CN104825500B

CN104825500B - 白肉灵芝提取物、提取方法及其用途

Info

Publication number: CN104825500B
Application number: CN201510076719.8A
Authority: CN
Inventors: 刘宏伟; 熊卫萍; 汪锴; 宝丽; 张君丽; 谢荣; 白玛旦增; 洛桑; 孙慧娟
Original assignee: VEGETABLE RESEARCH INSTITUTE OF TIBET ACADEMY OF AGRICULTURAL AND ANIMAL HUSBANDRY SCIENCES; Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: VEGETABLE RESEARCH INSTITUTE OF TIBET ACADEMY OF AGRICULTURAL AND ANIMAL HUSBANDRY SCIENCES; Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2035-02-12
Also published as: CN104825463B; CN104825462B; CN104825463A; CN104825462A; CN104825461B; CN104825500A; CN104825461A

Abstract

本申请公开了白肉灵芝提取物、提取方法及用途。所述方法包括用提取溶剂提取白肉灵芝的子实体至少一次和去除溶剂的步骤以获得所述提取物。本发明的提取方法简单，得到白肉灵芝提取物显示出显著的抗肿瘤及提高免疫力的活性。本申请进一步公开了含有该提取物的药物组合物以及可食用的产品，以及所述提取物及药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症或抑制肿瘤细胞增殖、提高机体免疫力、治疗和/或预防辐射损伤的药物或保健食品中的应用。

Description

白肉灵芝提取物、提取方法及其用途

技术领域

本发明涉及天然的药用提取物，具体涉及白肉灵芝提取物及其在抗肿瘤、抗辐射和提高机体免疫力等方面的应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、灵芝科(Gamodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)类。《中华本草》中记录“其性甘；味平；无毒；归肺、心、脾、肾经。益气血；安心神；健脾胃。主治虚劳、心悸、失眠、头晕、神疲乏力、久咳气喘、冠心病、矽肺、肿瘤。”《中国药典》中将灵芝收录为中药材，其中的灵芝多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是其药效物质的主要基础，以三萜和多糖为其中主要活性成分。现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-4及HIV-4蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化等作用。

灵芝分类历史悠久，归类各有不同，《本草纲目》等古籍中以“六色”将灵芝归为：青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、紫芝。近日广东省微生物研究所李泰辉等人在真菌学杂志《Mycoscience,http://dx.doi.org/10.1016/j.myc.2014.03.005》发表文章宣布他们在西藏林芝地区发现了一个灵芝新种——白肉灵芝Ganoderma leucocontextum(Li TH,Hu HP,Deng WQ,et al.Ganoderma leucocontextum,a new member of the G.lucidum complexfrom southwestern China；Mycoscience,2015,56(1)：81-85)。中国西藏新闻网2014年8月报道西藏自治区农牧科学院研究人员白肉灵芝人工栽培获得成功。针对白肉灵芝的食用及药用价值急需进行系统研究和开发。

发明内容

本发明以白肉灵芝Ganoderma leucocontextum为研究对象，对其提取物进行了化学和生物活性研究，发现白肉灵芝提取物对机体具有多方面的保健和调节作用，具有很好的药用和食用价值。

为此，本发明的第一方面，提供一种制备白肉灵芝Ganoderma leucocontextum提取物的方法，包括如下步骤：

用提取溶剂提取白肉灵芝的子实体至少一次；和

去除溶剂以获得所述提取物。

所述提取溶剂可选自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、卤代C1～C3烷烃、R1C(O)R2中的一种，或者两种或更多种的混合溶剂，其中R1和R2各自独立地为C1～C3烷基。

所述提取溶剂优选选自水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一种或多种。

特别优选所述提取溶剂为20～98％(v/v)的乙醇水溶液，更优选40～98％(v/v)、最优选70～95％(v/v)的乙醇水溶液。

白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比(g:ml或kg:L)为1:3～10；优选为1:2～5；最优选为1:3。

为提高提取效果，优选事先将白肉灵芝的子实体碎化。

所述提取方法可以是任何适宜的方法，例如但不限于浸渍提取、超声提取、加热回流提取等。

提取温度为室温～105℃，优选20～50℃。本文中所说室温通常指18～30℃。

根据一种实施方式，提取可进行1～5次，优选提取2～4次，最优选为3次。

提取时间为每次15min～2小时，优选为30～70min。

优选地，所述提取溶剂可回收再利用。

去除或回收提取溶剂的方法可根据不同溶剂灵活选取。例如可以进行蒸馏或减压蒸馏等。

根据本发明的另一种实施方式，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用弱极性有机溶剂萃取以除去脂溶性杂质；

用萃取剂萃取水相；和

取萃取剂层并去除萃取剂。

所述萃取剂可选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种，优选乙酸乙酯。

用于除去脂溶性杂质的弱极性有机溶剂可以是常用用萃取分离有机物的那些非极性溶剂。例如可选自C5～C12的烷烃、C5～C8的环烷烃、卤代C1～C3烷烃、石油醚中的一种或多种。根据一种实施方式，所述有非极性机溶剂可选自正己烷、正庚烷、正辛烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷、沸点60～90℃的石油醚中的一种或多种。优选使用所述石油醚和/或环己烷。

可用所述弱极性有机溶剂进行多次萃取以尽量除去脂溶性杂质。例如可萃取2～5次。

用萃取剂的萃取也同样可进行多次。例如可为2～5次。

所述弱极性有机溶剂以及所述萃取剂的用量分别为每次为水相体积的50～200％；优选用与水相等体积的弱极性有机溶剂(或萃取剂)进行萃取。

根据本发明的一种实施方式，所述提取溶剂为水、或选自C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯中的一种或多种溶剂的40％(v/v)以下(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(v/v))的水溶液，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用萃取剂萃取所获得的提取液；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

所述萃取剂可为选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种，优选乙酸乙酯。

同样的，用萃取剂的萃取可进行多次。例如可为2～5次。

所述萃取剂的用量分别为每次为水相体积的50～200％；优选用与水相等体积的萃取剂进行萃取。

该实施方式可获得水溶性更好的提取物，以便制备水溶剂或茶饮等产品。

本发明的第二方面提供一种白肉灵芝Ganoderma leucocontextum提取物，所述提取物中含有下式1和式2所示的化合物的组合。

根据一种实施方式，本发明的提取物由以上所述制备白肉灵芝提取物的方法制备得到。

根据本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有有效量的上述白肉灵芝提取物。

所述药物组合物可包括一种或多种药学上可接受的辅料。

所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、缓释剂等。

所述药物组合物可为注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂、喷剂等剂型。各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。

所述药物组合物可通过口服、胃肠内给药、注射、喷射、物理或化学介导等方法给药，或是被其他物质混合或包裹后给药。

根据本发明的第四方面，提供一种含有上述白肉灵芝提取物的可食用的产品。

本发明的提取物或药物组合可用于抗肿瘤、抗辐射、抗炎症、提高机体免疫力，所述提取物或药物组合还具有神经保护、调节代谢和抗缺氧的作用。

抗肿瘤是指治疗和/或预防癌症，或者抑制肿瘤细胞增殖。所述癌症为肝癌、肺癌、直肠癌、宫颈癌、白血病、胃癌、乳腺癌等。所述肿瘤细胞为肝癌细胞、肺癌细胞、直肠癌细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞、胃癌细胞或乳腺癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为人肝癌细胞、人前列腺癌细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人宫颈癌细胞、人白血病细胞、人胃癌细胞或人乳腺癌细胞。所述人肝癌细胞具体可为HepG2细胞。所述人前列腺癌细胞具体可为PC-3细胞。所述人肺癌细胞具体可为A549细胞。所述人结直肠癌细胞具体可为HCT-15细胞。所述人宫颈癌细胞具体可为HeLa细胞。所述人白血病细胞具体可为K-562细胞。所述人胃癌细胞具体可为SGC-7901细胞。所述人乳腺癌细胞具体可为MCF7细胞。

抗辐射包括抗各种高能射线辐射造成的损伤，也包括抗电磁辐射(例如电脑、电话等电器发出的辐射)、肿瘤放疗造成的损伤。

抗炎症是指胃炎、肝炎、肺炎等炎性损伤。其中胃炎例如急、慢性胃炎，胃溃疡等；肝炎例如细菌性肝损伤、药物性肝损害、病毒性肝损伤、脂肪肝等；肺炎例如细菌性肺炎、病毒性肺炎等；肠炎例如细菌性肠炎、慢性肠炎等。

提高机体免疫力是指提高机体IFN-γ，IL-6，TNF-α等免疫因子的水平，增强机体免疫功能，也包括提高放化疗引起的白细胞降低等。

神经保护作用包括预防和/或治疗神经退行性疾病、抗疲劳、镇静、催眠、健脑益智等。其中神经退行性疾病，例如阿尔茨海默症、帕金森症、早老性或老年性痴呆等。镇静的作用例如可治疗和/或预防神经衰弱、狂躁、抑郁等。所述健脑益智是指提高记忆力、提高智力等。

调节代谢作用包括对血脂、血糖等的调节以及对血压的调节作用。

抗缺氧的作用包括抗由于高血压、高血脂和/或高血糖引起的脑缺氧，以及高原缺氧的症状的缓解作用。

本发明含有白肉灵芝提取物的可食用的产品可用于例如日常保健、以及上述各方面的预防和辅助治疗。具体形式可为口服液、茶饮、含片、胶囊、饮品、泡腾片等等。

根据本发明的第五方面，提供上述白肉灵芝提取物或上述药物组合物在制备用于预防和/或治疗癌症、或用于抑制肿瘤细胞增殖的药物或食品中的应用。

所述癌症为肝癌、肺癌、直肠癌、宫颈癌、白血病、胃癌、乳腺癌等。

所述肿瘤细胞为肝癌细胞、肺癌细胞、直肠癌细胞、宫颈癌细胞、白血病细胞、胃癌细胞或乳腺癌细胞。所述肿瘤细胞具体可为人肝癌细胞、人前列腺癌细胞、人肺癌细胞、人结直肠癌细胞、人宫颈癌细胞、人白血病细胞、人胃癌细胞或人乳腺癌细胞。所述人肝癌细胞具体可为HepG2细胞。所述人前列腺癌细胞具体可为PC-3细胞。所述人肺癌细胞具体可为A549细胞。所述人结直肠癌细胞具体可为HCT-15细胞。所述人宫颈癌细胞具体可为HeLa细胞。所述人白血病细胞具体可为K-562细胞。所述人胃癌细胞具体可为SGC-7901细胞。所述人乳腺癌细胞具体可为MCF7细胞。

本发明的第六个方面，提供上述白肉灵芝提取物或上述药物组合物在制备提高机体免疫力的药物或食品中的应用。

提高机体免疫力包括提高机体IFN-γ，IL-6，TNF-α等免疫因子的水平，增强机体免疫功能，也包括提高放化疗引起的白细胞降低等。

本发明的第七个方面，提供上述白肉灵芝提取物或上述药物组合物在制备抗辐射的药物或食品中的应用。

本发明的研究发现，白肉灵芝可采用任何常规的溶剂，包括水进行提取，提取方法简单，提取物可溶于水。提取物中含有较大量的三萜类化合物，并经验证具有多种药用和保健功效，例如可显著的抑制癌细胞增殖，用于抗肿瘤、抗辐射、抗炎症、提高机体免疫力，还具有神经保护和调节代谢的作用。因此，白肉灵芝的提取物具有广阔的药用和食用的应用前景。

附图说明

图1为用不同有机溶剂提取白肉灵芝粗提物的HPLC指纹图谱；和

图2为根据本发明一种实施方式获得的白肉灵芝提取物的HPLC图谱。

具体实施方式

参照附图及以下详细描述的优选实施方式和具体实施例，更加详细地说明本发明的各个方面和上述的及其他的优点。本领域技术人员应理解，下面描述的这些内容是为了更好地理解本发明，本发明的范围并不受限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

人肝癌细胞HepG2购自ATCC，产品目录号为HB-8065。

人前列腺癌细胞PC3购自ATCC，产品目录号为CRL-1435。

人肺癌细胞A549购自ATCC，产品目录号为CCL-185。

人结直肠癌细胞HCT-15购自ATCC，产品目录号为CCL-225。

人宫颈癌细胞HeLa购自ATCC，产品目录号为CCL-2。

人白血病K562细胞购自中山医科大学实验动物中心。

人胃癌细胞SGC-7901购自ATCC，产品目录号为SGC-7901。

人乳腺癌细胞MCF-7购自ATCC，产品目录号为HCC1428。

白肉灵芝由西藏自治区农科院蔬菜研究所提供。

实施例1 白肉灵芝乙醇提取物的制备

将白肉灵芝子实体剪碎，称重5000克。用15L体积百分含量95％乙醇的水溶液回流提取3次，每次1小时。合并提取液，减压浓缩干燥得到170克提取物，将提取物记作GL-1。

进一步将提取物用蒸馏水600ml溶解，用等体积的正己烷萃取三次，弃去有机相。再用等体积乙酸乙酯萃取水相三次，弃去水相，合并乙酸乙酯萃取液。用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯获得浸膏54g，记作GL-1E。

实施例2 纯化及鉴定实施例1GL-1E提取物中的主要化合物

取40g实施例1制备的提取物GL-1E，通过硅胶柱色谱分离，以正己烷:乙酸乙酯体系和二氯甲烷:甲醇体系依次进行梯度洗脱，每个梯度洗3个保留体积，每个体积500ml。在二氯甲烷:甲醇(体积比为100:1)中得到馏分19，命名为GL-E19。

GL-E19(10.5g)利用ODS反相硅胶柱分离，用体积百分含量为10％～100％甲醇的水溶液依次进行洗脱，每个洗脱体系3个保留体积，每个保留体积为500ml，每300ml收集一个馏分。体积百分含量为40％的甲醇水溶液系统的第三个馏分和体积百分含量为50％的甲醇水溶液系统的第三个馏分，分别命名为GL-E19-23和GL-E19-27。

对GL-E19-23以体积百分含量40％乙腈的酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集28min的色谱峰，得到化合物1。对GL-E19-27以体积百分含量42％乙腈酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集25.2min的色谱峰得到化合物2。上述HPLC色谱条件如下：以色谱纯的甲醇将样品配制为10mg/ml的溶液，上样量为15ul每次，色谱柱为Kromasil10×250mm C18半制备柱，柱温为25℃，210nm波长进行检测。

化合物1和化合物2通过鉴定，结构式如下式1、式2所示，数据归属见表1和2。

表1 化合物1和化合物2的¹³C NMR数据(125MHz，CDCl₃)

Carbon	化合物1	化合物2	Carbon	化合物1	化合物2
						1	34.9	34.2	19	19.1	18.6
2	34.5	34.3	20	31.9	35.7
						3	219.1	211.8	21	20.9	18.5
4	50.3	51.6	22	26.5	25.8
						5	49.5	50.5	23	33.1	34.5
6	27.0	39.5	24	143.8	144.5
						7	65.6	198.7	25	127.6	127.5
8	157	147.0	26	172.2	173.0
						9	140.9	149.9	27	12.1	12.2
10	37.5	39.5	28	22.0	22.5
						11	192.4	199.6	29	65.5	65.8
12	79.7	44.1	30	24.5	21.6
						13	60.5	57.3	1'	170.4	171.6
14	49.7	49.1	2'	20.7	44.8
						15	216.7	208.0	3'		69.9
16	37.7	37.1	4'		44.7
						17	46.1	45.3	5'		175.2
18	13.6	16.2	6'		27.3

表2 化合物1和化合物2的¹H NMR数据(J in Hz,500MHz，CDCl₃)

实施例3 提取物GL-1的指纹图谱检测

高效液相化学指纹图谱分析条件如下：使用Agilent1200高效液相色谱仪，四元梯度泵，DAD检测器，Agilent色谱工作站。色谱柱YMC C8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈-体积百分含量0.04％的三氟乙酸的水溶液，温度室温(20～30℃)的条件下进行梯度洗脱(洗脱程序以及各成分的体积百分含量如下所示)，流速1.00mL/min。将粗提物G1用乙腈溶解，配成10mg/mL的溶液，进样量10μl，紫外检测波长为210nm。

梯度洗脱步骤如下表3：

表3

按照上述洗脱条件得到提取物GL-1的色谱图如图1所示，并对实施例2分离得到的2个化合物进行指认，这两个化合物的峰面积占总峰面积的10.82％。

实施例4 用甲醇提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:甲醇＝1g:3ml的量加入甲醇，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-2。甲醇纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-2进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的6.58％。

实施例5:用乙酸乙酯提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:乙酸乙酯＝1g:3ml的量加入乙酸乙酯，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，即提取物GL-3。乙酸乙酯纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-3进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的8.45％。

实施例6:用二氯甲烷提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:二氯甲烷＝1g:3ml的量加入二氯甲烷，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到粗提物GL-4。所述二氯甲烷纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-4进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的12.38％。

实施例7:用丙酮提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:丙酮＝1g:3ml的量加入丙酮，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-5。所述丙酮纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-5进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1-2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的6.31％。

实施例8:用水提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:水＝1g:3ml的量加入去离子水，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-6。将GL-6提取物浸膏用适量蒸馏水混悬，然后用等量乙酸乙酯萃取三次，旋转蒸发仪蒸干溶液获得水提物的乙酸乙酯浸膏GL-6E。所述水为去离子水。

将GL-6E进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图2所示，1-2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的12.24％。

实施例9 白肉灵芝提取物的抗肿瘤作用

测试用肿瘤细胞：将上述人肝癌细胞HepG2，人前列腺癌细胞PC3用含体积百分含量10％的胎牛血清的DMEM培养液培养，人肺癌细胞A549、人结直肠癌细胞HCT-15、人宫颈癌细胞Hela、人白血病细胞K562、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7用含体积百分含量10％的胎牛血清的RPMI 1640培养液分别培养。上述细胞的培养条件均为37℃、5％CO₂培养箱中常规培养，隔天传代。

被测样品溶液：实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用DMSO(二甲亚砜)配制成50mg/ml溶液(制备时溶于少量DMSO后，再用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积百分含量<1％)，用DMEM培养基进行2倍梯度稀释，共8个浓度，供活性测试。

阳性对照溶液：五氟尿嘧啶(5-FU)是以抗代谢物而起作用，在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，通过阻断脱氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶转化为胸苷酸，而干扰DNA的合成。五氟尿嘧啶同样可以干扰RNA的合成。静脉用药后，氟尿嘧啶广泛分布于体液中，并在4小时内从血中消失。五氟尿嘧啶是最早的抗癌药物，抗瘤谱广泛，临床用于结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌等。五氟尿嘧啶配制成2mM水溶液(制备时溶于少量DMSO后，再用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积百分含量<1％)，用DMEM培养基溶液进行2倍梯度稀释，共8个浓度。

采用细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)测试样品的抗肿瘤细胞增殖活性，其原理是，活细胞线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑为蓝紫色的不溶于水的甲臜(formazan)，甲臜的量可通过酶标仪测定其吸光度求得。由于甲臜的量与活细胞数成正比，所以可根据吸光度计算得出活细胞的数目，从而获得药物抑制或杀伤肿瘤细胞的能力。

取对数生长期的上述各种测试用肿瘤细胞(人肝癌细胞HepG2、人前列腺癌细胞PC3、人肺癌细胞A549、人结直肠癌细胞HCT-15、人宫颈癌细胞Hela、人白血病K562细胞、人胃癌细胞SGC-7901、人乳腺癌细胞MCF-7)，分别用胰酶消化，制成每毫升含1×10⁵个细胞的单细胞悬液，接种于96孔板内(每孔200μL)，每组设3个平行孔。在37℃下24小时后加入2ul上述不同浓度的被测样品溶液，作为给药组，培养48小时。同时设空白对照组(2 ul DMSO替代上述的被测样品溶液)和阳性对照组(2ul不同浓度的五氟尿嘧啶溶液替代上述的被测样品溶液)。然后在各组中加入20μL含MTT的RPMI-1640溶液(MTT终浓度为5mg/L)再培养4小时，移出150μL培养液后加入150μL DMSO溶解甲臜，在540nm处测定其吸收度，计算抑制率(％)。

抑制率(％)(I)＝(1-给药组OD值/空白对照组OD值)×100％。

计算IC₅₀值：

IC₅₀＝[C_L(I_H-50)+C_H(50-I_L)]/(I_H-I_L)

C_L：低浓度值；C_H：高浓度值；I_H：高浓度下的抑制率；I_L：低浓度下的抑制率。结果如表4所示。

表4

表4表明，8种提取物对于多种肿瘤细胞都有一定程度的抗肿瘤活性。这一结论与图1的指纹图谱结果也吻合，说明各提取方法获得的提取物的物质基础是一致的。

实施例10 白肉灵芝提取物提高免疫力的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。，分别用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。体重18-22g雄性清洁级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20-24摄氏度，恒湿50-60％，光照12小时(8:00-20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。顺铂(中国药品生物制品检验所，批号100401-200501。顺铂作为阳性对照，属于细胞周期非特异性药物，对肉瘤、恶性上皮肿瘤、淋巴瘤及生殖细胞肿瘤都有治疗功效。)。Mouse IL-2 ELISA试剂盒、Mouse TNF-αELISA试剂盒、Mouse IFN-γELISA试剂盒购自R&D公司(美国)。H-22小鼠肝癌肿瘤细胞株购自北京协和细胞资源中心。

方法：取H22细胞，调整密度2×10⁶个/ml，取1ml接种在小鼠腹腔内，10天后无菌操作取小鼠腹水，计数活细胞为10⁷个/ml，取0.2ml接种于小鼠右前肢外侧皮下，建立实体型荷瘤鼠模型。给药24小时后随机分为10组：8个给药组、顺铂组和模型对照组，每组10只。各给药组分别灌胃给予0.1ml的100mg/ml提取物溶液，顺铂组每只按照1.5mg/kg腹腔注射，模型组给予0.1ml的0.5％CMC-Na溶液。连续给药15天，末次给药1小时后，处死，心脏取血、脾脏、胸腺。

胸腺指数＝胸腺/体重×100％

脾脏指数＝脾脏/体重×100％

IL-2、TNF-α、IFN-γ按照试剂盒进行操作。

结果：与模型组比较，白肉灵芝提取物对脾脏和胸腺都有一定的保护作用，而顺铂对胸腺和脾脏是有伤害的，另外顺铂和白肉灵芝提取物都可提高机体IFN-γ，IL-6，TNF-α的含量，具有一定的提高机体免疫力功能，结果见表5。

表5

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。

实施例11 白肉灵芝提取物抗辐射作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。SPF级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24℃，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。血清超氧化物歧化酶SOD试剂盒(批号20130825)购自南京建成生物技术研究所。

方法：取雄性SPF级昆明种小鼠，20±2g，随机分为9组，每组12只。各组分别灌胃给与0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，连续30天，空白对照组(不进行照射)和模型对照组(仅进行照射而未给药)给予等量的0.5％CMC-Na溶液。在第1天、第15天用⁶⁰Coγ进行一次全身照射，在照射前、照射后的第3天、第14天分别采末梢血20μl，加入1％0.38ml盐酸，混匀后全自动血球计数测定外周血白细胞数。第30天处死老鼠，取血，按照试剂盒操作测定血清超氧化物歧化酶SOD活性。

结果：白肉灵芝提取物可显著促进外周血白细胞的恢复，提高血清抗氧化酶SOD的活性，对辐射危害有保护的功能，见表6。

表6

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比

^#P<0.05，^##P<0.01与空白组相比。

Claims

1.一种制备白肉灵芝Ganoderma leucocontextum提取物的方法，包括如下步骤：

用提取溶剂提取白肉灵芝的子实体至少一次；和

去除溶剂以获得所述提取物，

其中，所述提取溶剂为水、甲醇、95％(v/v)乙醇水溶液、乙酸乙酯、二氯甲烷或丙酮，

所述提取物中含有式1和式2所示的化合物，

2.如权利要求1所述的方法，其中白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比为1:3～10；提取温度为20℃～50℃；且提取1～5次。

3.如权利要求2所述的方法，其中白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比为1:2～5。

4.如权利要求3所述的方法，其中白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比为1:3。

5.如权利要求2所述的方法，其中提取2～4次。

6.如权利要求5所述的方法，其中提取3次。

7.如权利要求1所述的方法，其中，当所述提取溶剂为95％(v/v)乙醇水溶液时，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用正己烷萃取以除去脂溶性杂质；

用萃取剂萃取水相；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

其中，所述萃取剂为乙酸乙酯。

8.一种白肉灵芝Ganoderma leucocontextum提取物，其中所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的组合，

9.一种白肉灵芝Ganoderma leucocontextum提取物，其中所述提取物根据权利要求1～7中任意一项所述的方法制备得到。

10.一种药物组合物，其中所述药物组合物含有有效量的权利要求8或9所述的白肉灵芝提取物。

11.如权利要求10所述药物组合物，其中，所述药物组合物进一步包括一种或多种药学上可接受的辅料。

12.根据权利要求8或9所述的白肉灵芝提取物或根据权利要求10或11所述的药物组合物在制备用于提高机体免疫力、预防和/或治疗辐射损伤、预防和/或治疗癌症或抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。