CN1939396A - 具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物及其制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物，其特征是：它是由中药材鸡血藤提取制备而成。其制备方法包括以下步骤：1)制作原料药，将中药材鸡血藤用水浸泡8－24小时，洗净泥土，取出，闷润8－12小时，至内外湿度一致；切片，晒干，过筛，制成原料药；2)水溶性提取；或3)醇溶性提取；4)聚酰胺柱层析纯化产物：将所述的水溶性提取物或醇溶性提取物加水溶解；上已处理好的聚酰胺柱，水洗至洗出液澄明后；换不同浓度乙醇洗脱，分别收集洗脱液。回收乙醇至无醇味，经水浴蒸干，真空干燥得各洗脱物。本发明鸡血藤提取物是用中药材鸡血藤提取制备的，用本发明方法获得的鸡血藤提取物对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，且毒副作用小。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤作用的中药鸡血藤，特别是具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物及其制作方法。
背景技术
鸡血藤为豆科(Leguminosae)植物密花豆(Spatholobus suberectus Dunn.)的干燥藤茎。古籍记载：其性温，味苦、甘，归肝、肾经，有补血、活血、通络之功效，为血分之圣药，多用于月经不调、血虚萎黄、麻木竣痪、风湿痹痛等症，是一种常用的中药材。
中国专利200510086165申请一种鸡血藤保健茶，辅助治疗肺痨久咳、风湿痹痛、风湿关节炎等。
鸡血藤化学成分复杂，药理作用多样。目前文献报道的鸡血藤主要含黄酮类、三萜类、甾醇类以及蒽醌类化合物，其中黄酮类成分最多，包括异黄酮类，如芒柄花素(Formononetin)、芒柄花甙(Ononin)、樱黄素(Prunetin)等；二氢黄酮类，如密花豆素；拟雌内酯类，如苜蓿内酯(medicagol)等；查尔酮类，如异甘草素(isoliquiritigenin)、2’，4’，3，4-四羟基查尔酮(2’，4’，3，4-tetrahydroxy chalcone)；花青素类，如表儿茶精(epicatechin)、原儿茶酸(procatechuisacid)、儿茶素(catechin)等。以往的研究表明，鸡血藤能扩张外周血管，降低血压；抑制血小板凝聚；降脂，抗动脉硬化；促进肾脏总磷代谢；对免疫系统有双向调节作用。近几年对鸡血藤刺激骨髓造血功能的研究较多，鸡血藤能升高因60Co照射和腹腔注射盐酸苯肼引起的骨髓抑制性贫血小鼠的红细胞、白细胞，并刺激BFU-E、CFU-E和CFU-GM的增殖。鸡血藤体内诱导制备的小鼠巨噬细胞、脾细胞、肺和骨骼肌体外条件培养液，能明显促进正常小鼠和贫血小鼠的骨髓细胞增殖，考虑与其直接或间接刺激造血微环境的基质细胞分泌较高活性的造血生长因子有关。但迄今为止尚未发现鸡血藤具有直接抑制肿瘤生长的作用。
发明内容
本发明的目的是提供具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物及其制作方法，鸡血藤提取物是用中药材鸡血藤制备的。用本发明方法提取的鸡血藤提取物具有抗肿瘤作用，特别是具有直接抗肿瘤作用。本发明的目的是按如下的技术方案实现的。本发明为具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物，其特征是：
它是由中药材鸡血藤提取制备而成的。所述的肿瘤细胞包括人高转移巨细胞肺癌PG、人肠腺癌HT-29、人肺腺癌A549、人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小肠上皮细胞癌IEC-6以及小鼠移植性Lewis肺癌。
其制作方法包括以下步骤：
1)制作原料药，将中药材鸡血藤去除杂质，粗细分开；用水浸泡8-24小时，洗净泥土，取出，闷润8-12小时，至内外湿度一致，切片，晒干，过筛，制成原料药。
2)水溶性提取：将原料药碎成小块，加去离子水浸泡1h，回流提取，滤过，冷藏过夜；取上清液浓缩至稠膏，真空干燥，为水溶性提取物；或用下述的步骤3)代替步骤2)，
3)醇溶性提取：将原料药碎成小块；加入80％乙醇浸泡过夜；回流提取三次，滤过，合并提取液，冷藏过夜；取上清液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至稠膏；真空干燥，得醇溶性提取物。
以上为初步提取步骤。还可进一步纯化提取，增加以下步骤：
4)聚酰胺柱层析产物：将水溶性提取物或醇溶性提取物加水溶解；上已处理好的聚酰胺柱，水洗至洗出液无色后，换不同浓度乙醇洗脱，分别收集洗脱液。回收乙醇至无醇味，经水浴蒸至稠浸膏，真空干燥得各洗脱物。
所述洗脱用乙醇的浓度为从20％-95％；推荐的乙醇浓度为50％或70％或95％。
本发明鸡血藤提取物有3种，由步骤2)取得的水溶性提取物、由步骤3)取得的醇溶性提取物和由步骤4)取得的聚酰胺柱层析产物，三者均能抑制肿瘤细胞的生长。水溶性或醇溶性提取较简单，其实验用药剂量偏大，但成本较低，可用于中药汤剂配方以及颗粒制剂、胶囊制剂中，有一定的抑瘤效果。聚酰胺柱层析产物为在该水溶性或醇溶性提取的基础上，采用聚酰胺层析柱和乙醇洗脱液对其进一步分离纯化，以显著提高效果，但成本较高，可用于滴丸、片剂等。试验证明，本发明鸡血藤水溶性提取物、乙醇提取物、聚酰胺柱层析产物对上述的七种肿瘤细胞系均有一定的生长抑制作用。其特点是：对不同种属细胞敏感性不同。对同种属、不同器官来源的细胞敏感性也不同。对同种属、同器官来源，但组织学来源不同的细胞系、例如A549和PG作用也有明显差异。
鸡血藤化学成分复杂，主要含黄酮类、三萜类、甾醇类以及蒽醌类化合物，本发明中所述的水溶性提取物、醇溶性提取物或聚酰胺柱层析产物中均含有黄酮等化合物，采用聚酰胺柱层析后，黄酮类成分成为主成分，乙醇梯度洗脱后，对其黄酮类成分进行了进一步的分离，试验结果显示50％、70％和95％的乙醇洗脱物的抑瘤效果好，IC50值大幅度下降，说明黄酮类成分很可能是其抗癌成分。但是，其中一些酚酸类和大分子物质也可能具有抗癌活性，要确切证明其中的抗肿瘤生物活性成分，有待进一步研究。
在毒副作用方面，现有化疗药物通常抑制骨髓造血，产生严重的毒副作用，而鸡血藤未表现出明显毒性，通过对动物外周血象的分析发现，白细胞和血小板数量未下降，而红细胞数量明显增加，增长率可达40.52％，这对改善肿瘤晚期贫血和化疗引起的骨髓抑制是有益的。这也证明了鸡血藤可以刺激骨髓而具有造血功能。
综上所述，本发明提供的鸡血藤提取物是用中药材鸡血藤提取制备的，用本发明方法制备的鸡血藤提取物对肿瘤细胞具有直接杀伤作用，且未发现明显的毒性。
附图说明
图1为鸡血藤提取物作用于HT-29细胞系的IC50图，图中代号
A：鸡血藤水提物 B：水洗脱物 C：30％乙醇洗脱物
D：50％乙醇洗脱物 E：70％乙醇洗脱物 F：95％乙醇洗脱物
图2为鸡血藤提取物作用于A549细胞系的IC50图，图中代号
A：鸡血藤水提物 B：水洗脱物 C：30％乙醇洗脱物
D：50％乙醇洗脱物 E：70％乙醇洗脱物 F：95％乙醇洗脱物
具体实施方式
通过实施例具体说明本发明的内容。
本发明具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物，它是由中药材鸡血藤提取制成的。
所述的肿瘤细胞包括人高转移巨细胞肺癌PG、人肠腺癌HT-29、人肺腺癌A549、人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小肠上皮细胞癌IEC-6、小鼠Lewis肺癌。
其制备方法包括以下步骤：
1)制作原料药，其制作方法为：将中药材鸡血藤去除杂质，粗细分开。用水浸泡16小时，泡至9成透时，洗净泥土，取出，闷润10小时，至内外湿度一致，切厚片，晒干，过筛，制成原料药鸡血藤饮片。本实施例中的原料药鸡血藤饮片购自北京卫仁中药饮片厂(批号：603305101)，该厂生产的鸡血藤饮片的制作方法如上所述。
2)水溶性提取：将原料药鸡血藤饮片1kg；加去离子水浸泡1小时；回流提取1.5小时；滤过；冷藏过夜；取上清浓缩至稠膏；真空干燥(温度60℃、真空度0.01Pa、时间6小时)，干膏称重110.8g。
另一提取方法为醇溶性提取，按下述的步骤3)，
3)醇溶性提取：将原料药鸡血藤饮片1kg，加入80％乙醇5000ml浸泡过夜；回流提取三次，每次1.5h，滤过，合并提取液，冷藏过夜；取上清液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至稠膏；真空干燥(温度60℃、真空度0.01Pa、时间6小时)，干膏称重173.12g。
以上为初步提取步骤。进一步纯化提取，增加以下提纯步骤：
4)聚酰胺柱层析产物：取水溶性或醇溶性提取的干膏，用水溶解(经多次水溶解后，仍有部分不溶物，弃去)；上已处理好的聚酰胺柱(柱直径5cm、柱高120cm)，水洗至流出液无色后，换不同浓度乙醇(30％、50％、70％、95％)梯度洗脱(每一梯度的乙醇用量以流出液近无色为度)，分别收集洗脱液；回收乙醇，至无醇味，经水浴蒸至稠浸膏，真空干燥得各乙醇洗脱物，即纯化提取物。
采用的实验材料：
药品与试剂：聚酰胺(柱层析用，30-60目)，江苏临江试剂化工厂生产；95％药用酒精：北京市远弘要用酒精有限责任公司；95％乙醇(AR)：北京化工厂；DMEM培养基，GIBCO公司；新生牛血清，奥地利PAA股份有限公司(Cat No：B15-001)；胰蛋白酶，GIBCO公司；噻唑蓝(MTT)，华美公司进口分装。
细胞系及细胞培养：人高转移巨细胞肺癌PG由北京大学医学部病理室提供。人肠腺癌HT-29，人肺腺癌A549，人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小肠上皮细胞癌IEC-6由本科中心实验室提供。细胞培养条件：高糖DMEM培养基，含10％小牛血清和双抗(青霉素100u·ml-1、链霉素100μg·ml-1)，置37℃、5％CO2的恒温箱中传代培养。
动物与瘤株：选用清洁级C57BL/6小鼠，雄性，18-20g。中国医学科学院动物研究所生产，许可证号：SCXK京2004-0001。小鼠移植性Lewis肺癌由中国医学科学院肿瘤研究所提供。
试验过程
MTT比色法 将单层贴壁且处于对数生长期的肿瘤细胞，用0.25％Trypsine～0.02mol·L-1EDTA消化液消化后，用含10％新生牛血清的DMEM培养基稀释成单细胞悬液，根据不同细胞生长速率，调细胞浓度2.5～5×107·L-1。将上述细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃、5％CO2的恒温培养箱中培养24小时后，每孔加100μl含药或无药培养液，设空白及细胞对照组、各浓度用药组、各浓度药品调零组，每组至少设三个复孔。继续培养72小时后，每孔加入MTT(5g·L-1)15μl，同等条件继续培养4小时。弃培养液，每孔加入150μl DMSO，充分震荡混匀，使结晶溶解，在奥地利SA1000酶联仪上测490nm处光吸收度(A值)，并计算细胞生长抑制率(IR)。实验重复3遍。
细胞生长抑制率(IR)＝[(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值]×100％
所有数据采用SAS 6.12统计分析软件处理，以
x±s表示。应用Origin软件根据细胞生长抑制率(IR)计算药物半数抑制浓度(IC50)。
体内抑瘤实验 将荷瘤(Lewis肺癌)14天的小鼠(C57BL/6)颈椎脱臼法处死，无菌选取新鲜瘤组织，剪碎研磨，加生理盐水稀释成单细胞悬液并计数，调整细胞浓度5×106·mL-1，于每只小鼠右前肢腋部皮下接种0.2mL。接种后第二天称重，将荷瘤小鼠随机分成对照组、鸡血藤聚酰胺柱层系产物(95％乙醇洗脱物)高、中、低剂量组，每组10只。对照组每只每天纯净水灌胃0.3mL，鸡血藤组分别按0.6、0.3、0.15g·kg-1灌胃给药，每只每天0.3mL，连续给药12天。于末次给药次日处死小鼠，称体重及瘤重，计算抑瘤率。实验重复2次，合并统计。
抑瘤率(％)＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
试验效果
1.鸡血藤水溶性提取物对六种肿瘤细胞生长的影响
参见表1、表2，鸡血藤水溶性提取物对六种肿瘤细胞均有一定生长抑制作用，具有剂量依赖关系。特点是：对不同种属细胞敏感性不同，大鼠肠上皮癌细胞IEC-6的IC50仅为人肠上皮HT-29的四分之一。对同种属、不同器官来源的细胞敏感性也不同，对肝癌细胞SMMC-7721作用最强，肠腺癌HT-29最差。对同种属、同器官来源，但组织学来源不同的细胞系A549和PG作用也有明显差异。
表1不同浓度的鸡血藤水提物对六种肿瘤细胞系的生长抑制作用(
x±s，n＝3)
| 剂量(μg·ml-1) | 生长抑制率(％) | |||||
| HT-29 | A549 | PG | PANC-1 | SMMC-7721 | IEC-6 | |
| 1252550100200400 | 1.58±1.922.69±2.029.88±3.8517.87±2.1240.68±6.4454.62±12.61 | 7.70±4.538.85±6.7226.45±8.4134.25±3.0487.65±1.34 | 2.00±2.8313.50±3.5434.50±19.0962.50±19.0979.00±9.90 | 2.00±12.735.50±7.7829.50±4.9553.00±11.3180.50±10.61 | 7.05±6.2913.65±19.3046.65±6.1576.20±15.2788.60±8.34 | 3.67±4.0422.00±5.2940.00±11.2776.00±12.4995.33±1.15 |
表2六种肿瘤细胞系应用鸡血藤水提物后的IC50(
x±s，n＝3)
| HT-29 | A549 | PG | PANC-1 | SMMC-7721 | IEC-6 | |
| IC50(μg·ml-1) | 258.90±27.87 | 122.62±0.83 | 77.97±33.55 | 94.92±14.38 | 57.63±14.38 | 63.28±15.29 |
2.鸡血藤醇溶性提取物对三种肿瘤细胞生长的影响
鸡血藤醇溶性提取物比水溶性提取物抗肿瘤活性强，其对A549细胞系、HT-29细胞系和PANC-1细胞系的IC50值与水提物相比约降低一倍，如表3、4所示。
表3不同浓度的鸡血藤醇提物对三种肿瘤细胞系的生长抑制作用(
x±s，n＝3)
| 剂量(μg·ml-1) | 生长抑制率(％) | ||
| HT-29 | A549 | PANC-1 | |
| 1252550100200 | 10.66±1.9717.61±1.7929.25±3.9943.12±5.1463.64±3.42 | 5.96±5.3017.06±3.3943.57±8.4095.65±0.3896.42±3.32 | 9.29±0.2117.95±1.9635.72±3.9965.51±7.0092.24±7.23 |
表4三种肿瘤细胞系应用鸡血藤醇提物后的IC50(
x±s，n＝3)
| HT-29 | A549 | PANC-1 | |
| IC50(μg·ml-1) | 125.42±23.97 | 54.24±0.01 | 68.80±6.22 |
3.鸡血藤的聚酰胺柱层析产物(纯化提取产物)对二种肿瘤细胞生长的影响。
如图1、2所示为鸡血藤提取物、特别是鸡血藤聚酰胺柱层析产物(将鸡血藤的水溶性提取物上聚酰胺层析柱，用不同浓度乙醇洗脱获得的洗脱物)作用于HT-29和A549细胞系的IC50图。从图1、2中可以看出，各乙醇洗脱物C、D、E、F与水溶性提取物A相比，用50％(D)、70％(E)、和95％(F)乙醇洗脱得到的乙醇洗脱物的抑瘤作用明显高于鸡血藤的水溶性提取物A的；其半数生长抑制浓度用量IC50减少约一半左右。且30％乙醇洗脱物C与水溶性提取物A之间无明显差别，而水洗脱物B则基本无效。
4.鸡血藤聚酰胺柱层析产物(95％乙醇洗脱物)对小鼠Lewis肺癌的抑制作用
鸡血藤95％乙醇洗脱物体内具有一定抗肿瘤作用，呈剂量依赖关系，高剂量对小鼠移植性肺癌的抑制率可达31.01％(见表5)。
表5鸡血藤95％乙醇洗脱物对小鼠Lewis肺癌的抑制作用(
x±s)
| 组别 | 剂量/g·kg-1·d-1 | n | 体重/g(开始/结束) | 瘤重/g | 抑瘤率/％ |
| 对照组鸡血藤提取物 | 0.150.300.60 | 20202020 | 19.47±0.87/22.70±2.1519.57±1.16/21.01±2.2819.10±0.53/21.85±1.9318.61±0.76/20.44±2.24 | 2.58±0.861.95±0.89*1.91±0.88*1.78±1.12* | 24.4225.9731.01 |
注：与对照组比较*P＜0.05
结论：用本发明方法制备的鸡血藤提取物在体外对肿瘤细胞系有广谱生长抑制作用，其纯化制备产物IC50明显降低。鸡血藤提取物体内实验也表现出抗肿瘤活性，对小鼠移植性Lewis肺癌的抑制率可达31.01％。此外，鸡血藤提取物对小鼠骨髓造血功能没有抑制作用，可以明显提高荷瘤小鼠红细胞数量；且本发明鸡血藤提取物的毒副作用小。
Claims (6)
1.具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物，其特征是：它是由中药材鸡血藤提取制备而成的。
2.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物，其特征是：所述的肿瘤细胞包括人高转移巨细胞肺癌PG、人肠腺癌HT-29、人肺腺癌A549、人胰腺癌PANC-1、人肝癌SMMC-7721、大鼠小肠上皮细胞癌IEC-6、小鼠Lewis肺癌。
3.根据权利要求1所述的具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
1)制作原料药，将中药材鸡血藤去除杂质，粗细分开；用水浸泡8-24小时，洗净泥土，取出，闷润8-12小时，至内外湿度一致；切片，晒干，过筛，制成原料药；
2)水溶性提取：将所述的原料药碎成小块；用去离子水浸泡；回流提取；滤过，冷藏过夜；取上清液浓缩至稠膏；真空干燥，得水溶性提取物；或
3)醇溶性提取：将所述的原料药碎成小块；加入80％乙醇浸泡过夜；回流提取三次，滤过，合并提取液，冷藏过夜；取上清液减压回收乙醇至无醇味，继续浓缩至稠膏；真空干燥，得醇溶性提取物。
4.根据权利要求3所述的具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物的制备方法，其特征是：还包括以下步骤：
4)聚酰胺柱层析产物：将所述的水溶性提取物或醇溶性提取物加水溶解；上已处理好的聚酰胺柱，水洗至洗出液澄明后；换不同浓度乙醇洗脱，分别收集洗脱液。回收乙醇至无醇味，经水浴蒸干，真空干燥得各洗脱物。
5.根据权利要求4所述的具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物的制备方法，其特征是：所述步骤4)中的洗脱用乙醇，包括浓度20％-95％的乙醇。
6.根据权利要求5所述的具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物的制备方法，其特征是：所述步骤4)中的洗脱用乙醇的浓度为50％或70％或95％。
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|---|---|---|---|
| CN 200610137716 Pending CN1939396A (zh) | 2006-10-26 | 2006-10-26 | 具有抗肿瘤作用的鸡血藤提取物及其制作方法 |
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|---|---|
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN101578999B (zh) * | 2009-06-23 | 2012-10-31 | 北京农学院 | 一种鸡血藤提取物及其制备方法和用途 |
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| CN108578464A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-09-28 | 中国中医科学院中药研究所 | 一种鸡血藤提取物在制备抗肿瘤药物中的应用 |
| CN110642850A (zh) * | 2019-09-09 | 2020-01-03 | 株洲千金药业股份有限公司 | 一种异黄烷类化合物及其制备方法和应用 |
-
2006
- 2006-10-26 CN CN 200610137716 patent/CN1939396A/zh active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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