CN101366827A - 核桃楸皮提取物及其制备方法 - Google Patents

核桃楸皮提取物及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101366827A
CN101366827A CNA2008100135959A CN200810013595A CN101366827A CN 101366827 A CN101366827 A CN 101366827A CN A2008100135959 A CNA2008100135959 A CN A2008100135959A CN 200810013595 A CN200810013595 A CN 200810013595A CN 101366827 A CN101366827 A CN 101366827A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tumor
group
acid
pyranglucoside
bark extract
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2008100135959A
Other languages
English (en)
Inventor
张秀君
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DANDONG MEDICINE GROUP Co Ltd
Original Assignee
DANDONG MEDICINE GROUP Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DANDONG MEDICINE GROUP Co Ltd filed Critical DANDONG MEDICINE GROUP Co Ltd
Priority to CNA2008100135959A priority Critical patent/CN101366827A/zh
Publication of CN101366827A publication Critical patent/CN101366827A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

核桃楸皮提取物，主要药用活性成份有：8－羟基－9，10－蒽醌－1－羧酸、regiolone、4，5，8－三羟基－α－萘酮－3－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、4，5，8－三羟基－α－萘酮－3－O－(6′－O－没食子酰基)－β－D－吡喃葡萄糖苷、1－(4’－羟基苯基)－7－(3”－甲氧基－4”－羟基苯基)庚烷－3－醇、4－羟基－2，6－二甲氧基苯酚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、4－羟基－2，6－二甲氧基苯酚－1－O－(6′－O－没食子酰基)－β－D－吡喃葡萄糖苷、香草酸－4－O－(6′－O－没食子酰基)－β－D－吡喃葡萄糖苷、香草醛、香草酸、没食子酸、丁香酸、山萘酚、槲皮素、杨梅普和槲皮苷。上述核桃楸皮提取物对于治疗肝病和抑制肿瘤生长上具有良好效果，特别是对于肝癌细胞具有直接杀伤作用。

Description

核桃楸皮提取物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种中药，具体是涉及一种核桃楸皮提取物—楸皮素及其制备方法。
背景技术
核桃楸(Juglans mandshurica Maxim)为胡桃科胡桃属落叶乔木，是东北阔叶红松林的重要伴生树种，也是东北著名的三大硬阔之一，主要分布于我国东北地区。核桃楸是我国珍惜保护植物。
近年来，肝病发病率占各种传染病法定报告第一位。全球携带乙肝病毒的人数超过2.8亿。我国是肝病高发区，乙肝病毒携带者超过0.93亿，患者人数超过1000万，其中25—40％以上发展为肝硬化或肝癌，世界卫生组织把肝炎、癌症、爱滋病列为威胁人类生存的三大“杀手”。
目前，西医治疗肝病的方法主要有两种：一种是使用能抑制病毒复制的药物，如干扰素、拉米夫定等，这些物药对症性强，治疗效果明显，但停药后易复发，甚至有时会转为不可逆的严重后果。另一种方法就是手术，这主要是针对癌症患者。术后化疗，对患者伤害更大。由于西医西药在这方面没有更理想的方法，人们把目光投向中医中药。
发明内容
本发明的目的，是提供一种用于治疗肝病，特别是肝癌的核桃楸皮提取物—楸皮素。
本发明的另一目的，是提供一种核桃楸皮提取物楸皮素的生产方法。
技术方案是：
核桃楸皮提取物的中药用活性成分主要有：8-羟基-9，10-蒽醌-1-羧酸、regiolone、4，5，8-三羟基-α-萘酮-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4，5，8-三羟基-α-萘酮-3-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、1-(4’-羟基苯基)-7-(3”-甲氧基-4”-羟基苯基)庚烷-3-醇、4-羟基-2，6-二甲氧基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-羟基-2，6-二甲氧基苯酚-1-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、香草酸-4-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、香草醛、香草酸、没食子酸、丁香酸、山萘酚、槲皮素、杨梅普和槲皮苷。
核桃楸皮提取物的用途：
民间常用核桃楸皮煮水喝，用以治疗胸胁涨满，口苦咽干等症状。在这个基础上，我们对核桃楸皮的提取物进行研究，确定化学成份和药理实验。
对核桃楸皮提取物进行动物实验表明：与模型对照组相比，参试药物(15mg·kg-1)对小鼠S180肉瘤的生长有显著的抑制作用，抑制率达到40％以上，给药组瘤量均有减轻，与模型对照组相比有显著差异(P<0.05或P<0.01)。经过长时间反复多次实验，不仅具有肿瘤的抑制作用，提示与化疗药物希罗达比较，CLI在整体动物抑瘤试验中，未发现发挥抑瘤作用的剂量对外周白细胞数有显著影响。通过药理实验重点研究核桃楸皮提取物时，肝癌H22荷瘤小鼠的瘤体增长有显著的抑制作用。体外试验表明，该药对肝癌细胞有直接杀伤作用，而对正常细胞没有损伤。
核桃楸皮提取物可制成胶囊剂、片剂、丸剂、针剂及其粉针剂，使用方便，治疗肝病及其癌症，疗效确切。
服用方法：
口服，每日两次，每次2片/粒/丸(针剂每次1针/瓶)，含楸皮素7—15mg。
核桃楸皮提取物的制备方法，是取核桃楸皮100kg粉成粗粉(或破碎成小块)，加入6—8倍量溶剂：乙醇(或水)，乙醇质量浓度为70—95％(水为饮用水)，加热回流三次(水提为加热提取)，加热温度为80—90℃(水提100℃)，每次1小时(水提3小时)，过滤，50-60℃减压浓缩至每1ml含药材0.5-1g的母液，经大孔吸附树脂分离纯化后，得棕黄色油状物200-300mg，收率为2‰-3‰。
具体实施方式
实施例一
核桃楸皮提取物的制备方法，是取核桃楸皮100kg磨成50—60目粗粉(或破碎成小块)，加入6—8倍饮用水，加热提取三次，温度为100℃，每次3小时，过滤，50-60℃减压浓缩至每1ml含药材0.5-1g的母液，经大孔吸附树脂分离纯化后，得棕黄色核桃楸皮提取物油状物200mg，收率为2‰。
实施例二
核桃楸皮提取物的制备方法，是取核桃楸皮100kg磨成40—50目粗粉(或破碎成小块)，加入6倍量乙醇，乙醇浓度为70％，加热回流三次，加热温度为80—90℃，每次1小时，过滤，50-60℃减压浓缩至每1ml含药材0.5-1g的母液，经大孔吸附树脂分离纯化后，得棕黄色核桃楸皮提取物油状物200mg，收率为2‰。
实施例三
核桃楸皮提取物的制备方法，是取核桃楸皮100kg磨成粗粉(或破碎成小块)，加入7倍量乙醇，乙醇浓度为80％，加热回流三次，加热温度为80—90℃，每次1小时，过滤，50-60℃减压浓缩至每1ml含药材0.5-1g的母液，经大孔吸附树脂分离纯化后，得棕黄色核桃楸皮提取物油状物250mg，收率为2.5‰。
实施例四
核桃楸皮提取物的制备方法，是取核桃楸皮100kg粉成粗粉(或破碎成小块)，加入8倍量乙醇，乙醇浓度为95％，加热回流三次，加热温度为80—90℃，每次1小时，过滤，50-60℃减压浓缩至每1ml含药材0.5-1g的母液，经大孔吸附树脂分离纯化后，得棕黄色核桃楸皮提取物油状物300mg，收率为3‰。
核桃楸皮提取物化学成分组成
经溶剂分步萃取，反复硅胶柱色谱，聚酰胺柱色谱，ODS，Sephadex LH-20，制备薄层和反复重结晶等手段得到18个化合物，通过理化常数测定和光谱数据分析等手段鉴定其中的16个化合物的结构，分别为：(1)8-羟基-9，10-蒽醒-1-羧酸、(2)regiolone、(3)4，5，8-三羟基-α-萘酮-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、(4)4，5，8-三羟基-α-萘酮-3-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、(5)1-(4’-羟基苯基)-7-(3”-甲氧基-4”-羟基苯基)庚烷-3-醇、(6)4-羟基-2，6-二甲氧基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、(7)4-羟基-2，6-二甲氧基苯酚-1-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、(8)香草酸-4-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、(9)香草醛、(10)香草酸、(11)没食子酸、(12)丁香酸、(13)山萘酚、(14)槲皮素、(15)杨梅普和(16)槲皮苷。其中化合物1为一新天然产物，其中化合物6，7和8为属内首次分离得到，2，9，12，13和14为本植物内首次分离得到。鉴别情况如下：
化合物1，8-hydroxy-9，10-anthraquinone-1-carboxylic acid
黄色针晶(EtOH-H2O)，1H-NMR和13C-NMR。
化合物2，regiolone
白色结晶，10％硫酸-乙醇显色为绿色斑点(薄层硅胶)，365nm下为明显的绿色荧光。UVλmax(MeOH，nm)：222，260，340。UVλmax(MeCN，nm)：222，260，340。CD，Δε(λmax，0.1mg/ml，MeCN)：Δε＝+1600(219nm)，Δε＝+400(260nm)，Δε＝+50(340nm)。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)，δ：12.42(1H，s，OH-8)，7.55(1H，t，H-6)，7.08(1H，d，J＝7.5Hz，H-5)，6.85(1H，d，J＝8.2Hz，H-7)，5.64(1H，d，J＝5.8Hz，OH-4)，4.76(1H，m，H-4)，2.76(2H，m，CH2-2)，2.2(1H，dddd，H-3β)，2.0(1H，dddd，H-3α)。13C-NMR，δ205.4(C-1)，161.6(C-8)，148.8(C-4a)，136.9(C-6)，117.5(C-5)，115.9(C-7)，115.1(C-8a)，66.1(C-4)，35.4(C-2)，31.6(C-3)。
化合物3，4，5，8-trihydroxy-α-tetralone-5-O-β-D-glucopyranoside
无定形粉末，365nm下呈亮黄色荧光，10％硫酸-乙醇显色为绿色斑点(薄层硅胶)。ESI-MS：354.9[M-H]-，391.0[M+Cl]-，379.1[M+Na]+。UVλmax(MeOH，nm)：230，263，356。CD，Δε(λmax，0.01mg/ml，MeOH)：Δε＝-25(225nm)，Δε＝-5(260nm)，Δε＝-3(355nm)。1H-NMR和13C-NMR。
化合物4，4，5，8-trihydroxy-α-tetralone-5-O-β-D-(6’-O-galloyl)glucopyranoside
无定形粉末，365nm下呈亮黄色荧光，10％硫酸-乙醇显色为绿色斑点(薄层硅胶)。ESI-MS：507.0[M-H]-，542.9[M+Cl]-，531.1[M+Na]+。1H-NMR和13C-NMR。
化合物5，1-(4’-hydroxyphenyl)-7-(3”-methoxy-4”-hydroxyphenyl)hepta-3-ol
黄色油状固体，ESI-MS：329.0[M-H]-，353.2[M+Na]+，354.2[M+Na+H]+；329.0[M-H]-的二级负离子：313.9，286.9，220.8，206.8，192.9，134.8；353.2[M+Na]+的二级正离子：337.2，313.2，219.1，189.1，137.0，121.0。1H-NMR和13C-NMR。。
化合物6，4-hydroxy-2，6-dimethoxyphenol1-O-β-D-glucopyranoside
无色结晶(MeOH-H2O)，ESI-MS：330.9[M-H]-，366.9[M+Cl]-，355.1[M+Na]+；1H-NMR和13C-NMR。
化合物7，4-hydroxy-2，6-dimethoxyphenol-1-β-D-(6’-O-galloyl)glucopyranoside
无色针晶(MeOH-H2O)，ESI-MS：483.0[M-H]-，518.9[M+Cl]-，485.1[M+H]+，507.1[M+Na]+。1H-NMR和13C-NMR。
化合物8，Vanillic acid-4-O-β-D-(6’-O-galloyl)glucopyranoside
无色结晶(MeOH)，ESI-MS：481.0[M-H]-，505.1[M+Na]+。1H-NMR和13C-NMR。
化合物9，Vanillin
白色针晶(MeOH)，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性。1H-NMR，δ10.23(1H，br.s，OH-4)，9.77(1H，s，CHO)，7.43(1H，dd，J＝8.0，1.8Hz，H-6)，7.38(1H，d，J＝1.8Hz，H-5)，6.95(1H，d，J＝8.0Hz，H-2)，3.83(3H，s，OCH3).13C-NMR，δ191.1(CHO)，153.1(C-4)，148.2(C-3)，128.7(C-1)，126.2(C-2)，115.5(C-6)，110.7(C-5)，55.7(OCH3)。
化合物10，Vanillic acid
白色针晶(MeOH)。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，溴酚蓝反应阳性。1H-NMR(DMSO-d6)δ：12.50(1H，brs，COOH)，9.85(1H，brs，OH-4)，7.44(1H，dd，J＝8.7Hz，1.8Hz，H-6)，7.43(1H，d，J＝1.8Hz，H-2)，6.84(1H，d，J＝8.7Hz，H-5)，3.81(3H，s，OCH3-3)。
化合物11，Gallic acid
无色针晶，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，溴甲酚绿反应阳性。1H-NMR(DMSO-d6)δ：12.30(1H，br.s，COOH)，9.20(3H，br.s，OH-3，4，5)，6.91(2H，s，H-2，6)。
化合物12，Syringic acid
无色针晶，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，溴酚蓝反应阳性。1H-NMR(DMSO-d6)δ：12.40(1H，br.s，COOH)，9.12(1H，br.s，OH-4)，7.20(2H，s，H-2，6)，3.80(6H，s，OCH3-3，5)。13C-NMR，δ168.0(COOH)，122.6(C-1)，106.8(C-2，6)，147.3(C-3，5)，139.5(C-4)，55.9(OCH3-3，5)。
化合物13，Kaempferol
淡黄色粉末，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，盐酸镁粉反应阳性。1H-NMR，δ12.49(1H，br.s，OH-5)，10.70(1H，br.s，OH-7)，10.11(1H，br.s，OH-4’)，9.42(1H，br.s，OH-3)，8.05(2H，d，J＝8.7Hz，H-2’，6’)，6.92(2H，d，J＝8.7Hz，H-3’，5’)，6.44(1H，s，H-8)，6.19(1H，s，H-6)。
化合物14，Quercetin
黄绿色粉末，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，盐酸镁粉反应阳性。1H-NMR(DMSO-d6)δ：12.51(1H，brs，OH-5)，10.09(1H，brs，OH-7)，9.37(3H，brs，OH-3，3′，4′)，7.68(1H，d，J＝1.9Hz，H-2′)，7.55(1H，dd，J＝8.5Hz，1.9Hz，H-6′)，6.92(1H，d，J＝8.5Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J＝1.7Hz，H-8)，6.19(1H，d，J＝1.7Hz，H-6)。
化合物15，Myricitrin
淡黄色粉末，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，三氯化铝反应在紫外下荧光加强。1H-NMR，δ12.67(1H，s，OH-5)，8-10(several protons，p-OH)，6.96(2H，s，H-2’，6’)，6.36(1H，d，J＝1.9Hz，H-8)，6.20(1H，d，J＝1.9Hz，H-6)，5.19(1H，s，H-1”)，3-5(several protons，H-2”-4”)，0.84(3H，d，J＝6Hz，CH3-5”)。13C-NMR，δ157.5(C-2)，134.3(C-3)，177.8(C-4)，161.4(C-5)，98.7(C-6)，164.3(C-7)，93.5(C-8)，156.5(C-9)，104.0(C-10)，119.6(C-1’)，107.9(C-2’)，145.8(C-3’)，136.5(C-4’)，145.8(C-5’)，107.9(C-6’)，102.0(C-1”)，70.5(C-2”)，70.6(C-3”)，71.3(C-4”)，70.1(C-5”)，17.6(C-6”)。
化合物16，Quercitrin
淡黄色粉末，三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，三氯化铝反应在紫外下荧光加强。1H-NMR，δ12.65(1H，s，OH-5)，7.26(1H，br.s，H-2′)，7.22(1H，br.d，J＝8.0Hz，H-6′)，6.82(1H，br.d，J＝8.0Hz)，6.41(1H，br.d，H-8)，6.19(1H，br.d，H-6)，5.25(1H，s，H-1”)，3-5(several protons，H-2”-4”)，0.81(3H，d，J＝5.7Hz，CH3-5”)。13C-NMR，δ156.5(C-2)，133.8(C-3)，177.0(C-4)，161.1(C-5)，99.3(C-6)，164.0(C-7)，93.8(C-8)，156.6(C-9)，104.0(C-10)，120.9(C-1’)，115.2(C-2’)，146.0(C-3’)，115.2(C-4’)，149.0(C-5’)，120.9(C-6’)，101.7(C-1”)，70.3(C-2”)，70.4(C-3”)，71.2(C-4”)，70.0(C-5”)，17.4(C-6”)。
核桃楸皮提取物楸皮素药效学
通过制备小鼠肉瘤S180、肝癌H22、肝癌Hca-F瘤株荷瘤小鼠模型，分别考察楸皮素不同剂量对荷瘤小鼠的抑瘤作用，结果表明：楸皮素7.5、15mg·kg-1连续灌胃给药7天对小鼠肉瘤S180、小鼠肝癌Hca-F荷瘤小鼠均有显著抑瘤作用；且抑瘤作用呈现量效关系。楸皮素15mg·kg-1对小鼠肝癌H22荷瘤小鼠有显著的抑瘤作用，3.75、7.5mg·kg-1对其有一定的抑瘤作用趋势，但无统计学意义。通过与环磷酰胺联合用药发现，与楸皮素单独用药时比较，楸皮素3.75、7.5、15mg·kg-1连续灌胃给药7天与CTX联合应用时，对肉瘤S180模型小鼠抑瘤率均有一定提高作用，且15mg·kg-1与CTX联合应用时，抑瘤呈现相加作用。通过体外制备Hela细胞(人宫颈癌细胞)、7402BEL(人肝癌细胞)和Hca-F细胞(小鼠腹水型肝癌细胞)，应用MTT检测方法分别对待测药物组、阳性药对照组和正常对照组(1640培养液)进行抑制肿瘤细胞能力的观察。试验结果显示：在所选择的剂量范围内，楸皮素对Hela细胞、7402BEL细胞及Hca-F细胞均具有显著抑制作用。研究还发现，楸皮素15mg·kg-1连续灌胃给药7天对小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠外周血白细胞数有显著升高作用，3.75、7.5mg·kg-1有一定的升高作用趋势，但无统计学意义。提示楸皮素在所选剂量范围内连续用药未发现对荷瘤小鼠骨髓有抑制作用。楸皮素15mg·kg-1连续灌胃给药7天可显著提高环磷酰胺致免疫功能低下小鼠脾脏脏器系数和碳粒廓清指数，由此可见，楸皮素在体内抗肿瘤的同时，对网状内皮系统的吞噬功能影响较小，不损伤小鼠的非特异免疫功能。
一、抗肿瘤作用
(一)整体动物试验
试验目的  考察核桃楸皮提取物楸皮素的体内抗肿瘤作用和联合化疗药物用药是否产生协同抗肿瘤作用。
试验方法与结果
1.对小鼠肉瘤S180的抑制作用
试验方法
体外复苏小鼠肉瘤S180瘤株细胞，复苏三代，用无菌生理盐水稀释，选取健康小鼠，每只用上述细胞悬液0.2ml腹腔注射，约一周后接种小鼠腹部明显涨大，抽取腹水，在无菌试管中用无菌生理盐水稀释瘤细胞数浓度为2×107个/ml。用上述腹水稀释液对购进昆明种小鼠进行接种，于腋窝处消毒皮肤后每只皮下接种0.2ml，建立小鼠肉瘤S180荷瘤模型[1][2][3]。
将荷瘤小鼠随机分组，每组10只，分别为模型对照组，楸皮素低、中、高给药组(3.75、7.5、15mg·kg-1)，参一胶囊组(10mg·kg-1)，复方木鸡合剂组(10ml·kg-1)，希罗达组(1000mg·kg-1)。自造模24小时后连续灌胃给药7天，每日1次，给药容积20ml·kg-1[4][5]。
本次给药24h后，颈椎脱臼法处死动物，解剖剥离瘤块，电子天平称瘤重。根据下面公式计算抑瘤率：
抑瘤率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
实验数据以平均值±标准差(χ±SD)表示。
试验结果
与模型对照组比较，楸皮素7.5、15mg·kg-1连续灌胃给药7天对小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠有显著的抑瘤作用：楸皮素3.75mg·kg-1有一定的抑瘤作用趋势，但无统计学意义。实验共做3次，高剂量组抑制率均达到30％以上。结果见表1。
表1  楸皮素对小鼠肉瘤S180的抑制作用
Figure A200810013595D00091
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
2.对小鼠肝癌Hca-F的抑制作用
试验方法
体外常规复苏小鼠肝癌Hca-F瘤株细胞，其它同上。
试验结果
与模型对照组比较，楸皮素7.5、15mg·kg-1连续灌胃给药7天对小鼠肝癌Hca-F荷瘤小鼠有显著的抑瘤作用；楸皮素3.75mg·kg-1有一定的抑瘤作用趋势，但无统计学意义。实验共做3次，高剂量组抑瘤率均达30％以上。结果见表2
表2  楸皮素对小鼠肝癌Hca-F的抑制作用
Figure A200810013595D00101
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
3.对小鼠肝癌H22的抑制作用
试验方法
体外常规复苏小鼠肝癌H22瘤株细胞，其它同上。
试验结果
与模型对照组比较，楸皮素7.5、15mg·kg-1连续灌胃给药7天对小鼠肝癌H22荷瘤小鼠有显著的抑瘤作用；3.75mg·kg-1有一定的抑瘤作用趋势，但无统计学意义。实验共做3次，高剂量组抑瘤率均达30％以上。结果见表3。
表3  楸皮素对小鼠肝癌H22的抑制作用
Figure A200810013595D00102
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
4.与化疗药物环磷酰胺(CTX)联合应用对小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠的抑瘤作用试验方法
将接种24h后小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠随机分为8组，每组10只。即模型对照组、CTX(10mg·kg-1)、楸皮素低、中、高剂量组(3.75、7.5、15mg·kg-1)、楸皮素低+CTX、中+CTX、高+CTX剂量组，剂量分别为(3.75+10、7.5+10、15+10mg·kg-1)。其中，CTX组于接种后24小时后起第1、3、5、7天腹腔注射给药，给药容积为0.1ml/10g，每天给药1次，共给药4次。楸皮素于瘤株接种后24小时起开始灌胃给药，每天给药1次，连续给药7天。楸皮素各剂量合并CTX组于接种后24小时起按上述给药方法灌胃给各剂量楸皮素和腹腔注射CTX。第8天处死动物，剥取瘤块称重，根据公式(1)、(2)分别计算抑瘤率、Q值。根据Q值来判断联合用药疗效，Q<0.85为拮抗，Q介于0.85～1.5之间为相加，Q>1.15为协同[6][7]。
(1)抑瘤率＝(1—给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
(2)Q值＝E(A+B)/[EA+EB(1—EA)]，(其中EA、EB、E(A+B)分别表示受试药物组、CTX组及联合用药组的抑瘤率)[7]。
试验结果
与楸皮素单独用药时比较，楸皮素各剂量与CTX联合应用时，联合应用对肉瘤S180荷瘤小鼠抑瘤率均有一定提高作用，且高剂量与CTX联合用药时，Q＝0.86，抑瘤呈相加作用。结果见表4
表4  楸皮素与环磷酰胺(CTX)联合用药对小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠的抑瘤作用
Figure A200810013595D00111
与模型组比较*P<0.05**P<0.01
Q低＝0.65，Q中＝0.76，Q高＝0.86
(二)体外试验
试验目的  考察受试物在体外对Hela细胞、7402BEL细胞和Hca-F细胞增殖的影响。
试验方法和结果：
1.分组及细胞制备：
1.1分组
楸皮素(剂量：100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml)阳性药组(甘迪克)(剂量：100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、
3.125μg/ml、1.56μg/ml)
二甲基亚砜组(50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.56％)
1.2细胞株制备：
1.2.1Hela细胞及7402BEL细胞(人肝癌细胞)的制备
1)取对数生长期的Hela细胞及7402BEL细胞，0.125％胰蛋白酶消化。用培养液调整细胞浓度至2×105/ml。
2)取96孔培养板，每孔加入100μl细胞悬液，置37℃，5％CO2孵育24h。
1.2.2Hca-F细胞(小鼠腹水型肝癌细胞)的制备
1)无菌抽取小鼠腹水，生理盐水洗涤离心。用培养液调整细胞浓度至1×106/ml。
2)取96孔培养板，每孔加入100μl细胞悬液，置37℃，5％CO2孵育24h。
2.检测方法及结果分析：
2.1MTT法
1)倍比稀释待测样品及阳性药。吸去细胞培养上清，每孔分别加入100μl待测样品及阳性药，各设3个复孔，对照孔加1640生长液，并设空白对照组，37℃，5％CO2孵育24h，见表5
表5
 
楸皮素μg/ml 阳性药μg/ml 二甲基亚砜％
100 100 50
50 50 25
25 25 12.5
12.5 12.5 6.25
6.25 6.25 3.125
3.125 3.125 1.56
1.56 1.56 0.78
1640对照 空白对照
注：每个浓度设3个复孔。
培养20h后，每孔加入MYY10μl(MTT浓度，5mg/ml，用PBS配制)，继续培养4h。1000r/min离心10min，弃上清，每孔加入二甲基亚砜10μl，在微量震荡器上缓慢振荡10min，用酶标仪测定波长570mm处的OD值。2.2数据处理与结果分析：
抑瘤率＝(对照孔OD值-实验孔OD值)/对照孔OD值肿瘤细胞对药物的抑制敏感度见表6-8(为三次相同试验结果之一)。
表6 待测药物对Hela细胞的抑制作用
 
浓度     原料药％      阳性药％     浓度      二甲基亚砜％
100     39.70368      27.28483       50       93.3078150      25.88647      18.89462       25       89.0794125      12.28567      7.907441       12.5     58.9811912.5    9.072748      9.572166       6.25     22.274016.25    5.260529      12.95156       3.125    28.217083.125   5.710005      14.08357       1.56     16.996841.56    5.809888      10.854         0.8      8.872982
注：细胞数为2×105/ml，每个浓度设3个复孔。
表7 待测药物对Hca-F细胞的抑制作用
 
浓度     楸皮素％     阳性药％     浓度％     二甲基亚砜％
100      4.59364      12.72085      50         59.7173150       31.30742     23.88693      25         31.1660825       39.82332     33.9576       12.5       34.0282712.5     39.29329     27.80919      6.25       15.159016.25     39.92933     35.58304      3.125      14.275623.125    34.80565     40.81272      1.56       24.06361.56     34.16961     52.57951      0.8        23.4629
注：细胞数为1×106/ml，每个浓度设3个复孔。
表8 待测药物对7402BEL细胞的抑制作用
 
浓度      楸皮素％     阳性药％      浓度％      二甲基亚砜％
100       -11.1014     34.96503      50          78.6713350        -36.8881     -2.66608      25          70.4545525        -45.7168     7.692308      12.5        65.5594412.5      -52.2727    -21.4161       6.25        49.912596.25      -13.8112    -20.3671       3.125       31.905593.125     -3.23427    -15.2972       1.56        13.19931.56      20.62937    3.671329       0.8         13.02448
注：细胞数为2×105/ml，每个浓度设3个复孔。
试验结论：
楸皮素在100μg/ml、50μg/ml剂量时对Hela细胞具有一定的抑制作用(中度敏感)；在1.56μg/ml剂量时对7402BEL细胞具有一定的抑制作用(中度敏感)；在50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml剂量时对Hca-F细胞具有显著的抑制作用(敏感)。
二、升白作用
试验目的考察核桃楸皮提取物楸皮素在发挥治疗作用同时，对荷瘤小鼠外周血白细胞数的影响。
试验方法
小鼠肉瘤S180复苏、接种同前，将小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠随机分8组，每组10只。分别为正常对照组、模型对照组，楸皮素低、中、高剂量组(3.75、7.5、15mg·kg-1)，参一胶囊组(10mg·kg-1)，复方木鸡合剂组(10ml·kg-1)，希罗达组(1000mg·kg-1)。其中，希罗达组自造模24h后起第1、3、5、7天给药，其余自造模24h后连续给药7天，每日一次。给药途径均为灌胃给药。于末次给药24h后各组小鼠眼眶后静脉丛采血20μl，在OLYMPLS-BH2显微镜下用常规血白细胞计数法进行计数[8][9]。
试验结果
与模型组比较：楸皮素15mg·kg-1连续灌胃给药7天，对小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠外周血白细胞数有显著提高作用；3.75、7.5mg·kg-1对外周血白细胞数有一定升高作用趋势，但无统计学意义。结果见表9。
表9  楸皮素对小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠外周血白细胞的影响
 
组别             剂量         动物数           白细胞数(×109·L-1)(mg·kg-1)                          (χ±SD)
正常             —             10                 7.97±0.64模型             —             10                 8.32±1.57楸皮素          3.75            10                 8.53±1.997.5             10                 9.47±1.53*#15              10                 10.31±2.09#**参一           10              10                 8.86±1.55复方木鸡      10ml·kg-1       10                 8.56±1.29希罗达         1000             10                2.95±0.76###***
与正常组比较#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
三、对机体非特异性免疫功能的影响
试验目的考察核桃楸皮提取物楸皮素对机体非特异性免疫功能的影响。
试验方法
选取健康昆明种小鼠70只，随机分为7组，每组10只。分别为正常对照组，模型对照组，楸皮素低、中、高剂量给药组(3.75、7.5、15mg·kg-1)，参一胶囊组(10mg·kg-1)，复方木鸡合剂组(10ml·kg-1)。接种第二天开始除正常对照组外，各组连续灌胃给药7天。于给药第5天开始，其余各组荷瘤小鼠腹腔注射环磷酰胺(CTX50mg·kg-1)，每日一次，连续给药3天。末次给药后1h，每只鼠尾静脉注射印度墨汁(1：4生理盐水稀释)0.1ml/10g，分别于注射墨汁后2min、12min后于眼眶后静脉丛采血20μl，立刻吹入0.1％Na2CO3溶液2ml中，摇匀，680nm测吸光度。脱臼处死动物，取胸腺、肝脏和脾脏称重，计算脏器指数(mg/g)，按下式计算廓清指数K和吞噬指数α：
K＝(logA1-logA2)/(T2-T1)
α＝3√K×体重/(肝重+脾重)
(其中A1为第1次采血的吸光度，A2为第2次采血的吸光度，T1为第1次采血的时间，T2为第2次采血的时间)
试验结果
结果显示，模型对照组与正常对照组比较，廊清指数K和吞噬指数α显著下降，胸腺、脾脏系数显著减小，表明造模后细胞非特异免疫水平降低。与模型对照组比较，楸皮素7.5、15mg·kg-1剂量组脾脏系数显著升高，胸腺系数呈现一定的升高作用趋势。提示与化疗药物比较，楸皮素在体内抗肿瘤的同时，对网状内皮系统的吞噬功能影响较小，不损伤小鼠的细胞非特异免疫功能。结果见表10。
表10 楸皮素对免疫功能低下小鼠碳粒廓清和免疫器官指数的影响
组别    剂量     动物数     廓清指数           吞噬指数     胸腺系数            脾脏系数
     (mg·kg-1)                                              (mg/g)             (mg/g)
正常     —        10      0.013±0.003       3.279±1.2627  2.153±0.427       4.935±0.358
模型     —        10      0.007±0.003△△△  2.617±0.999△ 0.754±0.199△△△  2.364±0.286△△△
         3.75      10      0.009±0.003△△△  2.529±0.925   0.766±0.224△△△  2.628±0.438
楸皮素   7.5       10      0.011±0.003△△△* 2.849±1.050   0.846±0.225△△△  2.754±0.382*
         15        10      0.011±0.003△△△* 2.924±1.132   0.924±0.222△△△  2.803±0.474*
参一     10        10      0.012±0.003*       3.182±1.127   1.046±0.222△△△* 2.680±0.453*
复方木鸡 10ml      10      0.015±0.004*       3.306±1.251   0.786±0.228△△△  2.449±0.292
与正常组比较△P<0.05，△△△P<0.001
与模型组比较*P<0.05，**P<0.01
试验结论
1.与模型组比较，楸皮素7.5、15mg·kg-1连续灌胃给7天对小鼠肉瘤S180、小鼠肝癌Hca-F荷瘤小鼠均有显著抑瘤作用；且抑瘤作用呈现量效关系。3.75·kg-1有一定的抑制作用趋势，但无统计学意义。
2.与模型组比较，15mg·kg-1连续灌胃给药7天对小鼠肝癌H22荷瘤小鼠有显著抑瘤作用；3.75、7.5mg·kg-1有一定的抑制作用趋势，但无统计学意义。
3.与溶剂对照组比较，楸皮素(剂量均为：100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml)在体外对Hela细胞、7402BEL细胞及Hca-F细胞增殖均具有显著抑制作用。
4.与楸皮素单独用药时比较，楸皮素3.75、7.5、15mg·kg-1连续灌胃给药7天与CTX联合应用时，对肉瘤S180模型小鼠抑瘤率均有一定提高作用，且高剂量组抑瘤呈现相加作用。
5.与模型组比较，楸皮素15mg·kg-1连续灌胃给药7天对小鼠肉瘤S180荷瘤小鼠外周血白细胞数有显著升高作用，提示楸皮素在所选剂量范围内连续用药未发现对荷瘤小鼠骨髓有抑制作用。
6.楸皮素7.5、15mg·kg-1连续灌胃给药7天可显著提高环磷酰胺致免疫功能低下小鼠脾脏系数，并显著提高碳廓清指数；对胸腺系数有一定的升高作用趋势，但无统计学意义。
药效学比较研究显示：对荷瘤动物模型，多种细胞瘤株模型进行体内外抗肿瘤效研究，抑瘤率在30％-42.7之间，抗癌效果比复方木鸡合剂和目前市场上抗癌新药参一胶囊均高，与抗癌化药希罗达效果相当。
※粗粉：指能全部通过二号筛，但混有能通过四号筛不超过40％的粉末(二号筛24目，四号筛65目)。

Claims (3)

1.核桃楸皮提取物，其特征在于主要药用活性成分有8-羟基-9，10-蒽醌-1-羧酸、regiolone、4，5，8-三羟基-α-萘酮-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4，5，8-三羟基-α-萘酮-3-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、1-(4’-羟基苯基)-7-(3”-甲氧基-4”-羟基苯基)庚烷-3-醇、4-羟基-2，6-二甲氧基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4-羟基-2，6-二甲氧基苯酚-1-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、香草酸-4-O-(6′-O-没食子酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷、香草醛、香草酸、没食子酸、丁香酸、山萘酚、槲皮素、杨梅普和槲皮苷。
2.根据权利要求1所述的核桃楸皮提取物，其特征是能制成胶囊剂、片剂、丸剂、针剂及其粉针剂。
3.根据权利要求1所述的核桃楸皮提取物的制备方法，其特征是取核桃楸皮100kg磨成粗粉或破碎成小块，加入6—8倍量溶剂，溶剂为乙醇或水，溶剂采用乙醇时，乙醇质量浓度为70—95％，加热回流三次，加热温度为80—90℃，每次1小时；溶剂采用水时，加热提取三次，加热温度为100℃，每次水提2—3小时；将乙醇提取或水提取所得药液过滤，50-60℃减压浓缩至每1ml含药材0.5-1g的母液，经大孔吸附树脂分离纯化后，得棕黄色油状物200-300mg，收率为2‰-3‰。
CNA2008100135959A 2008-10-09 2008-10-09 核桃楸皮提取物及其制备方法 Pending CN101366827A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2008100135959A CN101366827A (zh) 2008-10-09 2008-10-09 核桃楸皮提取物及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNA2008100135959A CN101366827A (zh) 2008-10-09 2008-10-09 核桃楸皮提取物及其制备方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2011103214009A Division CN102349943A (zh) 2008-10-09 2008-10-09 核桃楸皮提取物及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101366827A true CN101366827A (zh) 2009-02-18

Family

ID=40410919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2008100135959A Pending CN101366827A (zh) 2008-10-09 2008-10-09 核桃楸皮提取物及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101366827A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101786952A (zh) * 2010-02-10 2010-07-28 东北师范大学 一种蒽醌类化合物及其赖氨酸盐的制备方法及医药用途
CN102274279A (zh) * 2011-06-29 2011-12-14 广东药学院 一种核桃楸树皮提取物及其在制备抗癌药物方面的应用
CN102626113A (zh) * 2012-03-26 2012-08-08 王福 用核桃楸果实青皮及叶提取杀虫剂的方法
EP3135292A4 (en) * 2014-02-27 2018-01-24 Nakajima, Toshihiro Antiobesity agent containing walnut extract
CN109608419A (zh) * 2018-12-20 2019-04-12 哈尔滨医科大学 从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物及其制备方法和应用
CN111704639A (zh) * 2020-06-03 2020-09-25 江南大学 核桃分心木中酚酸葡萄糖苷类化合物的分离方法及应用

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101786952A (zh) * 2010-02-10 2010-07-28 东北师范大学 一种蒽醌类化合物及其赖氨酸盐的制备方法及医药用途
CN101786952B (zh) * 2010-02-10 2013-11-06 东北师范大学 一种蒽醌类化合物及其赖氨酸盐的制备方法及医药用途
CN102274279A (zh) * 2011-06-29 2011-12-14 广东药学院 一种核桃楸树皮提取物及其在制备抗癌药物方面的应用
CN102626113A (zh) * 2012-03-26 2012-08-08 王福 用核桃楸果实青皮及叶提取杀虫剂的方法
EP3135292A4 (en) * 2014-02-27 2018-01-24 Nakajima, Toshihiro Antiobesity agent containing walnut extract
CN109608419A (zh) * 2018-12-20 2019-04-12 哈尔滨医科大学 从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物及其制备方法和应用
CN109608419B (zh) * 2018-12-20 2023-01-13 哈尔滨医科大学 从青龙衣中提取的二芳基庚烷类化合物及其制备方法和应用
CN111704639A (zh) * 2020-06-03 2020-09-25 江南大学 核桃分心木中酚酸葡萄糖苷类化合物的分离方法及应用
US11384109B2 (en) 2020-06-03 2022-07-12 Jiangnan University Method for separating phenolic acid glucoside compounds from Diaphragma juglandis Fructu

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1421933B1 (en) Use of stilbene compounds in preparing medicaments for treating or preventing diabetes
JP4980305B2 (ja) 免疫細胞のインターフェロン産生を誘導し、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化する漢方生薬エキス
CN101366827A (zh) 核桃楸皮提取物及其制备方法
CN103768534B (zh) 一种具有抗肿瘤活性的中药组合物
CN102516344B (zh) 一种具有抗肿瘤活性的化合物及其制备方法和应用
CN102058609A (zh) 虎杖苷在制备抗肿瘤药物中的应用
WO2015192758A1 (zh) 瓦草五环三萜皂苷类化合物抗肿瘤的药物用途
CN104274489B (zh) 一种用于治疗肿瘤的联合用药物
CN111956776B (zh) 一种用于抗癌止吐减毒增效的汉麻药对及其制备方法
CN101926844B (zh) 瑞香狼毒提取物及其抗肿瘤作用
TWI610676B (zh) 神經細胞死抑制劑、抗阿茲海默症劑、抗腦機能減退劑、具有抗阿茲海默症作用或抗腦機能減退作用的醫藥品及神經細胞死抑制劑的製造方法
CN102349943A (zh) 核桃楸皮提取物及其制备方法
CN100486595C (zh) 姬松茸水溶性小分子提取物及其制备工艺和用途
CN101791363B (zh) 一种广谱抗癌植物药、其制备方法及其应用
CN1939396A (zh) 具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物及其制作方法
CN1977869A (zh) 一种藤梨根提取物及其抗癌用途
CN102309656B (zh) 具有防治癌症作用的中药组合物及其医药用途
KR101717057B1 (ko) 폐암 예방 또는 치료용 조성물
CN100589812C (zh) 冬虫夏草菌丝体抽提物的分离物及经口摄取用组合物
CN106008651A (zh) 一种硝酸异山梨酯的药物组合物及其医药用途
CN101574384A (zh) 以人参须为原料制备抗癌药物制剂与保健食品的生产方法
CN101732419A (zh) 一种水红花子提取物的用途及制备方法
CN110305094A (zh) 马齿苋中两种黄酮类化合物及其提取分离方法与用途
KR20140001319A (ko) 밀리타리스 동충하초 추출물 제조방법, 이에 따라 제조된 밀리타리스 동충하초 추출물을 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강보조식품
KR20150048366A (ko) 갓 추출물을 유효성분으로 함유하는 간독성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20090218