CN112980998B

CN112980998B - 白肉灵芝优质菌株i140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法

Info

Publication number: CN112980998B
Application number: CN202110460314.XA
Authority: CN
Inventors: 刘远超; 胡惠萍; 吴清平; 谢意珍; 陈晓光; 蔡曼君; 梁晓薇; 吴晓贤; 王傲; 李向敏; 肖春; 黄龙花
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2021-04-27
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2041-04-27
Also published as: CN112980998A

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。所述鉴定方法包括如下步骤：提取待测灵芝样品DNA为模板，以特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在750bp～800bp之间出现特异性条带的样品为白肉灵芝优质菌株I140033。本发明有利于白肉灵芝优质菌株I140033在产业化应用过程中的鉴定与保护。

Description

白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法。

背景技术

灵芝是我国最重要的药用菌之一，已有两千年多年的记载和使用历史。古籍记载灵芝具有“久食轻身不老，延年神仙”，是世人皆知的人间“仙草”。现代医学研究已证实，灵芝含有300余种化合物，具有生理活性的成分主要是灵芝多糖、三萜类化合物、核苷类、甾醇等，灵芝及其提取物具有免疫调节、抗肿瘤、保肝解毒、降血糖等功效。目前已被中国药典及美国药典所收录。白肉灵芝[Ganoderma leucocontextum T.H.Li etal.]是本课题组核心成员采集并参与发表的中国西南地区灵芝属的一个重要新物种，在林芝地区分布广泛，通常夏秋季节散生、群生于青冈树近树干基部的腐木上，宏观形态与市场上的灵芝[G.lucidum (W.Cur.Fr.)Karst.]和四川灵芝[G.sichuanense J.D.Zhao&X.Q.Zhang]很相近，因此极易混淆使用。在未被学术界认定为新种前，当地常以“白灵芝”、“藏灵芝”等名称区别于灵芝和四川灵芝，由于其多糖和三萜类化合物含量比其他灵芝要高数倍，因此售价更为高昂。现有的细胞和动物实验已经验证，白肉灵芝具有降血糖、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒等功效，巨大的商业应用和科研价值，推动了白肉灵芝人工驯化的栽培，目前西藏全区已经实现白肉灵芝的规模化人工栽培。菌种的质量决定着栽培的产量和性状，本课题组经过多年的野生食药用菌资源调查，得到了一大批白肉灵芝菌种，经过筛选、选育和试种，获得了数株性状优良的菌种，其中I140033菌株经试种发现其菌丝生物学特征和栽培农艺性状优异，与其他白肉灵芝菌株相比，I140033菌株的菌丝长速较快，栽培子实体菇型稳定，产量较高，具有规模化应用潜力。由于大型真菌菌种极易被复制，为保护产权，需要利用分子生物学技术对优质菌种开展分子标记，以为其产业化应用奠定保护的基础。

发明内容

基于以上现有技术，本发明的首要目的在于提供一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记。

本发明的另一目的在于提供上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的特异性引物。

本发明的再一目的在于提供上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记，所述白肉灵芝优质菌株I140033为Ganoderma leucocontextum HMGIM-I140033，于2021年3月29日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61579，保藏地址：广州市先烈中路100号；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的特异性引物，所述特异性引物为sca13_92_F 和sca13_92_R，特异性引物的核苷酸序列如下所示：

sca13_92_F：ATGAGGACGAGGTCAGACCA(SEQ ID NO：2)；

sca13_92_R：GTGGCACCAAGACGTCAAAC(SEQ ID NO：3)。

上述白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，包括如下步骤：

提取待测灵芝样品DNA为模板，以特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在750bp～800bp之间出现特异性条带的样品为白肉灵芝优质菌株I140033。

进一步地，所述PCR扩增反应体系如下：

Taq PCR Master Mix(生工B110006)12.5μL；

引物sca13_92_F(10μmol/L)1μL；

引物sca13_92_R(10μmol/L)1μL；

ddH₂O 9.5μL；

DNA模板1μL。

进一步地，所述PCR扩增反应程序如下：

步骤1：95℃5min；

步骤2：95℃30sec；

步骤3：55℃30sec；

步骤4：72℃1min；

步骤5：重复步骤2～4，35个循环；

步骤6：72℃10min。

进一步地，所述琼脂糖凝胶电泳检测条件为：将PCR产物及DNA Marker点样于2％(质量体积比)的琼脂糖凝胶，80V电压下电泳30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的分子标记为白肉灵芝优质菌株I140033的特异性核酸序列，利用该特异性核酸序列能够将I140033菌株与其他白肉灵芝菌株区分开来。有利于白肉灵芝优质菌株 I140033在产业化应用过程中的鉴定与保护。

(2)本发明进一步开发的特异性引物能够有效扩增白肉灵芝优质菌株I140033的特异性核酸序列，为白肉灵芝优质菌株I140033的筛选与鉴定提供了一种简单快速的方法。

附图说明

图1为实施例2中采用特异性引物对33株白肉灵芝菌株样品进行PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本实施例特异性引物的获得：

将经过形态及分子生物学鉴定、低温保藏的白肉灵芝菌株共33株(来自西藏地区，通过野外资源采集和分离获得，见下表1)经25℃培养活化，转接至PDA平板，待培养结束后收集新鲜菌丝体，使用DNA抽提试剂盒提取各菌株的总DNA，使用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG，SEQ ID NO：4)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC， SEQ ID NO：5)完成PCR实验，扩增产物送检测序，将测序结果与模式种ITS序列比对完成鉴定，确定为白肉灵芝。然后开展全基因组重测序，即各样品基因组DNA经超声波处理后形成随机片段，然后，对片段化的DNA进行末端修复、3′端加A、连接测序接头后，再利用磁珠吸附进行富集，富集400bp左右的随机片段，经过PCR扩增形成测序文库。建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina Hiseq^TM平台进行测序，测序策略为Illumina PE150，总测序读长为300bp。在Illumina Hiseq^TM测序数据(Raw Data)下机之后，对下机数据进行质量控制，过滤其中低质量的数据，获得高质量的数据(Clean Data)。利用BWA软件将Clean Data比对到本课题组前期自测的基因组序列上，获得序列的位置归属即BAM文件。利用GATK软件对BAM文件进行校正，完成SNP检测，根据各样本的SNP差异位点完成特异性引物的设计，经过筛选和PCR验证，获得一对特异性引物sca13_92_F： ATGAGGACGAGGTCAGACCA(SEQ ID NO：2)/sca13_92_R： GTGGCACCAAGACGTCAAAC(SEQ ID NO：3)。

表1.白肉灵芝菌株表

实施例2

使用实施例1获得的特异性引物对33株样品进行PCR实验：

使用DNA抽提试剂盒提取如表1所示33株白肉灵芝菌株的DNA为模板，采用实施例1获得的特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应。

其中PCR反应体系：

Taq PCR Master Mix(生工B110006)12.5μL；

引物sca13_92_F(10μmol/L)1μL；

引物sca13_92_R(10μmol/L)1μL；

ddH₂O 9.5μL；

DNA模板1μL。

PCR反应程序：

步骤1：95℃5min；

步骤2：95℃30sec；

步骤3：55℃30sec；

步骤4：72℃1min；

步骤5：重复步骤2～4，35个循环；

步骤6：72℃10min；

结束。

将PCR产物及DNA Marker(2Kbp，生工B500350，包括分子量为2000bp、1000bp、750bp、 500bp、250bp、100bp的核酸片段)点样于2％(质量体积比)的琼脂糖凝胶，80V电压下电泳 30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察，结果如图1所示。其中I140033样品呈现出唯一一条特异性条带，大小介于750～800bp。经该条带切胶回收送检测序，所测序列如SEQ ID NO：1所示，共计762bp，与电泳条带的大小吻合。因测序仪器的原因，不同的测序仪测得该特异性条带的长度可能有所差异，但会介于750bp到800bp之间。

由以上结果可知，采用本发明的特异性引物及方法能够将白肉灵芝优质菌株I140033与其他菌株区分开来。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记、特异性引物及鉴定方法

<130> 2021-4-3

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 762

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

tatgaggacg gggtcagacc agaccgtggc cggcgtcggc ggcaccgtcg tgcgcgatga 60

cggcgcgtgt cagagctgct gagcgcccca ttttgagctc cgccaggctc cgacttgatt 120

atcctcctgc gccagaggcg gccgcggccg cctcctggct tcaaactgta agtatgcact 180

tttcctcact gtttcttctg tcggcctgac caaacggaat atacgtctcc gtgagtgcgg 240

tatgattcaa tgtacaactt gatcacgaag ttatgtactc tccccagaaa tgtcttcgag 300

accaaccact tcactggcat ccgtcgcaaa gtgttccctc gtccacgatc gaactgccga 360

caagcctcct ctggagtccc agaggcgtaa gagagggttt ggaaatctga caagtagacg 420

gtacatatta actcatccca acctgcctgc ctcacatcgt gttcaaaatc gtataagctc 480

ccggtctttg cgcatagtga cgcagacgcg atccattcca gggctggctt catggctgca 540

tgccacacgc gtattaagca ctcctcatcg tcgaccagct tcgagaagtg ccaaactgtg 600

tattgcgacg cacgaacaac ctttcgatgg gacggaaccg cagtggatgg agcagccgcc 660

gccagcgcaa actcgacgtt cggattgacc ggtgctaatc tgacaacgac ccccgtgccc 720

ttgtcatgcc tttggccagt ttgacgtctt gggtgacaca aa 762

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

atgaggacga ggtcagacca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

gtggcaccaa gacgtcaaac 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 5

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims

1.一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述白肉灵芝优质菌株I140033为Ganoderma leucocontextum HMGIM-I140033，于2021年3月29日保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61579；所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述鉴定方法包括如下步骤：

提取待测灵芝样品DNA为模板，以特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R进行PCR扩增反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在750bp～800bp之间出现特异性条带的样品为白肉灵芝优质菌株I140033；

所述特异性引物sca13_92_F和sca13_92_R的核苷酸序列如下所示：

sca13_92_F：ATGAGGACGAGGTCAGACCA；

sca13_92_R：GTGGCACCAAGACGTCAAAC。

2.根据权利要求1所述的一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增反应体系如下：

Taq PCR Master Mix 12.5μL；

引物sca13_92_F，10μmol/L，1μL；

引物sca13_92_R，10μmol/L，1μL；

ddH₂O 9.5μL；

DNA模板1μL。

3.根据权利要求2所述的一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述PCR扩增反应程序如下：

步骤1：95℃5min；

步骤2：95℃30sec；

步骤3：55℃30sec；

步骤4：72℃1min；

步骤5：重复步骤2～4，35个循环；

步骤6：72℃10min。

4.根据权利要求1～3任一项所述的一种白肉灵芝优质菌株I140033的分子标记的鉴定方法，其特征在于所述琼脂糖凝胶电泳检测步骤为：将PCR产物及DNA Marker点样于2％的琼脂糖凝胶，80V电压下电泳30min，然后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察。