长的影响
如附图3～5所示，醇溶物(Frs)和水提醇沉部位(Frp)分别灌胃21天后，均可显著抑制A2780卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的生长，其肿瘤重量明显减轻(p<0.05，附图3C、4C)；醋酸乙酯部位(Fre)高剂量灌胃14天后，亦可显著抑制A2780卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的生长，其肿瘤重量明显减轻(p<0.05，附图5C)。以上结果提示文王一支笔各提取部位在体内可抑制卵巢癌生长。
文王一支笔各提取部位对卵巢癌裸鼠移植瘤增殖的影响
对卵巢癌A2780细胞裸鼠移植瘤切片后，用Ki-67抗体进行免疫组织化学检测，如附图 6～8所示，醇溶物(Frs)、水提醇沉部位(Frp)及醋酸乙酯部位(Fre)均可显著抑制肿瘤细胞的增殖(p<0.05)，提示文王一支笔各提取部位能够通过抑制肿瘤细胞增殖，从而抑制卵巢癌裸鼠移植瘤的生长。

Claims (4)

1.文王一支笔醇溶物部位的提取物在制备治疗卵巢癌的药物上的应用，该提取物为文王一支笔经水提取后再经醇沉处理所得到的醇溶物部位的提取物，具体制备方法是取文王一支笔药材，切碎或碾碎后，用水作为溶剂，加热回流提取，提取次数为 1~3 次，每次 0.5~3 小时，每次溶剂用量为药材重量的 6~15倍，滤过，提取液回收溶剂，浓缩后过滤并定容，此时药液在室温下的相对密度为1.05~1.15，取上述药液，于40~70℃保温和搅拌条件下，逐步加入 80%~95%乙醇，使药液体系最终含醇浓度为 30%~70%，随后于常温或低温4~10℃条件下静置12~36小时，分离上清液与沉淀物，取上清液，经减压回收乙醇后，浓缩干燥，得到醇溶物部位的提取物。
2.文王一支笔醋酸乙酯部位的提取物在制备治疗卵巢癌的药物上的应用，该提取物为文王一支笔经水提取后再经醇沉处理得到的上清液经醋酸乙酯萃取后得到醋酸乙酯部位的提取物，具体制备步骤是取文王一支笔药材，切碎或碾碎后，用水作为溶剂，加热回流提取，提取次数为1~3次，每次0.5~3小时，每次溶剂用量为药材重量的6~15倍，滤过，提取液回收溶剂，浓缩后过滤并定容，此时药液在室温下的相对密度为1.05~1.15，取上述药液，于40~70℃保温和搅拌条件下，逐步加入80%~95%乙醇，使药液体系最终含醇浓度为30%~70%，随后于常温或低温4~10℃条件下静置 12~36小时，分离上清液与沉淀物，取上清液，经减压回收乙醇后，加温水使之分散，并以醋酸乙酯进行萃取，萃取次数为 1~4次，合并各次的醋酸乙酯萃取层，经减压回收溶剂后，浓缩干燥，得到醋酸乙酯部位的提取物。
3.文王一支笔水提醇沉部位的提取物在制备治疗卵巢癌的药物上的应用，该提取物为文王一支笔经水提取后再经醇沉处理得到的沉淀物经醇洗涤干燥后得到水提醇沉部位的提取物，具体制备步骤是取文王一支笔药材，切碎或碾碎后，用水作为溶剂，加热回流提取，提取次数为1~3次，每次0.5~3小时，每次溶剂用量为药材重量的6~15倍，滤过，提取液回收溶剂，浓缩后过滤并定容，此时药液在室温下的相对密度为1.05~1.15，取上述药液，于 40~70℃保温和搅拌条件下，逐步加入80%~95%乙醇，使药液体系最终含醇浓度为30%~70%，随后于常温或低温4~10℃条件下静置12~36小时，分离上清液与沉淀物，取出水提醇沉中的沉淀物，以 80%~95%乙醇或工业酒精洗涤数次后，尽量去除乙醇，干燥后得到水提醇沉部位的提取物。
4.根据权利要求1-3所述的应用，文王一支笔醇溶物部位的提取物、文王一支笔醋酸乙酯部位的提取物或文王一支笔水提醇沉部位的提取物的使用质量分数为0.1-10%。
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