CN102274279B

CN102274279B - 一种核桃楸树皮提取物及其在制备抗癌药物方面的应用

Info

Publication number: CN102274279B
Application number: CN 201110177959
Authority: CN
Inventors: 张咏莉; 陆家政; 李红枝; 黄清松; 崔玉强; 汪向升
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2031-06-29
Also published as: CN102274279A

Abstract

本发明涉及一种具有良好抗癌效果的核桃楸树皮提取物，由以下方法步骤制备获得：（1）将核桃楸树皮用质量分数70~75%的乙醇溶液回流提取3.5~5.5h，蒸发回收乙醇获得浓缩液，再在浓缩液中加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，获得萃取液；（2）将萃取液干燥后，通过硅胶柱层析分离，所采用的洗脱剂为体积比3:2~0:1的氯仿：甲醇溶液，获得洗脱液。本发明提取分离获得的核桃楸树皮提取物，在抗癌方面尤其是抗肝癌方面，具有比现有的其他核桃楸树皮提取物更好的效果，且提取分离方法简单易行。

Description

一种核桃楸树皮提取物及其在制备抗癌药物方面的应用

技术领域

本发明属于天然药物领域，具体涉及一种核桃楸树皮提取物及其在制备抗癌药物方面的应用。

背景技术

在人类寻找新药以及向疾病作斗争的过程中，天然药物的研究和开发发挥着重要作用。有数据表明，在全球应用的175种抗癌药物中，约有57％直接或间接来源于天然产物。因而，从天然植物中寻找和开发新药的前景十分广阔。我国地域辽阔，天然药物资源丰富，如何更加有效的利用这些天然药物资源，开发出能造福于人类的新药，是当前摆在药物研究者面前的重要任务。传统的天然药物研究一般是通过先提取、分离、鉴定植物中的化学成分，然后对得到的化合物进行活性研究。这种方法工作量大，筛选中标率低而且易漏筛，因而我们首先应用生物活性检测跟踪筛选到最佳组分，后再指导进行活性成分的分离，具有极大地创造性。

核桃楸树皮的提取物已被证实在抗癌症方面具有一定的效果。但是核桃楸树皮中的成分非常复杂，在所获得的提取物中哪些是起关键作用，其中起主要抗癌活性的成分有哪些，它们的确切抗癌药效到底如何，这些工作都缺乏系统和深入的探究。另外有关核桃楸抗肿瘤的研究主要集中于天然化学方面，应用的活性检测模型也仅限于动物、组织等。而细胞水平的检测用量少，操作简便，作用机制明确，能更好地反映内外环境综合因素引起的整个机体生理变化，更易于评价药物的作用和药用价值，尤其令人关注的是比较适合较大规模药物筛选，这也是本发明专利的创新性所在。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种在抗癌方面具有突出效果的核桃楸树皮提取物。

本发明的另一个目的在于提供该核桃楸树皮提取物在制备抗癌药物方面的应用。

发明通过以下技术方案实现上述目的：

发明提供了一种具有良好抗癌效果的核桃楸树皮提取物，由以下方法步骤制备获得：(1)将核桃楸树皮用质量分数70～75％的乙醇溶液回流提取3.5～5.5h，蒸发回收乙醇获得浓缩液，再在浓缩液中加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，获得萃取液；(2)将萃取液干燥后，通过硅胶柱层析分离，所采用的洗脱剂为体积比3∶2～0∶1的氯仿∶甲醇混合液，获得洗脱液。优选的洗脱剂为体积比5∶4～1∶8的氯仿∶甲醇混合液；更优选的洗脱剂为体积比1∶1的氯仿∶甲醇混合液。

步骤(1)所述的核桃楸树皮是干燥的，其重量与所述乙醇溶液体积之间的比例为300～800g∶5000ml。步骤(1)在进行浓缩时，浓缩至浓缩液是稠膏状的，在浓缩液中加入的水的量相当于浓缩液的4～7倍体积。采用乙酸乙酯进行萃取时，乙酸乙酯的用量相当于浓缩液的25～45倍体积。并且采用分次萃取，共萃取5～10次。

步骤(2)所述的萃取液干燥是通过以下方法实现：将萃取液蒸馏至干得到乙酸乙酯提取物，将按重量分数计为20份的乙酸乙酯提取物与70～130份甲醇混合溶解，并加入20～60份硅胶，研磨后，于40～60℃下干燥7～8小时。

本发明同时保护了该核桃楸树皮提取物在制备抗癌药物方面的应用。尤其是在制备抗肝癌药物方面的应用。

发明可以优选以下方案进行：

1.提取：

取干燥的核桃楸树皮500g，粉碎后置圆底烧瓶中加70％的乙醇5000ml充分浸泡，置电热套中并加冷凝管组成回流系统，反复回流提取3次，每次约1.5h。使用旋转蒸发仪减压回收乙醇并浓缩提取物至稠膏状，加5倍量水使之溶解分散。采用乙酸乙酯萃取10次，每次乙酸乙酯的用量为300ml。萃取液减压蒸馏至干。

2.硅胶柱层析分离

取200-300目硅胶约400g，用流动相氯仿1500ml充分浸泡搅拌，除去所有气泡，湿法装柱，轻轻敲打柱壁使其沉降均匀，勿使柱内留有气泡，充分静止30min以上。静止后剪取适当大小滤纸小心置于硅胶柱上层，以此来保护柱层免受扰动。取乙酸乙酯相提取物20g用100ml甲醇溶解，倒入研钵中与40g硅胶研磨，50℃干燥箱干燥过夜，次日干法上样。采用氯仿-甲醇梯度洗脱，分别使用氯仿∶甲醇为1∶0，30∶1，15∶1，7∶1，3∶1，1∶1，0∶1得到七组洗脱组份，编号为JMM1～7。对每个组份的活性测试表明，氯仿∶甲醇＝1∶1洗脱下的组份JMM6显示出较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，故取JMM6继续做下一步分析。

在核桃楸树皮乙酸乙酯相抗肝癌药用成分的提取、分离中，为了证实发明的有效性，发明进行了一系列对比试验，并采用人肝癌BEL-7402细胞株作为实验对象检测它们细胞增殖抑制作用。

发明采用的对比试验如下：

在萃取步骤中，发明采用了几种萃取溶液的对比，分别是：石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各5次，萃取液减压蒸馏至干。分别得到石油醚组份，乙酸乙酯组份，正丁醇组份以及水相。MTT法检测四种萃取相的细胞增殖抑制作用的试验方法为：取对数生长期的人肝癌BEL-7402细胞，胰酶消化，加培养基收集并分散成单个细胞悬液，调整细胞浓度4×10⁴个/ml，接种细胞悬液于96孔板，每孔加100μl。将96孔板置CO2培养箱中培养12h，加入各提取物不同浓度的工作液，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水相四种萃取相提取物的终浓度分别为500，250，125，62.5，31.25和15.625μg/ml。乙酸乙酯萃取相经进一步硅胶柱分离后各组分加药作用终浓度分别为200，100，50，25，12.5，6.25μg/ml。对照孔加等体积的RPMI1640培养液，DMSO终浓度为0.5％。每组设3个复孔，放置于细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中分别继续培养24h，48h和72h。每孔加入20μl5mg/ml的MTT 37℃继续孵育4h。酶标仪490nm处测量各孔的吸光度值(OD值)。计算细胞相对增殖率和IC₅₀。采用MTT抗肝癌活性跟踪分离中，对四种萃取相的活性测试表明，乙酸乙酯相组份对人肝癌BEL-7402细胞株显示出最强的增殖抑制效应，故取乙酸乙酯相作为活性组份进行进一步的分离。其中MTT结果显示，乙酸乙酯相使BEL-7402细胞的存活率逐渐下降，与对照组相比表现出明显的剂量-依赖效应，而且在6.25-500μg/ml的浓度区间中还表现出明显的时间-依赖效应。计算作用48h的IC₅₀为0.15mg/ml。

在硅胶柱层析分离一步，发明使用了以下梯度的洗脱液∶氯仿∶甲醇的体积比分别为1∶0，30∶1，15∶1，7∶1，3∶1，1∶1，0∶1的七组洗脱液，分别洗脱得到七组洗脱组份，编号为JMM1-JMM7。MTT结果显示，对于JMM1-JMM7组份，JMM6在用药浓度25-200μg/ml分别作用人肝癌BEL-7402细胞株24，48和72h后，均表现出较强的增殖抑制作用，且呈现出明显的剂量和时间依赖效应。可见洗脱液JMM6，即本发明所保护的核桃楸树皮提取物具有突出的抗癌效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提取分离获得的核桃楸树皮提取物，在抗癌方面尤其是抗肝癌方面，具有比现有的其他核桃楸树皮提取物更好的效果，且提取分离方法简单易行。

2.在恶性肿瘤类疾病中，肝癌的致病特点是病情隐匿，恶性度高，临床表现起伏急骤，患者用于此病的治疗需投入较多的人力财力。野生核桃楸树皮药用成分的筛选、分离和制备的研究成果及其产业化运作必将为患者节省大量开支，减轻家庭负担。同时野生核桃楸树皮药用成分等成果的开发和产业化必将受到更广大患者的青睐，其市场潜力非常巨大，因此其经济效益是巨额的。另外一方面，野生核桃楸树皮药用成分未来在临床上的推广和应用，有助于完成肝癌的早期预防、前早期治疗以及提高生存率，从而可以很好地促进社会人口健康，提高人口素质，增强社会生产力，其社会效益同样是巨大的。

3.本成果获得了核桃楸树皮抗肝癌药用成分筛选、制备和鉴定的方法，并首次通过药物化学手段、分子手段、细胞手段全面而系统地探讨了核桃楸树皮抗肝癌药用成分、抗肝癌作用机理及应用前景，可直接应用于核桃楸树皮药用成分的临床治疗实验，与其它相关专利相比具有源头创新性。

4.本成果的获得是通过半制备型高效液相色谱仪、液-质联用仪法、核磁共振仪、红外光谱仪、流式细胞仪、硅胶柱层析法等多项技术开发、研究核桃楸树皮药用活性成分，与传统的化学药物成分制备、功能鉴定的手段相比，所采用技术手段先进可行，可直接应用于核桃楸树皮在抗肝癌药物方面的研发和产业化。

5.我国核桃楸树皮资源丰富，来源广泛，若充分开发利用为天然药用材料，就会真正达到变废为宝、摒承祖国文化的目的。充分发挥我国的地区资源、发挥我国中医中药的文化精髓，这必然会使我们更好地抢占国内药品研发的知识产权制高点，与其它相关专利相比更具有研发的实际性。

6.肝癌对整个社会人口健康危害巨大。本成果充分利用我国现有的民间资源和文化遗产，在抗肝癌研究中获取具有重要应用价值的野生核桃楸树皮药用活性成分，并力争能实现其开发和产业化运作，这必将为整个社会带来巨额的经济效益和社会效益。与其它相关专利相比具有更广泛的实用性。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明的保护范围作出何形式的限定。

实施例1

取核桃楸树皮(干品)500g，粉碎后置圆底烧瓶中加70％乙醇4000ml，置电热套中并加冷凝管组成回流系统，反复回流提取3次，第一次1000ml回流1h，后两次3000ml回流2.5h，共使用质量分数70％的乙醇溶液4000ml回流提取3.5h。使用旋转蒸发仪减压回收乙醇并浓缩提取物至稠膏状，加5倍量水使之溶解分散。水溶后分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇分级萃取，各相萃取10次，每次300ml，共3000ml萃取液。将萃取液减压蒸馏至干，分别得到石油醚组份，乙酸乙酯组份，正丁醇组份及水相组份。分别取少量各萃取部分，DMSO溶解，并过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，MTT法检测其BEL-7402肿瘤细胞抑制效应，计算IC₅₀值。结果显示石油醚组份，乙酸乙酯组份，正丁醇组份，水相组份中乙酸乙酯萃取相组份IC₅₀值最小，抑制增殖作用最强，故选取乙酸乙酯萃取相组份进行后续的硅胶柱分离。

实施例2

取干燥的核桃楸树皮500g，粉碎后置圆底烧瓶中加70％的乙醇5000ml充分浸泡，置电热套中并加冷凝管组成回流系统，反复回流提取3次，每次约1700ml，每次约1.5h，共回流提取4.5h。使用旋转蒸发仪减压回收乙醇并浓缩提取物至稠膏状，加5倍量水使之溶解分散。溶液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各10次，萃取液减压蒸馏至干。分别得到石油醚组份，乙酸乙酯组份，正丁醇组份以及水相。对上述四个萃取相的抗肿瘤细胞活性测试，结果如表1所示，结果表明，石油醚组份，乙酸乙酯组份，正丁醇组份及水相中乙酸乙酯相组份IC50值最小，表明乙酸乙酯相组份对人肝癌BEL-7402细胞株显示出较强的增殖抑制效应，故取乙酸乙酯相作为活性组份进行进一步的分离。

表1.石油醚相，乙酸乙酯相，正丁醇相、水相对BEL-7402细胞IC50结果

注：-----表无显著抑制作用。P＞0.05。

实施例3

将核桃楸树皮粉碎，取500g树皮粉末用70％乙醇回流提取3次，第一次4000ml回流3h，后两次3000ml回流2.5h，共使用质量分数70％的乙醇溶液7000ml回流提取5.5h。合并提取液，减压浓缩，收集浸膏。用5倍水溶解，抽滤，保存滤渣。滤液分别用乙醚，乙酸乙酯，饱和正丁醇萃取，各相萃取10次，每次300ml，合并各萃取液，旋转蒸发干燥。经过MTT细胞筛查试验，其计算得乙醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相中乙酸乙酯萃取相IC50值最小，抗肿瘤活性较高，故选取乙酸乙酯相进一步细分。

实施例4

采用2cm×24cm小柱，乙酸乙酯相500mg，硅胶25g(50倍上样量)，湿法氯仿装柱。采用氯仿-甲醇体系洗脱，分别采用纯氯仿，氯仿∶甲醇分别为60∶1，40∶1，30∶1，20∶1，16∶1，12∶1，10∶1，8∶1，6∶1，4∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，纯甲醇，每种50ml洗脱，每10ml分步收集，做薄层层析法薄层点板检测，合并相同成分洗脱液，旋转蒸发浓缩，50℃真空干燥。

实施例5

采用2cm×24cm小柱，取乙酸乙酯萃取相样品500mg，溶于1ml甲醇，12000转/分离心去不溶物，得深褐色浓缩液，湿法氯仿装柱，小心上样，保持柱面平整，纯氯仿洗脱，控制每分钟100滴左右，可见一黄褐色色带下移，其后跟随有橙红色条带下移，持续用氯仿洗脱分别合并洗脱液，旋转蒸发浓缩，50℃真空干燥，可得到样品I、II。

实施例6

取200-300目硅胶约400g，用流动相氯仿1500ml充分浸泡搅拌，湿法装柱15cm，压实20min以上。样品300mg溶于1ml甲醇，离心取上清上样。纯氯仿冲柱，可有一黄褐色色带下移，一直将其冲下，得第一色带。氯仿∶甲醇＝50∶1洗脱，未见有条带洗下，故换用氯仿∶甲醇＝40∶1洗脱，有三色带下移，且最前一条较为清晰，后续色带较为模糊，收集最清楚色带得色带二，后续色带颜色较浅，随柱移动后界限逐渐模糊，不能单独收集。

实施例7

整体操作方法同上。此次硅胶柱层析分离中采用氯仿∶甲醇45∶1及40∶1洗脱体系，出现了第一色带，但后面拖尾较严重，遂用纯甲醇冲柱回收所有，甲醇洗脱后柱色棕褐色，死吸附较严重。总体实际洗脱过程拖尾严重，收集组分比较困难。

实施例8

取200-300目硅胶约400g，用流动相氯仿1500ml充分浸泡搅拌，除去所有气泡，湿法装柱，轻轻敲打柱壁使其沉降均匀，勿使柱内留有气泡，充分静止30min以上。静止后剪取适当大小滤纸小心置于硅胶柱上层，以此来保护柱层免受扰动。取乙酸乙酯相提取物20g用100ml甲醇溶解，倒入研钵中与40g硅胶研磨，50℃干燥箱干燥过夜，次日干法上样。采用氯仿-甲醇梯度洗脱，分别使用氯仿∶甲醇为1∶0，30∶1，15∶1，7∶1，3∶1，1∶1，0∶1得到七组洗脱组份，编号为JMM1-7。对每个组份的抗增殖活性测试结果分别如表2-8所示，JMM1-7对于肿瘤细胞BEL-7402的IC50值见表9，结果表明，其中氯仿∶甲醇＝1∶1洗脱下的组份JMM6显示出较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，JMM7也具有较好的肿瘤细胞增殖抑制作用。

表2JMM1(氯仿∶甲醇＝1∶0)对BEL-7402细胞MTT存活率结果

表3JMM2(氯仿∶甲醇＝30∶1)对BEL-7402细胞MTT存活率结果

表4JMM3(氯仿∶甲醇＝15∶1)对BEL-7402细胞MTT存活率结果

表5JMM4(氯仿∶甲醇＝7∶1)对BEL-7402细胞MTT存活率结果

表6JMM5(氯仿∶甲醇＝3∶1)对BEL-7402细胞MTT存活率结果

表7JMM6(氯仿∶甲醇＝1∶1)对BEL-7402细胞MTT存活率结果

表8JMM7(氯仿∶甲醇＝0∶1)对BEL-7402细胞MTT存活率结果

表9JMM1-7对BEL-7402细胞IC50结果

注：-----表无显著抑制作用。P＞0.05。

由表8可以看出，在JMM1-JMM7对BEL-7402细胞IC50结果中，在用药浓度25-200μg/ml范围内分别作用24，48和72h后，JMM6对BEL-7402的IC50(半数抑制浓度)值与其它6个组分相比均最小，肿瘤细胞增殖抑制作用最强，且呈现出明显的剂量和时间依赖效应。

实施例9

我们采用了JMM6在相同剂量范围内对于人正常肝细胞chang liver进行了MTT筛查，其chang liver细胞株MTT存活率结果见表10，其JMM6作用24h，48h，72h抑制细胞增殖作用均不明显，仅在作用72h 100-200μg/ml高剂量内才出现了显著抑制作用和细胞毒性，总体来讲细胞毒性较低，较安全。

表10JMM6对于人正常肝细胞chang liver的MTT实验结果

Claims

1.一种核桃楸树皮提取物，其特征在于由以下方法步骤制备获得：（1）将核桃楸树皮用质量分数70~75%的乙醇溶液回流提取3.5~5.5h，蒸发回收乙醇获得浓缩液，再在浓缩液中加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，获得萃取液；（2）将萃取液干燥后，通过硅胶柱层析分离，所采用的洗脱剂为体积比3:2~0:1的氯仿：甲醇溶液，获得洗脱液；

其中，步骤（1）所述的核桃楸树皮是干燥的，其重量与所述乙醇溶液体积之间的比例为300~800g:5000ml；

步骤（1）所述的浓缩液是稠膏状的，在浓缩液中加入的水的量相当于浓缩液的4~7倍体积；

步骤（1）所述的乙酸乙酯的用量相当于浓缩液的25~45倍体积；

步骤（2）所述的萃取液干燥是通过以下方法实现：将萃取液蒸馏至干得到乙酸乙酯提取物，将按重量分数计为20份的乙酸乙酯提取物与70~130份甲醇混合溶解，并加入20~60份硅胶，研磨后，于40~60℃下干燥7~8小时。

2.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物，其特征在于步骤（1）用所述乙酸乙酯进行萃取时，采用分次萃取，共萃取5~10次。

3.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物，其特征在于步骤（2）所述的洗脱剂为体积比5:4~1:8的氯仿：甲醇混合液。

4.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物，其特征在于步骤（2）所述的洗脱剂为体积比1:1的氯仿：甲醇混合液。

5.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物在制备抗癌药物方面的应用。

6.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物在制备抗肝癌药物方面的应用。