CN101406499A - 番荔枝内酯提取物和提取方法及在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种番荔枝内酯提取物及提取方法，从番荔枝种子中提取分离得到的一种抗癌活性成分。其提取方法是：先用乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂从番荔枝种子粗粉中提取番荔枝内酯；再将番荔枝内酯经硅胶柱层析，氯仿－甲醇，石油醚－乙酸乙酯，乙酸乙酯－甲醇洗脱，得到一种番荔枝内酯提取物，其含量为质量分数的50％～90％。经动物体内抗癌药理实验，番荔枝内酯提取物对肺癌、乳腺癌、肝癌细胞的生长有明显的抑制作用，其抗癌活性百倍高于化疗药5－氟脲嘧啶，可用于抗癌药物的制备。

Description

番荔枝内酯提取物和提取方法及在制备抗癌药物中的应用

一、技术领域

本发明涉及一种中药提取物，具体地说是以番荔枝种子为原料提取的一种番荔枝内酯提取物及提取方法和该提取物在制备治疗肺癌、乳腺癌及肝癌药物中的应用。

二、背景技术

癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肺癌、乳腺癌、肝癌等癌症的高发区域，癌症死亡率居高不下。

目前尚无有效的药物治愈大多数癌症患者。化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，疗效均不理想。

本发明人经过十几年艰苦研究了番荔枝(Annona squamosa Linn)种子的抗癌有效物质，从中提取出多种抗癌活性化合物，经抗癌实验研究表明，对人肝癌细胞、人胃癌细胞、人食管癌细胞和动物移植性肿瘤(如S₁₈₀、H₂₂和Heps)均有显著的体内外抗癌治疗效果，并已申请获得3项抗癌产品发明专利证书(专利号分别为：ZL02148474.0、ZL02148475.9、ZL03112707.X)。在上述研究的基础上，本发明人继续提取分离、筛选番荔枝种子的抗癌有效化学成分，及番荔枝内酯提取物，具有特别显著的抗癌活性。

三、发明内容

1、发明目的

本发明的目的是提供一种番荔枝内酯提取物及提取方法和在制备治疗抗癌药物中的应用。

2、技术方案

一种番荔枝内酯提取物，其特征在于它是从番荔枝种子中提取分离得到的一种抗癌活性成分。

一种提取上述提取物的方法，其特征在于提取步骤如下：

(1)将番荔枝种子粉碎成粗粉，用乙醇回流提取，乙醇提取液常压浓缩后，依次用石油醚、水饱和乙酸乙酯、氯仿萃取，合并萃取液浓缩干燥，得到番荔枝内酯；

(2)将上述的番荔枝内酯经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，将收集到的番荔枝内酯提取物浓缩干燥；

(3)再经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，用薄层层析检查，以碘化铋钾试剂显色，将收集到的番荔枝内酯提取物浓缩、干燥，其含量为质量份数的50％～90％。

上述步骤(1)中所述的乙醇浓度为95％～97％，回流提取3次，依次用10倍量的石油醚20℃～60℃、水饱和乙酸乙酯、氯仿萃取3次。

上述步骤(2)中所述硅胶柱层析，其硅胶粒度为100～300目，与萃取物的质量比为10∶1～20∶1，以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇梯度洗脱。

上述步骤(3)中所述的硅胶柱层析，其硅胶粒度为100～300目，与番荔枝内酯提取物的质量比为10∶1～50∶1；以体积比为100∶0～90∶10的石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。

上述的番荔枝内酯提取物在制备治疗肺癌药物中的应用。

上述的番荔枝内酯提取物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

上述的番荔枝内酯提取物在制备治疗肝癌药物中的应用。

上述的番荔枝内酯提取物在体内对肺癌、乳腺癌或肝癌细胞有明显的抑制作用，其抗癌活性高于化疗药物5-氟脲嘧啶。

番荔枝内酯提取物对小鼠移植性肺癌的生长抑制作用：不同剂量15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg的番荔枝内酯提取物均能显著抑制小鼠移植性肺癌的生长(P＜0.01)，其抑瘤率分别为63.01％、70.04％、77.81％。番荔枝内酯提取物抗肺癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶的百倍以上。

番荔枝内酯提取物对小鼠移植性乳腺癌的生长抑制作用：不同剂量15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg的番荔枝内酯提取物均能显著抑制小鼠移植性乳腺癌的生长(P＜0.01)，其抑瘤率分别为41.18％、65.44％、78.68％。番荔枝内酯提取物抗乳腺癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶的百倍以上。

番荔枝内酯提取物对小鼠移植性肝癌的生长抑制作用：不同剂量15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg的番荔枝内酯提取物均能显著抑制小鼠移植性肝癌的生长(P＜0.01)，其抑瘤率分别为49.70％、64.24％、78.18％。番荔枝内酯提取物抗肝癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶的百倍以上。

3、有益效果

本发明的番荔枝内酯提取物是从番荔枝种子中提取得到的抗癌活性物质。动物体内抗癌实验结果显示，番荔枝内酯提取物对肺癌、乳腺癌、肝癌的生长均有非常高的抗癌活性，其体内抗癌活性百倍高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)。这为提高抗癌临床疗效提供了非常有前景的高效预选药物。

四、具体实施方式

实施例1：番荔枝内酯提取物的提取方法

番荔枝种子20kg，粉碎成粗粉，用浓度为95％的乙醇回流提取3次，乙醇提取液常压浓缩后得1.2kg。依次用10倍量石油醚(20～60℃)、水饱和乙酸乙酯、氯仿萃取3次，合并萃取液浓缩干燥后得610g的番荔枝内酯提取物。

经多次硅胶柱层析，硅胶粒度为100～300目，与萃取物的质量比为10∶1～20∶1；以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇梯度洗脱，收集到的番荔枝内酯提取物浓缩干燥得230g。再经多次硅胶柱层析，硅胶粒度为100～300目，与番荔枝内酯提取物的质量比为10∶1～50∶1；以体积比为100∶0～90∶10的石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集到的流分浓缩干燥得到蜡状固体38g，即为番荔枝内酯提取物。

实施例2：番荔枝内酯提取物对移植性肺癌的抑制作用

1、实验动物和瘤株

雄性健康C57BL/6小鼠，体重18-22g，鼠龄6-8周，购自本校动物实验中心；小鼠Lewis肺癌瘤株购自江苏省肿瘤研究所动物实验中心。

2、造模与实验方法

C57BL/6小鼠60只，按比例随机留10只为阴性对照组，其余50只进行造模。制备Lewis肺癌荷瘤小鼠，剥离生长旺盛期的瘤组织，选取生长良好的肿块1.5mm³左右，按肿瘤(g)∶生理盐水(ml)为1∶3比例匀浆，调细胞数为2×10⁶/ml。选取健康小鼠，在无菌条件下每只小鼠右侧腋窝皮下接种0.2ml。整个接种过程须在无菌罩内以无菌操作进行，1h内完成接种。

接种后随机分为5组，每组10只，分别为肿瘤模型对照组、15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组、5-fu阳性对照组，另加阴性对照组，共6组。接种瘤细胞24h后，试验组腹腔注射番荔枝内酯提取物，剂量分别为15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg，阴性对照组和肿瘤模型对照组等体积注射药物溶媒，5-FU对照组以生理盐水为溶剂，剂量为20mg/kg，各组动物均按0.2ml在腹腔注射，连续给药10d。末次给药后次日，进行如下观察：

完整剥离瘤块，并称重计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤重量-治疗组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100％。

3、实验结果：

番荔枝内酯提取物对小鼠移植性肺癌的生长抑制作用：不同剂量的番荔枝内酯提取物均能显著抑制小鼠移植性肺癌的生长(P＜0.01)。番荔枝内酯提取物的剂量极小，其抗肺癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)的百倍以上，见表1。

表1番荔枝内酯提取物对小鼠移植性肺癌Lewis作用结果

实施例3：番荔枝内酯提取物对移植性乳腺癌的抑制作用

2、实验动物和瘤株

雌性健康TA2小鼠，体重18-22g，鼠龄6-8周，购自本校动物实验中心；小鼠乳腺癌细胞株MA-891购自江苏省肿瘤研究所动物实验中心。

2、造模与实验方法

TA2小鼠60只，按比例随机留10只为阴性对照组，其余50只进行造模。取体外培养的对数生长期MA-891小鼠乳腺癌细胞，细胞浓度调整为1×10⁷/ml。无菌条件下，将MA-891小鼠乳腺癌细胞接种于TA2小鼠右腋部皮下，接种量为0.2ml/只(细胞数为2×10⁶/只)。整个接种过程须在无菌罩内以无菌操作进行，1h内完成接种。

接种后随机分为5组，每组10只，分别为肿瘤模型对照组、15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组、5-fu阳性对照组，另加阴性对照组，共6组。接种瘤细胞24h后，试验组腹腔注射番荔枝内酯提取物，剂量分别为15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg，阴性对照组和肿瘤模型对照组等体积注射药物溶媒，5-FU对照组以生理盐水为溶剂，剂量为20mg/kg，各组动物均按0.2ml在腹腔注射，连续给药10d。末次给药后次日，进行如下观察：

完整剥离瘤块，并称重计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤重量-治疗组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100％。

3、实验结果：

番荔枝内酯提取物对小鼠移植性乳腺癌的生长抑制作用：不同剂量的番荔枝内酯提取物均能显著抑制小鼠移植性乳腺癌的生长(P＜0.01)。番荔枝内酯提取物的剂量极小，其抗乳腺癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)的百倍以上，见表2。

表2番荔枝内酯提取物对小鼠移植性乳腺癌作用结果

实施例4：番荔枝内酯提取物对移植性肝癌的抑制作用

3、实验动物和瘤株

雄性健康昆明种小鼠，体重18-22g，鼠龄6-8周，来自本校动物实验中心；昆明鼠传代腹水型鼠肝癌HepS瘤株均购自江苏省肿瘤研究所动物实验中心。小鼠在南京中医药大学动物实验中心的动物实验房饲养，温度21～25℃，湿度为45％～55％。

2、造模与实验方法

昆明种雄性小鼠60只，按比例随机留10只为阴性对照组，其余50只进行造模。无菌抽取接种HepS瘤种8天的小鼠的腹水，以生理盐水稀释10倍，0.02％伊红染色，滴加到细胞计数板上计数后，调细胞浓度至1×10⁷/ml，迅速地分别将50只小鼠右腋皮肤消毒，每鼠接种0.2mlHepS肿瘤细胞悬液于皮下。整个接种过程须在无菌罩内以无菌操作进行，1h内完成接种。

接种后随机分为5组，每组10只，分别为肿瘤模型对照组、15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg试验组、5-fu阳性对照组，另加阴性对照组，共6组。接种瘤细胞24h后，试验组腹腔注射番荔枝内酯提取物，剂量分别为15μg/kg、30μg/kg和60μg/kg，阴性对照组和肿瘤模型对照组等体积注射药物溶媒，5-FU对照组以生理盐水为溶剂，剂量为20mg/kg，各组动物均按0.2ml在腹腔注射，连续给药8d。末次给药后次日，进行如下观察：

完整剥离瘤块，并称重计算肿瘤抑制率，肿瘤抑制率＝(对照组肿瘤重量-治疗组肿瘤重量)/对照组肿瘤重量×100％。

3、实验结果：

番荔枝内酯提取物对小鼠移植性肝癌HepS的生长抑制作用：不同剂量的番荔枝内酯提取物均能显著抑制小鼠移植性肝癌HepS的生长(P＜0.01)。番荔枝内酯提取物的剂量极小，其抗肝癌活性是化疗药5-氟脲嘧啶(5-FU)的百倍以上，见表3。

表3番荔枝内酯提取物对小鼠移植性肝癌HepS作用结果

Claims (9)

1.一种番荔枝内酯提取物，其特征在于它是从番荔枝种子中提取分离得到的一种抗癌活性成分。

2.一种提取权利要求1所述提取物的方法，其特征在于提取步骤如下：

(1)将番荔枝种子粉碎成粗粉，用乙醇回流提取，乙醇提取液常压浓缩后，依次用石油醚、水饱和乙酸乙酯、氯仿萃取，合并萃取液浓缩干燥，得到番荔枝内酯；

(2)将上述的番荔枝内酯经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇梯度洗脱，将收集到的番荔枝内酯提取物浓缩干燥；

(3)再经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，用薄层层析检查，以碘化铋钾试剂显色，将收集到的番荔枝内酯提取物浓缩、干燥，其含量为质量份数的50％～90％。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于在步骤(1)中所述的乙醇浓度为95％～97％，回流提取3次，依次用10倍量的石油醚20℃～60℃、水饱和乙酸乙酯、氯仿萃取3次。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于在步骤(2)中所述硅胶柱层析，其硅胶粒度为100～300目，与萃取物的质量比为10∶1～20∶1，以体积比为100∶0～90∶10的氯仿-甲醇梯度洗脱。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于在步骤(3)中所述的硅胶柱层析，其硅胶粒度为100～300目，与番荔枝内酯提取物的质量比为10∶1～50∶1；以体积比为100∶0～90∶10的石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。

6.如权利要求1所述的番荔枝内酯提取物在制备治疗肺癌药物中的应用。

7.如权利要求1所述的番荔枝内酯提取物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。

8.如权利要求1所述的番荔枝内酯提取物在制备治疗肝癌药物中的应用。

9.根据权利要求6或7或8所述的应用，其特征在于番荔枝内酯提取物在体内对肺癌、乳腺癌或肝癌细胞有明显的抑制作用，其抗癌活性高于化疗药物5-氟脲嘧啶。