CN112063738B - 与毛白杨生长相关基因的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于林业分子育种技术领域，具体公开一种与毛白杨生长相关基因的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用，包括标记碱基序列为SEQIDNO.1的AUX1，SEQIDNO.2的CYCD3的应用，本发明提供的标记基因组合AUX1、CYCD3，及相应的引物试剂盒的应用，可以在毛白杨生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快的单株，从而大大加速育种进程，缩短选育周期，对比单个基因片段标记，使用本发明提供的组合，准确率更高。
Description
技术领域
本发明属于林业分子育种技术领域，具体涉及一种与毛白杨生长相关基因的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用。
背景技术
三倍体毛白杨属杨柳科杨属白杨派植物，具有速生、优质、高效、抗逆性较强、用途广等特点，具有良好的倍性优势，较二倍体毛白杨有更好的遗传改良效果。生长5年即可轮伐，出浆率为普通杨树的2倍，是制造高档新闻纸和胶印书纸的理想原料，也是民用、建筑、家具用材的常用原料。筛选毛白杨生长相关的主要基因，并在毛白杨的遗传育种改良过程中应用，将有利于应用分子生物学技术，选择生长速率快，性状优良的品种，目前该方面的研究未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是提供与毛白杨生长相关基因的分子标记、试剂盒，以解决现有技术中，针对毛白杨育种时，快速筛选生长速率快，性状优良的品种。
本发明的另一个目的是提供一种与毛白杨生长相关基因序列的筛选方法，以确保筛选得到的基因是和毛白杨快速生长性状相关的基因，且在毛白杨中显著表达，增加后期分子标记辅助育种时，筛选的准确性。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了与毛白杨生长相关基因的分子标记，所述分子标记包括碱基序列为SEQIDNO.1 的AUX1和SEQIDNO.2的CYCD3。
进一步地，本发明提供了测定与毛白杨生长相关基因的引物对，包括测定AUX1基因的引物上游SEQIDNO.3和下游SEQIDNO.4，CYCD3基因的引物上游SEQIDNO.5和下游SEQIDNO.6。
进一步地，本发明提供了一种检测快生长速率毛白杨的试剂盒，所述试剂盒包括碱基序列为SEQIDNO.3- SEQIDNO.6的引物。
优选的，所述的与毛白杨生长相关基因的分子标记主要应用在辅助毛白杨育种过程中，快速使用分子标记技术测试和挑选生长速度快，性状优良的品种。
进一步地，本发明提供了一种与毛白杨生长相关基因序列的筛选方法，包含以下步骤：
（1）选取野外一年生二倍体三倍体毛白杨根萌条为材料，利用转录组测序技术筛选二倍体、三倍体毛白杨生长相关基因；
（2）将选取的野生二倍体和三倍体毛白杨叶片进行组培，获得相同状态及生理年龄下的组培苗；
（3）提取二倍体、三倍体毛白杨组培苗茎段的总RNA，进行实时荧光定量验证，确定毛白杨生长相关的主要基因，分别是碱基序列为SEQIDNO.1 的AUX1， SEQIDNO.2的CYCD3。
进一步地，所述步骤（1）中的转录测序技术方法为：利用RNA-Seq测序对基因表达进行相对定量分析，基于表达定量结果进行样品间差异信息筛选；采用DEGseq和DEGseq2软件筛选差异表达基因，设置参数，其中差异倍数控制为2倍及以上，同时Q-value须达到小于等于0.001的基因被认定为显著差异表达的基因；把差异表达基因在数据库上进行功能注释；对注释到数据库上的差异基因数据进行分析，筛选毛白杨生长相关基因。
本发明的有益效果有：筛选出的毛白杨生长相关基因不仅可为毛白杨的分子标记辅助育种，并为毛白杨基因工程的研究打下基础，也为加快毛白杨的遗传育种改良奠定基础。在此基础上加深研究可进一步用于毛白杨的产业应用当中，增加经济效益与社会生态效益。
本发明提供的标记基因组合AUX1、CYCD3，及相应的引物试剂盒的应用，可以在毛白杨生长的早期就能够高效、准确地鉴定出生长快的单株，从而大大加速育种进程，缩短选育周期，对比单个基因片段标记，使用本发明提供的组合，准确率更高。
本发明提供的标记基因组合AUX1、CYCD3可通过快速检测其表达量，用于在植物育种过程中辅助区分二倍体和三倍体植株。
附图说明
图1转录组分析和RT-qPCR分析的比较分析图。
其中，A：TDP，二倍体植株的转录组数据；二倍体植株的RDP，RT-qPCR数据；三倍体植株的RTP，RT-qPCR数据；TTP，三倍体植株的转录组数据，B，C：DP，二倍体植株；TP，三倍体植株，这些植株均为组织培养植株，种植在温室内，1，1个月大；2，4个月大；3，7个月大；4，10个月大；5，13个月大，**，差异非常显著(P值<0.01)，对来自同一转录组分析树的3株2倍体和3倍体植株进行RT-qPCR，用看家基因EF1α归一化，重复3次。使用2(-CT)方法处理数据，因为图1A中的值的差异太大，所以图1A的y轴被更改为对数刻度。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
使用AUX1基因的引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4，CYCD3基因的引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，通过检测两个基因片段的表达量，可快速确定生长速率快的植株，缩短育种时间。
实施例2
一种检测快生长速率毛白杨的试剂盒，试剂盒包括碱基序列为SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的引物，PCR扩增缓冲液，25mmoll-1MgCl2，10mmoll- 1dNTP，TaqDNA聚合酶和双蒸水。
使用时，利用擎科逆转率试剂盒Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit进行反转录，反应条件为42℃ 2min，60℃ 5min，25℃ 10min ，50℃ 30min ，85℃ 5min。以 EF1a基因为内参，配制荧光定量PCR反应体系，进行荧光定量PCR分析。反应结束后确认Real TimePCR 的扩增曲线和融解曲线，绘制扩增曲线和溶解曲线。采用2-△△Ct法计算相对表达量，两个基因表达量比对照植物（可用已测定的生长速度较快的个体为对照植物株）高两倍以上的为快生长速率毛白杨植株。
实施例3
使用AUX1基因的引物上游SEQIDNO.3和下游SEQIDNO.4，CYCD3基因的引物上游SEQIDNO.5和下游SEQIDNO.6，MDH基因SEQIDNO.7的引物上游SEQIDNO.8和下游SEQIDNO.9，在经过0.10mg/L EMS共培养并剥离纯化处理后的组培植株1个月大时，通过检测三个基因片段的表达量，确定生长速率快的植株，缩短育种时间。
用MDH基因的引物筛选生长速度快的植株时，结果表明，在1个月大和4个月大的组培苗中，该基因的表达量在三倍体中表达量较高；但在10个月大和13个月大的植株中，三倍体植株与二倍体植株无显著差异。说明该基因的表达量无法用于筛选。
单独使用AUX1基因的引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4或CYCD3基因的引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，分别有1株和2株生长速率不快的二倍体植株被筛选出来。这说明单独使用其中任一基因的表达量作筛选标准，准确度无法到达100%。而结合使用AUX1基因的引物SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、CYCD3基因的引物SEQIDNO.5和SEQIDNO.6进行筛选，准确度可达100%，并且不存在使用不同树龄的材料准确度会下降的情况。
实施例4
一种与毛白杨生长相关基因序列的筛选方法：
1、材料：二倍体毛白杨试验材料采集于昆明世界园艺博览园辽宁辽园内；三倍体毛白杨采集于西南林业大学校园内，由段安安教授引回。
2、毛白杨转录组测序
取二倍体、三倍体毛白杨一年生根萌条各三株，共六株根萌条，除去叶片，用锡箔纸分别包装并标号，二倍体毛白杨为对照组，编号C-1、C-1、C-2，三倍体毛白杨为处理组，编号T-1、T-2、T-3。取样后迅速放置在低温液氮中冷却，之后放置在干冰中，将6个样品进行RNA的提取和转录组测序分析。
RNA的提取:
1)分装1.5mL，2%CTAB裂解液到2.0EP管上，加2%β巯基乙醇，65℃预热。
2)用液氮预冷研钵，组织样品放入加有液氮的研钵中，在液氮下把组织样品充分研磨成粉末，把样品粉末转入到装有裂解液的EP管中，(每mL裂解液可加30mg组织样品)。
3)65℃孵育20min，10000rpm，室温离心5min。
4)吸取上清液至新的2.0mLEP管中，每毫升裂解液加入200μL氯仿/异戊醇(24:1),剧烈颠倒混匀。
5)10000rpm，4℃离心10min。
6)吸取上清液至新的2.0mL EP管中，加入等上体积酚/仿/异戊醇(25：24：1)，剧烈颠倒混匀。
7)10000rpm，4℃离心10min。
8)吸取上清液至新的2.0mL EP管中,加入等上清体积氯仿异戊醇(24：1),烈颠倒混匀。
9)10000rpm，4℃离心10min。
10)吸取上清液至新的1.5mL离心管，注意不要吸中间蛋白层，加入等上清液体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀。
11)放入-20℃冰箱沉淀1h。
12)13600rpm，4℃离心20min。
13)吸取上清，加入1mL 75%乙醇，用移液器吹洗沉淀。
14)10000rpm，4℃离心3min，吸取上清,短暂离心,吸去残留液体,晾干3-5min。
15)用30-200μL,DEP水或者 RNase-free水溶解沉淀。
利用RNA-Seq测序对基因表达进行相对定量分析，基于表达定量结果进行样品间差异信息筛选。采用DEGseq和DEGseq2软件筛选差异表达基因，参数为 Fold Change≧2and Adjusted p-value≤0.001。其中差异倍数控制为2倍及以上，同时Q-value须达到小于等于0.001的基因被认定为显著差异表达的基因。把差异表达基因在KEGG Pathway数据库上进行功能注释。对注释到GO和KEGG的差异基因数据进行分析，筛选毛白杨生长相关基因。
在植物激素信号转导通路（Ko04075）、光合生物中的碳固定通路（Ko00710）、色氨酸代谢途径（Ko00380）中初步筛选出7个与生长相关的基因，分别为碱基序列是SEQIDNO.1的AUX1、SEQIDNO.2的CYCD3、SEQIDNO.13的ABF、SEQIDNO.7的MDH、SEQIDNO.15的ALDH、SEQIDNO.14的FDPase、SEQIDNO.11的SAUR。
3、组培
组织培养方法参照Hu等(2005年)报道的方法进行。将二倍体和三倍体毛白杨叶片接种在愈伤组织诱导培养基(MS+1.2 mg/l 6-BA+0.6 mg/l NAA)上15d，然后转移到无菌分化培养基(MS+1.0 mg/l 6-BA+0.4 mg/l NAA)上28d，不定芽生长到2～3 cm后移至生根培养基(1/2MS+0.4 mg/L IBA)。不定根长到2～3 cm后，移栽到温室。
4、 qRT-PCR分析
提取二倍体、三倍体毛白杨组培苗茎段的总RNA，具体步骤为：
1）使用液氮研磨法破碎植物组织。
将研磨物转移至干净的1.5 mL塑料离心管中。
2）在离心管中加入300ul的溶液B和200ul氯仿，在振荡器上振荡30秒混匀。
3）室温12000 g离心5～10分钟，两相间将有约2～5毫米厚的细胞破碎物。RNA位于上清液中，下层有机相含有叶绿素、脂质等杂质。
4）将上清液700ul(最多不超过800ul)转移到另一干净的1.5 mL塑料离心管中，下层有机相和中间层含有蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。
5）加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。
6）将混合物（每次最多700ul，多可以分两次加入）加入到一个离心吸附柱中，室温12000g离心1分钟，弃穿透液。
6）加入700ul溶液D，静置30秒，室温12000g离心1分钟，弃穿透液，去除残留的DNA及蛋白质。
7）加入500uL漂洗液，室温12000g离心1分钟，弃穿透液。加入500uL漂洗液，重复一遍。室温12000g离心2分钟。
8）将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入50～100 uL RNase-free H2O，室温放置3～5分钟。
9）室温12000 g离心2分钟，离心管中溶液即为RNA样品。
利用擎科逆转率试剂盒Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Kit进行反转录，反应条件为42℃ 2min，60℃ 5min，25℃ 10min ，50℃ 30min ，85℃ 5min。选择二倍体、三倍体毛白杨转录组数据中生长相关并且呈上调趋势的差异基因7个，以 EF1a基因为内参，配制荧光定量PCR反应体系。
进行荧光定量PCR分析，具体操作步骤为：
1）预变性：95℃ 1min（Ramp Rate 4.4℃/秒）1 cycle；
2）PCR——分析模式：定量分析
95℃ 15 秒钟 (Ramp Rate 4.0℃/秒)，56℃15 秒钟 (Ramp Rate 4.0℃/秒)
72℃ 30秒钟(此处读取荧光)，40 cycles；
3）融解——分析模式：融解曲线
95℃ 5 秒钟(Ramp Rate 4.4℃/秒)，60℃1 分钟 (Ramp Rate 2.2℃/秒)
95℃ (Ramp Rate 0.11℃/秒, Acquisition Mode : Continuous,Acquisitions : 5 per℃)
1 cycle；
4）降温，50℃30 秒钟 (Ramp Rate 2.2℃/秒)，1 cycle。
反应结束后确认Real Time PCR 的扩增曲线和融解曲线，绘制差异基因的扩增曲线和溶解曲线。根据溶解曲线选择萤光定量PCR的差异基因。以 EF1a作为内参基因，采用2-△△Ct法计算相对表达量，最后确定AUX1、CYCD3、MDH为毛白杨生长相关基因。
筛选与验证
为了验证转录组测序结果的可靠性和关键基因的表达情况，以同龄、同生长条件的同龄毛白杨组织培养苗为试材，分别于1月、4月、7月、10月、13月龄进行RT-qPCR验证，结果表明：1、4、7、10、13月龄的二倍体和三倍体毛白杨组织培养苗与转录组、组织培养树同龄的二倍体和三倍体毛白杨组织培养苗均为对照。正如在转录组测序中一样，从分枝顶端往下的第五片叶下的茎段被选择用于验证。上午9点采集茎条插条样本。
从植物激素信号转导途径(Ko04075)、光合生物固碳途径(Ko00710)、氮代谢途径(Ko00910)和色氨酸代谢途径(Ko00380)中筛选出10个生长相关基因进行RT-qPCR验证。与二倍体毛白杨相比，这些基因在三倍体毛白杨中表达上调，可作为今后植物育种的候选标记。使用EF1a作为内参照基因，并使用转录组的基因序列，使用引物引物5(Lalitha 2000)设计引物，如表1所列。RT-qPCR过程按Li等人(2019)描述。在Bio-Rad CFX96TM实时聚合酶链反应检测系统(美国加利福尼亚州Bio-Rad)上，最终体积为25μl，包含2.5U DNA聚合酶、100.4 mM脱氧核糖核苷酸(DNTP)、20μl DDH2O、1μl cDNA和每个引物500 nm。每个样本一式3份，用于RT-qPCR反应。使用看家基因EF1α对数据进行归一化，并根据先前的研究采用2(-ct)方法(Liu等，2018年)。
选择在三倍体毛白杨中较二倍体毛白杨上调的生长相关基因作为未来植物育种的候选标记进行RT-qPCR验证。碱基序列为SEQIDNO.10的GH3、SEQIDNO.16的CA和SEQIDNO.12的A-arr基因RT-qPCR产物的溶解曲线均未见峰。其余7个基因均呈单峰曲线，表明其扩增产物不含引物二聚体或非特异性扩增产物，且各引物PCR反应具有特异性。转录组分析和RT-qPCR分析的比较结果如图1所示。在二倍体植株中，RT-qPCR分析的SAUR、FDP、 ALDH、AUX1和ABF的表达水平显著高于转录组分析。在三倍体植株中，RT-qPCR分析中ALDH和AUX1的表达水平显著低于转录组分析，MDH和CYCD3的表达水平显著高于转录组分析中的表达水平。在三倍体植株中，ALDH和AUX1在RT-qPCR分析中的表达水平显著低于转录组分析，MDH和CYCD3在RT-qPCR分析中的表达水平显著高于转录组分析。AUX1、CYCD3和MDH在组织培养的三倍体杨树中的表达水平高于组织培养的二倍体杨树，这与转录组计算的TMM值的变化一致。其中，AUX1基因在三倍体样品中的表达水平显著高于二倍体样品(约6.88倍，logFC值)。但是，ABF基因在二倍体样品中的表达量高于三倍体样品，这与TMM值不一致。在进一步的实验中，MDH和CYCD3在组织培养和温室种植的三倍体杨树中的表达水平显著高于组织培养和温室种植的二倍体样品。随着年龄的增长，MDH和CYCD3的表达水平逐渐升高(图1B和C)。
筛选出的毛白杨生长相关基因不仅可为毛白杨的分子标记辅助育种和基因工程的研究打下基础，也为加快毛白杨的遗传育种改良奠定基础。在此基础上加深研究可进一步用于毛白杨的产业应用当中，增加经济效益与社会生态效益。
序列表
<110> 西南林业大学
<120> 与毛白杨生长相关基因的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2336
<212> DNA
<213> 毛白杨(Populus tomentosa)
<400> 1
ttttttttag aagaaaacta acatatattt atatgattta attaactagc ctatgccttt 60
aaggggcaaa ggaatcatca gaatccatca cacaatttta tcaactaatt gaagtaaacc 120
aaaaggaaaa aaaagaagca aaacgcagca caacatcaca tgtaggagag atattactac 180
ttcccctttg tatgatacaa aatatgaaga gagagagaga aaaaacagaa aatattcttt 240
tcttaagctg aatctcgtgg ctcactcagc gatggtgtgg cggtgctgct gccgctgcta 300
gaggtggtgg cggcttgcat tgatagcact tggcaaagag cccaaatgtg tctacttgcc 360
taacaaagtt tgtcatgcta gcccatccac cgaacccaaa accaaccacc agcacccaca 420
ccaccacgaa ggcgtttatg acatacatgg ctgtccagct tggcataaag ggcggcggct 480
tttctgcagc attctgtcta gcagaggctt ttctgtaagt gagcatgtgg gctaaagatg 540
ggatgatgta aaccgtgaag ctaaccagaa gagcaccaac ggctgagttg ataggtccaa 600
agaaagggaa gattatagct aaaaaccata tcggaacaac caccggtagc cttgcaagtg 660
ccctcaagca aatactcttg gtgtcatgca tccctatcac cttctcccac acaaagtaca 720
atggagtgca tgcaaatcca aatgtgataa actggtgaat gagcatgagg ataaccgcag 780
catcgcggaa accattcttg gggaggagag cgaaggcgtt ggaatggttg aggagctcgt 840
ctccgaaggc ccagtagacg gcggtagcag aaggaatggt tagtgtgaac acgtagagag 900
tagccatcaa gtaaatatac ttgaattttt ggggcttcca catggcatgc atgatttcca 960
cggtgacagc atgtccacca aaggtgtaga ggatgttggt ggctccggtg aagtaaagca 1020
ccaactttgt cggagcagaa tgtgtgacga ctcctacttg gccatgaata agagctgcta 1080
tggccatgta ccaggcggta tacgtggtca tgccaagacc aagaaaagac caaatacggt 1140
agttatgaaa agagggtatg aaaactgttg tggcacagca agctccaaaa atgtaagtcc 1200
aagtcctctt gtccatatgg tcattgatgt agtaaatatt acttgcacaa gcaataagtt 1260
gaatgacaga tccgaagagt aagaaggtac agttgaaggc aagtcctact gccttccagt 1320
atggacccag tagcccatca agcacttcaa accactgtat gacatggttc ttgaagttaa 1380
cgttctcttt ctcctttctg cttctgtact caatgtaaag cacgcttatg aggtaagctg 1440
tccagcttcc tacaatccca tagaatatct gaaacaaaat ccctgacagc ataccaagct 1500
gagagaagga gtatggaagt gtcagcagta cttgagctac ttgattggag gcacagctga 1560
accaggcatc ccagacagac ccaccatgcc agagagcact cttgatactg aacaaagagt 1620
ggttctcttc tgtctcttct tccttgcctt catgttgatc tgtctcgctg tagttaggaa 1680
caattgcttc ttctgcttgc ttctgagacg acattgtctt ggtttttcac taaaagcaac 1740
gtctaaatcc tggtagatct cgctttgaaa tgtctctttc gagatgggaa aaaagaaaga 1800
gaaactgaag aacctcctct atgaccccaa aatgaccttg ttgatatata tatatatcta 1860
tatatctata tatatatata tatattcaag cccctccttg ctacgtcctt tgcttgactt 1920
tgatttatca ccttttcctt gttttcagat tggaaacaac caacaagcac gctgtcaaca 1980
ggaacagcac agttgcgaga gagtttttaa gatttcttcg ttccaagaac cagagttaag 2040
aatgcctgca gcctgagaac cccgaaaaat atcttcagct acggatctct cttgtaaacg 2100
ctccccgctt taatgcgcca ccaatcctag tagacaaaag ggccagagcc ggacttcaaa 2160
gacggcgaga cctcaaaagc agggaaaaaa aagatacact agaaatcaat tgtgcttgca 2220
gatgttgaag aaaaagatcc tttccaccac tcctattctc accaataaac caaaattata 2280
aatactcact cactgctcct gtctcaacta ctgtagcact gctgctactg ctatta 2336
<210> 2
<211> 1607
<212> DNA
<213> 毛白杨(Populus tomentosa)
<400> 2
gttggtcttg ttttatgaac aacctaacaa gaactgtctt ccaatgaaaa tctctcgccc 60
atctctttct atggttcaac ttctacaaaa actaatgtga ttgaagtgaa caataacagg 120
ataatcttgg gtttattcta gtgaatcatg taacatttaa tagagcaatg gttgagatac 180
agacatgatg ttcataccta ttggaaaaac accacaatct cttcattcct ctctcgaaca 240
aagagagagc agagcagata cttcatttct catccaagaa tgggtcagtt tcaaagattt 300
ggccggaaat gtctaattca tgcaacataa aacgtctgta cctcttacac atacaacaat 360
taatacgcaa aacaggaaga ttatgatagc tcgaggcatt aagacaagga aagactaatg 420
aggactgcta agcacatcca cgcacatacg atttagtgaa ggcaatcgca tctgctgaac 480
ctgggtcctg cttcttttga attgaggcac tgatgatgat gatgagattg atgacgccac 540
agcccacgaa tcatttgagt tctcagagct gaaagatgca tcgatgacac catttgggct 600
gctgggtgtg gacaggtact tgcgcttgtg gcgttggttt tggctgcctg gttgctctaa 660
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actcccaatg catgtgggtc tttaatccaa gtctccttat aatgtgatca aagaaagaaa 900
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ttatggtctt cgcttcaaaa acgtactctg catcctccac ttgcaagtct aaaagaagtg 1020
gcacttgggt ttcctccact ttagcagcca gagacaaaca agccacagca gcaagttgac 1080
ccatccatgg cttatctctt cgaaatcttg aacttgaaat gaacctatca aagtagttca 1140
cagcaagaac accagtcaaa gcactgaacc cataatgtgc ctttaccctc aaaaaccact 1200
caactgcctc tctacgaacc accattaaag atccatctct agatcctaca ctatcaaaaa 1260
caacatgggt ctctttctct ttagagatta aagacagtaa ctcgttatct tcccaaaaca 1320
agtcttgctc aagcaaaaca gaagataaat tttgctcctt tttcacattt tgatcataaa 1380
cctggctagt ttcatcatcc aaaccacaag aataatcctc tccaaatcca tcctcttcac 1440
aataaagccc gtcaagagcc aatgttgggc tttgattatg agtctcttgt tcttgtaaga 1500
aagacatctt cttcagagaa gaagagattt aatcctcttc tcattataga acaccatcaa 1560
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<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tggatctgtc attcaactta ttgct 25
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctctgctc tctctttgtt cg 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccactgaaaa tctcacgcca atc 23
<210> 7
<211> 2793
<212> DNA
<213> 毛白杨(Populus tomentosa)
<400> 7
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gcatgttgtt caatacctgc taattctatc ctgtgtaacc tcttaaatag aaacttgtat 180
cagaaggcaa caaagttagt taactggaca gccatcaacc attatgccct tggctgttgg 240
acaagttgcc aattcacagt gttcaccatt tgtaccccac caattcaaat tcctatcttc 300
tattccaact gagaagtaca aaagcactgc catgaaagcc accccggcat ccaatgcagc 360
tgaaagaaca taattgtacc tctgccacca cgtctttttg taacggaaga tgaagaaatt 420
gaaaattgtt ccaactatga tccaggcgtt gtagtttact ggtgtggctg gaggcatata 480
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catggcctga tagtttccaa gtgttccaaa gatccgcttt ggtcccacca aaccccatat 660
gacagaagca tcaaagaaga ctcggtcacc tgggcatgtc caaggactgt tagcgggtag 720
cagatcatcc tggcatatgt ttgcaatgga gttcagcagc caccaggcta ctgcaaggtt 780
gatggttccg gcaagaactg ttcctatgaa ctagacatac ccagatggaa acgcaacaag 840
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aattgttcat tataattgac tttgtcagtt taaggtcacg gtcttgagga aattcttgga 960
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tttgattcat ttattatcta gacagtacgt agttctgaga aaattttacc tgaaccaaga 1080
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cagcctgagc catgctcata tatccatagg ttttgaagca tacattggct attggtctcc 1200
ccggtaatat gacacccatg acatactctg ttattatgtt cagccctggt gtctggtttg 1260
ttgtggcagt tatgatgctg atgggaaggg tgaagacaaa ggccatggca ctcgcgaaga 1320
tgagtcccca ccatggcatc tgaacttgat cattcaagaa gatgcacagt gcaagagcaa 1380
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tctcccttcc atagaagaaa gccacgtgag taagggtggc ggcaatggtt gcaaaaccga 1560
agccataagt gagagcaaaa aacatgctta aatgaattcg tccttgctgt tcatagtttg 1620
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tgcggtgacc atcatctttc tcatgcaaag ccctgaaaag agagacctga acgagagtgc 2100
caggccacca catatgggct ggctccacca catacttcct caatagccct gcccagccat 2160
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cgtaaaatgc tttgatgata gtgacaatac caacagcata agcagatcca ctaccaaatg 2280
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<212> DNA
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tactagacaa acatcttggt caaggtcaca tcctttccac aggttaagtg aaccacacca 120
caaaacctga ctctgaaaca tccttatcag taaataacct ttaacagttg gtcccaaaag 180
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aatattaata agtaatctat tattattcta cattcgaatc catttgactt aattaatgtg 300
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tcctcaaatg taccattttt caccacacgt atttcgagtg gtccaattga gtaatctgca 540
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agtacttcgt cactaggaga gttggctggg tctttgacca ataattccca gtaaatcaca 660
tagtgtccag gaattgtctt tgtatcagca tagctagtgt attcaacaac acttgtgttg 720
aattcacgta gaagttgtga tgcgttctca actgcctttt gtaactcagc ttcatctgtt 780
ttgtccgagt caatactaag caaaacattc ttcctcctta cgaaatgaaa ttgaggggct 840
gagttgtgga acccggtaac tcgaaggatg tcaccaactt ggtacctgta taaaccggca 900
taggttgtga tgacaagctc gtattcctta cccaactcaa catcggcaag gtcaacaagt 960
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tagtcgaggg tagggatata ttgggccatg gctccagtga caatcacatc aagatatttg 1200
gtgttaggcc aaattcttgt aatgatccct tcccagtttt ccttactaca ctccattctg 1260
acaaactcgg caagctttgg gtttggcttc agaatcttta ccatacaatc tttgacggaa 1320
gggtcagtga tttccttgtt tagcattcct gactcgatat catcagcaag ttcccgccaa 1380
tgaagttgga gaaaccttat ggcacggaga aggccggaag caaagactgc accgacccta 1440
agcacttgtt cacgctctag aaggccacag agcatctgag tgtacatgct ctggaatgaa 1500
tctgcacaaa gaatggcctc atttgggctg gtgtacacat tgtaaggatc atatggacgt 1560
gttttgaagt ggtcactctt gtaatagctc gtaagcaccg gacgagccaa gagaccccct 1620
ggggttcttg tttcagattt cacaaacaag aagtataagc ctttgccttt gtctaagcca 1680
ggcacgtaga ggttcattac tggcatgagt aaactataca gtaattggcg acgatccagc 1740
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<211> 642
<212> DNA
<213> 毛白杨(Populus tomentosa)
<400> 11
aattgttgct tcaaaaacaa gaaagagagc aaggaaaaga aatcagggag agcctgaata 60
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aaattgagct tcggtaataa atatgtagaa actatgtata tggtgtcact tagtttctac 240
ataaaatcaa caagagtgaa aagacaagga gccaggaagg tgctgatgaa ggttactgtg 300
gtggctgtga tggctagact ctctttcaat cctccaccgg agatgaagaa aatcatcaac 360
ggaacacggt agccatagtg gacctgtagt gtggtagccg taaacttcat gggctttctc 420
taaaagtcgc ttgaaaagag ggtggtatag atacgaaatt ggaatcacaa atctctgaaa 480
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cttatcttcc tgcgtattgc tcatctttcg agtgtgagaa attatggaag aaatagctgg 600
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cctcctcctc cccatctccc atgttctacg tgctggttgg ttccatatgt aatttgaacc 60
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ttaaaatacc ata 3013
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<212> DNA
<213> 毛白杨(Populus tomentosa)
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gaagagatag atgcggggat tgt 683
Claims (3)
1.与毛白杨生长相关基因的分子标记在辅助毛白杨育种中的应用，其特征在于，所述与毛白杨生长相关基因的分子标记片段包括碱基序列为SEQIDNO.1 的AUX1，SEQIDNO.2的CYCD3。
2.根据权利要求1所述的与毛白杨生长相关基因的分子标记在辅助毛白杨育种中的应用，其特征在于，测定与毛白杨生长相关基因的分子标记片段的引物对,所述引物对包括测定AUX1基因的引物对,所述AUX1基因的引物对上游如SEQIDNO.3所示和下游如SEQIDNO.4所示，测定CYCD3基因的引物对,所述CYCD3基因的引物对上游如SEQIDNO.5所示和下游如SEQIDNO.6所示。
3.与毛白杨生长相关基因的分子标记片段在制备检测快生长速率毛白杨试剂盒中的用途，其特征在于所述与毛白杨生长相关基因的分子标记片段包括碱基序列为SEQIDNO.1的AUX1，SEQIDNO.2的CYCD3。
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Legal Events
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Application publication date: 20201211 Assignee: Yunnan Linkang Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: SOUTHWEST FORESTRY University Contract record no.: X2024980006841 Denomination of invention: Molecular Markers, Screening Methods, Kits, and Applications of Growth Related Genes in Populus tomentosa Granted publication date: 20230818 License type: Open License Record date: 20240607 |
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