CN104825462B - 白肉灵芝提取物的抗炎用途 - Google Patents

Abstract

本申请公开了白肉灵芝提取物的抗炎用途。具体公开了所述提取物在制备用于预防和/或治疗炎症的药物或食品中的应用。所述炎症是选自肝炎、肺炎、胃炎、肠炎中的至少一种。所述提取物在抗炎方面显示出显著效果。

Description

白肉灵芝提取物的抗炎用途

技术领域

本发明涉及药用提取物，具体涉及白肉灵芝提取物用于抗炎方面的应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.)隶属于真菌门(Eumycota)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、灵芝科(Gamodermataceae)、灵芝属(Ganoderma)类。《中华本草》中记录“其性甘；味平；无毒；归肺、心、脾、肾经。益气血；安心神；健脾胃。主治虚劳、心悸、失眠、头晕、神疲乏力、久咳气喘、冠心病、矽肺、肿瘤。”《中国药典》中将灵芝收录为中药材，其中的灵芝多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等成分是其药效物质的主要基础，以三萜和多糖为其中主要活性成分。现代药理研究表明，灵芝三萜类化合物具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-4及HIV-4蛋白酶活性、抗组织胺释放、抑制血管紧张素、抗氧化等作用。

灵芝分类历史悠久，归类各有不同，《本草纲目》等古籍中以“六色”将灵芝归为：青芝、赤芝、黄芝、白芝、黑芝、紫芝。近日广东省微生物研究所李泰辉等人在真菌学杂志《Mycoscience》发表文章宣布他们在西藏林芝地区发现了一个灵芝新种——白肉灵芝Ganoderma leucocontextum(Li TH,Hu HP,Deng WQ,et al.Ganoderma leucocontextum,anew member of the G.lucidum complex from southwestern China.Mycoscience,2015,56(1)：81-85.)。中国西藏新闻网2014年8月报道西藏自治区农牧科学院研究人员白肉灵芝人工栽培获得成功。针对白肉灵芝的食用及药用价值急需进行系统研究和开发。

发明内容

本发明以白肉灵芝Ganoderma leucocontextum为研究对象，对其提取物进行了化学和生物活性研究，发现白肉灵芝提取物具有很好的抗炎作用，具有很好的药用和食用价值。

为此，本发明的第一方面，提供白肉灵芝提取物在制备用于预防和/或治疗炎症的药物中的应用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的组合，

本发明的白肉灵芝Ganoderma leucocontextum提取物是按照如下的方法制备的，所述方法包括如下步骤：

用提取溶剂提取白肉灵芝的子实体至少一次；和

去除溶剂以获得所述提取物。

所述提取溶剂可选自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、卤代C1～C3烷烃、R1C(O)R2中的一种，或者两种或更多种的混合溶剂，其中R1和R2各自独立地为C1～C3烷基。

所述提取溶剂优选选自水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一种或多种。

特别优选所述提取溶剂为20～98％(v/v)的乙醇水溶液，更优选40～98％(v/v)、最优选70～95％(v/v)的乙醇水溶液。

白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比(g:ml或kg:L)为1:3～10；优选为1:2～5；最优选为1:3。

为提高提取效果，优选事先将白肉灵芝的子实体碎化。

所述提取方法可以是任何适宜的方法，例如但不限于浸渍提取、超声提取、加热回流提取等。

提取温度为室温～105℃，优选20～50℃。本文中所说室温通常指18～30℃。

根据一种实施方式，提取可进行1～5次，优选提取2～4次，最优选为3次。

提取时间为每次15min～2小时，优选为30～70min。

优选地，所述提取溶剂可回收再利用。

去除或回收提取溶剂的方法可根据不同溶剂灵活选取。例如可以进行蒸馏或减压蒸馏等。

根据本发明的另一种实施方式，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用弱极性有机溶剂萃取以除去脂溶性杂质；

用萃取剂萃取水相；和

取萃取剂层并去除萃取剂。

所述萃取剂可选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种，优选乙酸乙酯。

用于除去脂溶性杂质的弱极性有机溶剂可以是常用用萃取分离有机物的那些非极性溶剂。例如可选自C5～C12的烷烃、C5～C8的环烷烃、卤代C1～C3烷烃、石油醚中的一种或多种。根据一种实施方式，所述有非极性机溶剂可选自正己烷、正庚烷、正辛烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷、沸点60～90℃的石油醚中的一种或多种。优选使用所述石油醚和/或环己烷。

可用所述弱极性有机溶剂进行多次萃取以尽量除去脂溶性杂质。例如可萃取2～5次。

用萃取剂的萃取也同样可进行多次。例如可为2～5次。

所述弱极性有机溶剂以及所述萃取剂的用量分别为每次为水相体积的50～200％；优选用与水相等体积的弱极性有机溶剂(或萃取剂)进行萃取。

根据本发明的一种实施方式，所述提取溶剂为水、或选自C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯中的一种或多种溶剂的40％(v/v)以下(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(v/v))的水溶液，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用萃取剂萃取所获得的提取液；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

所述萃取剂可为选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种，优选乙酸乙酯。

同样的，用萃取剂的萃取可进行多次。例如可为2～5次。

所述萃取剂的用量分别为每次为水相体积的50～200％；优选用与水相等体积的萃取剂进行萃取。

该实施方式可获得水溶性更好的提取物，以便制备水溶剂或茶饮等产品。

所述炎症是选自肝炎、肺炎、胃炎、肠炎中的至少一种。

本发明的第二方面提供含有上述白肉灵芝提取物的可食用的产品用于抗炎的用途。其中白肉灵芝提取物中含有下式1和式2所示的化合物的组合。

所述炎症为肝炎、肺炎、胃炎、肠炎等。其中，胃炎例如急性、慢性胃炎，胃溃疡等；肝炎例如细菌性肝损伤、药物性肝损害、病毒性肝损伤、脂肪肝等；肺炎例如细菌性肺炎、病毒性肺炎等；肠炎例如细菌性肠炎、慢性肠炎等。

所述可食用的产品具体形式可为口服液、茶饮、含片、胶囊、饮品、泡腾片等等。

本发明的研究发现，白肉灵芝可采用任何常规的溶剂，包括水进行提取，提取方法简单，提取物可溶于水。提取物中含有较大量的三萜类化合物，并经验证具有显著的抑制炎症发生的效果。因此，白肉灵芝的提取物具有广阔的药用和食用的应用前景。

附图说明

图1为用不同有机溶剂提取白肉灵芝粗提物的HPLC指纹图谱；和

图2为根据本发明一种实施方式获得的白肉灵芝提取物的HPLC图谱。

具体实施方式

参照附图及以下详细描述的优选实施方式和具体实施例，更加详细地说明本发明的各个方面和上述的及其他的优点。本领域技术人员应理解，下面描述的这些内容是为了更好地理解本发明，本发明的范围并不受限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

白肉灵芝由西藏自治区农科院蔬菜研究所提供。

实施例1白肉灵芝乙醇提取物的制备

将白肉灵芝子实体剪碎，称重5000克。用15L体积百分含量95％乙醇的水溶液回流提取3次，每次1小时。合并提取液，减压浓缩干燥得到170克提取物，将提取物记作GL-1。

进一步将提取物用蒸馏水600ml溶解，用等体积的正己烷萃取三次，弃去有机相。再用等体积乙酸乙酯萃取水相三次，弃去水相，合并乙酸乙酯萃取液。用旋转蒸发仪蒸干乙酸乙酯获得浸膏54g，记作GL-1E。

实施例2纯化及鉴定实施例1GL-1E提取物中的主要化合物

取40g实施例1制备的提取物GL-1E，通过硅胶柱色谱分离，以正己烷:乙酸乙酯体系和二氯甲烷:甲醇体系依次进行梯度洗脱，每个梯度洗3个保留体积，每个体积500ml。在二氯甲烷:甲醇(体积比为100:1)中得到馏分19，命名为GL-E19。

GL-E19(10.5g)利用ODS反相硅胶柱分离，用体积百分含量为10％～100％甲醇的水溶液依次进行洗脱，每个洗脱体系3个保留体积，每个保留体积为500ml，每300ml收集一个馏分。体积百分含量为40％的甲醇水溶液系统的第三个馏分和体积百分含量为50％的甲醇水溶液系统的第三个馏分，分别命名为GL-E19-23和GL-E19-27。

对GL-E19-23以体积百分含量40％乙腈的酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集28min的色谱峰，得到化合物1。对GL-E19-27以体积百分含量42％乙腈酸水(此处的酸水为体积百分含量为0.01％三氟乙酸的水溶液)溶液为洗脱剂进行HPLC制备，流速为2ml/min，收集25.2min的色谱峰得到化合物2。上述HPLC色谱条件如下：以色谱纯的甲醇将样品配制为10mg/ml的溶液，上样量为15ul每次，色谱柱为Kromasil 10×250mm C18半制备柱，柱温为25℃，210nm波长进行检测。

化合物1和化合物2通过鉴定，结构式如下式1、式2所示，数据归属见表1和2。

表1化合物1和化合物2的¹³C NMR数据(125MHz，CDCl₃)

表2化合物1和化合物2的¹H NMR数据(Jin Hz,500MHz，CDCl₃)

实施例3提取物GL-1的指纹图谱检测

高效液相化学指纹图谱分析条件如下：使用Agilent1200高效液相色谱仪，四元梯度泵，DAD检测器，Agilent色谱工作站。色谱柱YMC C8分析柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相为乙腈-体积百分含量0.04％的三氟乙酸的水溶液，温度室温(20～30℃)的条件下进行梯度洗脱(洗脱程序以及各成分的体积百分含量如下所示)，流速1.00mL/min。将粗提物G1用乙腈溶解，配成10mg/mL的溶液，进样量10μl，紫外检测波长为210nm。

梯度洗脱步骤如下表3：

表3

按照上述洗脱条件得到提取物GL-1的色谱图如图1所示，并对实施例2分离得到的2个化合物进行指认，这两个化合物的峰面积占总峰面积的10.82％。

实施例4用甲醇提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:甲醇＝1g:3ml的量加入甲醇，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-2。甲醇纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-2进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的6.58％。

实施例5:用乙酸乙酯提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:乙酸乙酯＝1g:3ml的量加入乙酸乙酯，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，即提取物GL-3。乙酸乙酯纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-3进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的8.45％。

实施例6:用二氯甲烷提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:二氯甲烷＝1g:3ml的量加入二氯甲烷，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到粗提物GL-4。所述二氯甲烷纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-4进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1和2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的12.38％。

实施例7:用丙酮提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:丙酮＝1g:3ml的量加入丙酮，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-5。所述丙酮纯度为分析纯，购自北京化学试剂公司。

将GL-5进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图1所示，1-2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的6.31％。

实施例8:用水提取白肉灵芝

将所述白肉灵芝子实体剪碎，按照子实体:水＝1g:3ml的量加入去离子水，浸泡超声提取3次，每次30分钟，将提取液用旋转蒸发仪蒸干获得浸膏，得到提取物GL-6。将GL-6提取物浸膏用适量蒸馏水混悬，然后用等量乙酸乙酯萃取三次，旋转蒸发仪蒸干溶液获得水提物的乙酸乙酯浸膏GL-6E。所述水为去离子水。

将GL-6E进行高效液相色谱检测，分析条件同实施例3所述。如图2所示，1-2标示的峰与从GL-1E中分离得到的2个化合物一致，这两个化合物的峰面积占总峰面积的12.24％。

实施例9白肉灵芝提取物对脂多糖LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放NO的抑制活性测试

实验材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)，以及阳性药氢化可的松(sigma)。准确称取各样品，用DMSO(二甲亚砜)配制成50mg/ml溶液(制备时溶于少量DMSO后，再用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积百分含量<1％)，用DMEM培养基进行2倍梯度稀释，共8个浓度，供活性测试。DMEM、胎牛血清和马血清购自Gibco公司。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7(ATCC TIB-71)培养于含10％热灭活(56℃,30min)胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素钠(Gibco)、100μg/ml链霉素(Gibco)的RPMI1640(Gibco)培养液中，37℃下，5％CO₂的恒温培养箱中孵育。脂多糖LPS购自SIGMA公司。N-萘乙二胺盐酸盐(北京韵邦生物科技有限公司)，对氨基苯磺酰胺(上海士锋科技有限公司)。

实验方法：白肉灵芝提取物对脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞释放NO的抑制活性参考文献方法(Giang PM,Jin HZ,Son PT,Lee JH,Hong YS,Lee JJ.ent-Kauranediterpenoids from Croton tonkinensis inhibit LPS-induced NF-κBactivation and NO production.Journal of Natural Products,2003,66(9),1217-1220.)。LPS是革兰氏阴性细菌致病的主要因素，刺激体内多种细胞合成和释放众多内源性生物活性因子，导致全身性炎症反应发生，由此引起全身炎症反应综合征。RPMI1640培养液将RAW264.7细胞稀释制成1×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种于96孔板中(每孔200μL)，每组设三个平行孔。CO₂培养箱中培养1h后每孔加入终浓度为1μg/mL的LPS(Sigma)和DMSO溶解的不同浓度的测试样品0.4μL(或阳性药氢化可的松0.4μL)，同时设定LPS组(加入LPS，但不加样品，对NO释放的抑制率为0％)和空白对照组(不加LPS和样品，仅加入0.4μL DMSO，对NO释放的抑制率为100％)。37℃下，5％CO₂的恒温培养箱中培养24h，吸取上清100μL到酶标板上，离心(1000*g，4℃，3min)，加入100μL Griess reagent(Griess reagent A：0.1％N-萘乙二胺盐酸盐溶液；Griess reagent B：1％对氨基苯磺酰胺溶液+5％磷酸溶液，使用前1:1混合)于96孔板混合，室温静止10min后，用酶标仪在540nm处测定OD值。

由于NO极不稳定，在细胞培养上清液中代谢成为亚硝酸基NO₂ ^-,故采用Griess法测定样品中NO₂ ^-的浓度作为衡量NO水平的指标。用浓度分别为1、5、10、50μmol/L的NaNO₂绘制标准曲线，根据NaNO₂标准曲线计算细胞培养上清液中NO₂ ^-的浓度以及对NO释放的抑制率，抑制率计算公式为：

实验结果：结果如表4所示，式(Ⅰ)所示化合物对小鼠单核巨噬细胞NO释放显示出较强的抑制力，即具有较强的抗炎活性。

表4

提取物	IC50，μg/ml	提取物	IC50，μg/ml
				GL-1E	24.6±3.25	GL5	54.3±9.35
GL1	59.8±4.98	GL-6	62.8±7.06
				GL2	76.3±6.25	GL-6E	31.3±6.02
GL3	88.2±12.5	氢化可的松	16.76±3.08
				GL4	67.9±8.72

实施例10白肉灵芝提取物对药物性肝损伤小鼠的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。SPF级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。谷丙转氨酶ALT试剂盒(批号20131006)、丙二醛MDA试剂盒(批号20140502)、谷胱甘肽GSH试剂盒(批号2040906)购自南京建成生物工程研究所。

方法：取雄性SPF级昆明种小鼠，20±2g，适应性饲养一周后进行实验，随机分为9组，每组12只。各组分别灌胃给与0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，连续10天，空白组和模型组给予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次给药2小时后，空白组腹腔注射给予花生油0.2ml，其余各组按照0.1ml/10g体重的给药剂量给予四氯化碳花生油(0.2％)。禁食不禁水20小时后，麻醉处死小鼠，心脏取血和肝脏。测定血清ALT和肝脏MDA、GSH含量。

结果：本模型模拟了药物性肝损伤，主要是指环境污染、饮食饮酒及长期用药引起的肝损伤，同时也可以模拟肝细胞变性、纤维增生而导致的肝硬化、肝小叶结构紊乱等肝病(施彦等.沙棘籽油对小鼠实验性肝硬化的保护作用及参数分析.医学研究生学报,2006,19,40-42.)。与对照组比较，白肉灵芝提取物显著的抑制了四氯化碳引起的小鼠血清ALT及肝脏MDA含量的升高及GSH含量的降低，对四氯化碳引起的肝损伤具有保护作用，见表5。

表5

分组	ALTU/L	MDAnmol/g	GSHnmol/g
				空白组	37.56±5.85	412.58±15.69	3.98±0.67
模型组	152.07±26.02##	1537.46±240.07##	3.12±0.52#
				GL-1E	49.85±15.98**	628.74±120.36**	4.48±0.54**
GL1	96.67±14.89**	1322.58±315.08	3.69±0.71
				GL2	108.51±25.02*	1472.44±222.68	3.72±0.63
GL3	90.24±17.36**	1327.85±231.09	3.92±0.28*
				GL4	109.4±18.02*	1409.37±130.08	3.61±0.43
GL5	118.7±27.04*	1398.45±317.72	3.79±0.57
				GL6	96.52±12.58**	1425.58±265.87	3.87±0.49
GL-6E	62.9±15.91**	916.28±134.28*	4.18±0.46*

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比

^#P<0.05，^##P<0.01与空白组相比

实施例11白肉灵芝提取物对细菌性肝损伤小鼠的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。SPF级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。谷丙转氨酶ALT试剂盒(批号20131006)购自南京建成生物工程研究所。Mouse TNF-αELISA试剂盒购自R&D公司(美国)。

方法：取雄性SPF级昆明种小鼠，20±2g，适应性饲养一周后进行实验，随机分为9组，每组12只。各组分别灌胃给与0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，连续10天，空白组和模型组给予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次给药2小时后，空白组腹腔注射给予RPMI-1640培养基0.2ml，其余各组按照0.1ml/10g体重的给药剂量给予LPS(4mg/kg)。禁食不禁水6小时后，麻醉处死小鼠，心脏取血和肝脏。测定血清ALT和肝脏TNF-α。

结果：LPS是革兰氏阴性细菌致病的主要因素，本模型用LPS模拟了细菌性肝损伤，同时也有报道表明LPS可加重酒精性肝损伤、四氯化碳肝病及肝硬化引起的肝损伤(VishnyakovaTG,et al.J Biol Chem,2003,278(25):22771-22780)。在我们的研究中，与空白对照组比较，白肉灵芝提取物显著的抑制了LPS引起的小鼠血清ALT含量的升高及肝脏TNF-α含量的的降低，对LPS引起的肝损伤具有保护作用，见表6。

表6

分组	ALTU/L	TNF-α(pg/mL)
			空白对照组	27.56±6.25	87.53±10.58
模型组	102.05±23.08##	61.28±12.28
			GL-1E	39.28±6.48**	98.25±16.11**
GL1	94.57±12.69*	71.47±14.28*
			GL2	88.42±24.24*	68.55±9.42
GL3	64.24±17.44*	65.27±4.72
			GL4	79.37±18.22*	70.55±5.69
GL5	78.45±27.84*	72.29±4.39*
			GL-6	64.58±19.25*	74.26±5.71*
GL-6E	52.65±15.11**	85.47±14.28**

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比

^#P<0.05，^##P<0.01与空白组相比

实施例12白肉灵芝提取物对病毒性肝损伤小鼠的作用

测试用肿瘤细胞：将人肝癌细胞HepG2.2.15细胞购自解放军(北京)第302医院，用含体积百分含量10％的胎牛血清的DMEM培养液培养。培养条件均为37℃、5％CO₂培养箱中常规培养，隔天传代。

被测样品溶液：实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用DMSO(二甲亚砜)配制成50mg/ml溶液(制备时溶于少量DMSO后，再用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积百分含量<1％)，用DMEM培养基进行2倍梯度稀释，共8个浓度，供活性测试。阳性对照拉米夫定(葛兰素史克，拉米夫定是核苷类似物，抗病毒药物，对病毒DNA链的合成和延长有竞争性抑制作用，对体外及实验性感染动物体内的乙型肝炎病毒(HBV)有较强的抑制作用。)配制成50mg/ml水溶液(制备时溶于少量DMSO后，再用蒸馏水稀释至相应浓度，控制DMSO的最终体积百分含量<1％)，用DMEM培养基溶液进行2倍梯度稀释，共8个浓度。

采用细胞增殖抑制活性测试方法(MTT法)测试样品的抗肿瘤细胞增殖活性。乙肝表面抗原及e抗原检测试剂盒为华美生物工程公司产品。

取对数生长期的HepG2.2.15，用胰酶消化，制成每毫升含3×10⁴个细胞的单细胞悬液，接种于96孔板内(每孔100μL)，每组设3个平行孔。在37℃下24小时后加入1μl上述不同浓度的被测样品溶液，作为给药组，同时设空白对照组(1μl DMSO替代上述的被测样品溶液)和阳性对照组(1μl不同浓度的拉米夫定溶液替代上述的被测样品溶液)，培养11天，收集上清液。用酶联免疫法，按照乙肝表面抗原及e抗原检测试剂盒进行检测。药物对抗原的抑制率＝(1-给药组OD值/空白对照组OD值)×100％，计算IC₅₀。吸去上清后的细胞孔中加入100μL含0.4g/L的MTT的RPMI-1640溶液，再培养4小时，移出培养液后加入150μL DMSO溶解甲臜，在540nm处测定其吸收度，检测药物对细胞的毒性(％)。抑制率(％)(I)＝(1-给药组OD值/空白对照组OD值)×100％，并计算CC₅₀(药物半数毒性浓度，即试验孔存活细胞为50％时的药物浓度)。

结果如表7所示，白肉灵芝提取物具有一定的抗乙肝病毒活性，对HBsAg和HBeAg都有一定的抑制作用。

表7

提取物	CC50(μg/ml)	HBsAgIC50(μg/ml)	HBeAgIC50(μg/ml)
				GL-1E	307.9±65.8	35.72±3.85	159.67±16.30
GL1	>500	239.24±34.06	383.9±28.91
				GL2	382±39.1	268.27±12.09	425.8±30.75
GL3	408.96±29.07	305.75±29.87	459.8±42.09
				GL4	451.08±35.80	325.84±26.70	391.7±30.28
GL5	403.08±12.39	401.8±36.54	408.7±40.29
				GL6	458.93±18.97	368.15±28.79	368.47±36.97
GL-6E	429.85±20.58	369.57±29.80	261.08±26.30
				拉米夫定	>500	37.25±7.82	98.28±10.08

实施例13白肉灵芝提取物对脂肪肝大鼠的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。谷丙转氨酶ALT试剂盒(批号20131006)、丙二醛MDA试剂盒(批号20140506)均购自南京建成生物工程研究所。

方法：取雄性健康SD大鼠，200±20g，大鼠适应性饲养一周后进行实验，随机分为8组，每组10只。空白对照组给予蒸馏水灌胃(10ml/kg)，模型组和给药组给予脂肪乳剂灌胃(10ml/kg)(脂肪乳剂：猪油25g，胆固醇10g，1g丙赛优，加热融化充分搅匀，加入25ml吐温80，制成油相。另2g脱氧胆酸钠、30ml蒸馏水、1，2丙二醇20ml，加热溶解，制成水相。然后水相和油相充分混匀，即制成脂肪乳剂。)，每天一次，连续3周。同时各组大鼠分别每天在给予脂肪乳剂6小时后，灌胃给与1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，空白对照组和模型对照组给予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次给药后，取血，4摄氏度3000rpm离心，测定血清谷丙转氨酶ALT、肝匀浆丙二醛MDA含量。

结果：与对照组比较，上述提取物可以显著改善大鼠高血脂脂肪肝的情况，对大鼠血清ALT和肝匀浆MDA也有很好的逆转作用，提示可以保护高血脂性脂肪肝，结果见表8。

表8

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比

^#P<0.05，^##P<0.01与空白组相比

实施例14白肉灵芝提取物对慢性胃炎的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。SPF级SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。一氧化氮NO试剂盒(批号20140105)、NOS试剂盒(批号20130507)购自南京建成生物工程研究所、胃泌素试剂盒购自解放军总医院科技开发中心放免所(批号130815)。

方法：取雄性SPF级SD大鼠，220±20g，适应性饲养一周后进行实验。随机取出10只作为空白对照组，其他大鼠以1.5ml/100g的剂量灌胃给予1.5％的脱氧胆酸钠，连续60天，同时每周灌胃60％乙醇一次。60天后，各给药组分别灌胃给与1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，连续30天，空白组和模型组给予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次给药后禁食禁水12小时，眼眶取血。离心留取血清，采用试剂盒测定血清NOS、NO和胃泌素的含量。

结果：与对照组比较，白肉灵芝提取物显著的改善了胃组织炎症的病理生化环境，具有改善胃肠炎症和消化分泌功能的作用趋势，见表9。

表9

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比

^#P<0.05，^##P<0.01与空白组相比

实施例15白肉灵芝提取物对大鼠乙醇型胃溃疡的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。SPF级SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。。

方法：取雄性SPF级SD大鼠，200±20g，适应性饲养一周后进行实验。随机分为9组，各给药组分别灌胃给与1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，连续10天，空白组和模型组给予等量的0.5％CMC-Na溶液。末次给药后禁食禁水2小时后，大鼠灌胃给予无水乙醇1ml/200g，1小时后处死大鼠。剖腹，结扎贲门和幽门，向胃内注入4％福尔马林溶液10ml。取胃，浸入4％福尔马林溶液固定0.5小时后，沿胃大弯剖开，观察胃黏膜溃疡形成情况，并测量胃溃疡面积，计算胃溃疡抑制率：溃疡抑制率(％)＝(对照组溃疡面积-给药组溃疡面积)/对照组溃疡面积×100％。

结果：与对照组比较，白肉灵芝提取物对无水乙醇造成的胃溃疡有显著的对抗作用，见表10。

表10

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比

^#P<0.05，^##P<0.01与空白组相比

实施例16白肉灵芝提取物对致敏小鼠抗原攻击后支气管肺灌流液中炎症细胞的作用

材料：被测样品溶液为实施例1和实施例4～8所述的8个提取物(GL-1E、GL-1～GL-6和GL-6E)。准确称取各样品，用0.5％CMC-Na溶液配制100mg/ml溶液，供活性测试。SPF级昆明种小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，温度20～24摄氏度，恒湿50～60％，光照12小时(8:00～20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。。

方法：取雄性SPF级昆明种小鼠，20±2g，适应性饲养一周后进行实验。随机分为9组，各给药组分别灌胃给与0.1ml的100mg/ml提取物溶液(相当于500mg/kg)，连续10天，空白组和模型组给予等量的0.5％CMC-Na溶液。小鼠乙醚麻醉，0.1％卵白蛋白(sigmachemical Co.,grade V；用10％的氢氧化铝凝胶配制)于两后足掌，两腹股沟，两腋下，颈部以及背部共八点皮下注射0.4mL，致敏第10天腹腔注射0.1％卵白蛋白氢氧化铝凝胶0.2mL再次致敏1次，第2次致敏11天后，用1％的卵白蛋白(生理盐水配制)雾化吸入进行攻击，每次30分钟，连续攻击6天。每次攻击前1小时根据分组给药，末次攻击后24小时后取出小鼠支气管进行肺泡灌洗。脱臼处死小鼠，纵行剪开颈部皮肤，分离暴露气管，行气管插管，用灌洗液(Thornwell-Mcdowell溶液：NaCl 6.6g,KCl 0.46g,CaCl₂0.05g,NaHCO₃2.52g,MgCl₂0.09g,Na₂HPO₄0.1g,加水至1000mL)灌洗，每次0.5mL，共3次，收集支气管肺泡灌洗液，摇匀后取出50微升，用白细胞稀释液稀释4倍，取少量滴于细胞计数板上，在显微镜下计数白细胞总数。将支气管肺泡灌洗液低温1000rpm离心10min后，弃去上清液，用移液器打匀后涂片。涂片室温干燥，染色6-8min，复染1分钟。用自来水将染料冲洗干净，在光学显微镜40倍镜下进行白细胞分类计数。计数200个细胞，计算淋巴单核细胞以及嗜酸性粒细胞的百分比。结果：如表11，表明白肉灵芝提取物对小鼠哮喘模型支气管肺泡的炎症细胞聚集有明显的抑制作用。

表11

*P<0.05，**P<0.01与模型组相比

^#P<0.05，^##P<0.01与空白组相比。

Claims (20)

1.白肉灵芝提取物在制备用于预防和/或治疗肝炎、胃炎和/或肺炎的药物中的应用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的组合，

2.根据权利要求1所述的应用，所述提取物通过如下方法获得，包括：

用提取溶剂提取白肉灵芝的子实体至少一次；和

去除溶剂以获得所述提取物，

其中，所述提取溶剂选自水、C1～C4烷基醇、甲酸C1～C3烷基酯、乙酸C1～C3烷基酯、卤代C1～C3烷烃、R1C(O)R2中的一种，或者两种或更多种的混合溶剂，其中R1和R2各自独立地为C1～C3烷基。

3.如权利要求2所述的应用，其中所述提取溶剂选自水、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、甲酸甲酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、丙酮、丁酮、戊酮中的一种或多种。

4.如权利要求3所述的应用，所述提取溶剂为20～98％(v/v)的乙醇水溶液。

5.如权利要求3所述的应用，所述提取溶剂为40～98％(v/v)的乙醇水溶液。

6.如权利要求3所述的应用，所述提取溶剂为70～95％(v/v)的乙醇水溶液。

7.如权利要求2所述的应用，其中白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比为1:3～10；提取温度为18℃～105℃，且提取1～5次。

8.如权利要求7所述的应用，其中白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比为1:3～5。

9.如权利要求7所述的应用，其中白肉灵芝的子实体与所述提取溶剂的重量体积比为1:3。

10.如权利要求7所述的应用，其中白肉灵芝的子实体的提取温度为20℃～50℃。

11.如权利要求7所述的应用，其中白肉灵芝的子实体提取次数为2～4次。

12.如权利要求7所述的应用，其中白肉灵芝的子实体提取次数为3次。

13.如权利要求2所述的应用，其中所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用弱极性有机溶剂萃取以除去脂溶性杂质；

用萃取剂萃取水相；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

其中，所述萃取剂为选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种。

14.如权利要求13所述的应用，其中所述弱极性有机溶剂选自C5～C12的烷烃、C5～C8的环烷烃、卤代C1～C3烷烃、石油醚中的一种或多种。

15.如权利要求13所述的应用，其中所述弱极性有机溶剂选自正己烷、正庚烷、正辛烷、环己烷、氯仿、二氯乙烷和沸点60～90℃的石油醚中的一种或多种。

16.如权利要求13所述的应用，其中所述弱极性有机溶剂为沸点60～90℃的石油醚和/或环己烷。

17.如权利要求2所述的应用，其中所述提取溶剂为水、或为C1～C4烷基醇的40％(v/v)以下的水溶液，所述方法进一步包括以下步骤：

将所获得的提取物分散于水中，用萃取剂萃取所获得的提取液；和

取萃取剂层并去除萃取剂，

其中，所述萃取剂为选自乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷和正丁醇中的一种。

18.如权利要求17所述的应用，其中所述提取溶剂为选自C1～C4烷基醇的30％(v/v)以下的水溶液。

19.如权利要求17所述的应用，其中所述提取溶剂为选自C1～C4烷基醇的20％(v/v)以下的水溶液。

20.白肉灵芝提取物在制备用于预防和/或治疗肝炎、胃炎和/或肺炎的食品中的应用，所述提取物中含有式1和式2所示的化合物的组合，