CN111172255A - CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于分子生物学技术技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法。该方法适用于烟草基因编辑突变体筛选鉴定，具体包括：获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA、利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体等步骤。本申请筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体过程中，配合高通量测序技术应用，可以部分克服现有鉴定过程繁琐的缺陷，而且具有可以批量应用的优点，尤其是相较于现有常规的Sanger测序，本申请的高通量测序可以大幅降低测序成本，表现出较好的实用价值。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学技术技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法。
背景技术
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是生物进化历程中病毒和细菌之间进行斗争而产生的免疫武器，简而言之就是病毒能够把自身的基因整合进入细菌体内，利用细菌为自己的基因进行复制，而细菌为了清除外来入侵的病毒基因，进化出细菌特有的免疫系统——CRISPR系统，细菌可以利用该系统把病毒基因从自身的染色体上切除。基于此原理，目前科学家们开发了一种针对Cas9蛋白操作的技术，可以对多种靶细胞的DNA进行切除，该技术被称之为CRISPR/Cas9基因编辑系统，已成为生命科学领域最热门的技术之一。
现有CRISPR/Cas9基因编辑系统在动植物中的研究应用已经非常成熟，利用该技术能够在全基因组水平进行基因编辑和功能筛选。而基因编辑完成后即需基因编辑后突变体进行筛选鉴定。现有筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体的常规流程是：①提取基因编辑组织基因组DNA；②以基因组DNA为模板，使用靶点引物进行PCR扩增；③胶回收PCR产物，连接T载体，转化感受态细胞；④随机挑取多个单克隆进行菌落PCR验证，对阳性克隆进行一代测序（Sanger测序），并对测序结果进行比对分析。可以看出，该鉴定流程不仅费时费力，而且成本高。
针对现有筛选鉴定的缺陷，现有技术也有一定改进。例如中国专利（申请号201711351623.3）公开的一种鉴定基因组编辑纯合突变体的方法，其涉及的检测方法是针对突变位点设计特异性引物，通过MSBSP PCR（Mutation sites based specific primersPCR）来筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑纯合突变体。尽管该方法在时间和成本上相比于常规的鉴定方法有一定的优势，然而尚存在一些局限和不足：①该方法依赖于特异的引物和特异的条件，对于一个新的位点，可能需要花时间和精力摸索比较合适的引物和PCR的条件；②该方法中的两对特异性引物需要严格地设计在gRNA的识别位点处，容易出现引物扩增不特异的情况，所以该方法不太适合于规模化的应用；③该方法原理上是基于在特定位点发生突变，从而与引物不能完全匹配，如果编辑事件发生在PAM序列的下游的情况，就可能检测不到；④对于该方法能不能应用到突变体库的检测，要看具体的情况，如果突变位点已知而且该位点在全基因组范围内比较特异的话，是可以用于突变体的辅助筛选纯合体，但是如果突变体大部分突变位点还是未知的话，这个方法可能暂时还用不上。
综上，针对CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法仍有必要进行进一步探索，从而为相关实验研究奠定良好技术基础。
发明内容
本申请目的在于提供一种准确筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体的方法，可为在不同物种中筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体提供一定技术支撑，从而便于相关基因编辑技术的推广和应用。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，具体包括如下步骤：
（一）获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA
以烟草RAX23、MYC2b基因编辑突变体为例，具体CRISPR/Cas9基因编辑突变体获得过程为：
首先构建目标基因的CRISPR/Cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘（0.5~1 cm2），通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为CRISPR/Cas9基因编辑突变体；最后采集适量CRISPR/Cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组DNA备用，以便进一步检测、筛选或应用；
针对目的基因的具体CRISPR/Cas9载体构建时，首先根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置（protospacer-adjacent motif，PAM），并针对此靶点进行引物设计，然后参考现有常规操作构建CRISPR/Cas9载体；
就目标基因RAX23、MYC2b而言，具体靶点序列及所设计引物序列如下：
（二）利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体
利用高通量测序方法对步骤（1）中获得的CRISPR/Cas9基因编辑突变体进行筛选鉴定，具体而言：
（1）针对靶位点设计PCR引物
靶位点设计好之后，在靶位点上下游大约200 bp位置设计特异性检测引物，引物设计时，参考如下：
正向检测引物5’端增加正向前序列P1：5’-GTGCAGTGTCGAGATTGC-3’，形成“P1+正向检测引物”；
反向检测引物5’端需要增加反向前序列P2：5’-GATTCAGATGAGTTGATC-3’，形成“P2+反向检测引物”；
当然，不同目的基因靶位点的特异性检测引物各不相同，需要根据目的基因进行分别设计；
（2）对目的片段进行首轮PCR扩增
以提取的烟草基因组DNA为模板，利用步骤（1）中针对靶位点所设计的PCR引物进行扩增；PCR过程中，20μL反应体系参考设计如下：
基因组DNA（100 ng/μL），1.0μL；
P1+正向检测引物（10 μmol/L），1.0μL；
P2+反向检测引物（10 μmol/L），1.0μL；
2× PCR SuperMix，10μL；
ddH2O补至20μL；
PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s， 35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存；
对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，以避免或减少第二轮PCR的非特异性扩增；
（3）第二轮PCR
高通量测序是多样本平行混合测序，为了能够区分不同的样本，需要给每个样本的序列中加入一段代表样本来源的Barcode序列标签，若某个样本序列中不含Barcode序列标签，就无法追溯该样本来源，进而在后续的生物信息学分析过程中会产生意义不明或错误的信息。因此，需要在上游引物的5’端加入测序接头和Barcode标签序列，形成融合引物“5’-测序接头+Barcode标签+上游引物-3’”作为测序端，下游引物则可保持不变；
而为便于批量检测样本，第二轮PCR反应可在96孔板中进行，其中有一孔为Control，PCR模板则是蒸馏水；
综上，第二轮PCR反应中，
上游引物为：“5’-测序接头+不同的Barcode标签+2.1中正向前序列P1”，
下游引物同则为反向前序列P2（仅仅是P2还是“P2+反向检测引物”）；
测序接头长度为20-25 bp，序列相同；
第二轮PCR扩增过程中，在96孔板的每孔分别加入步骤（2）中胶回收的首轮PCR产物作为模板，再分别加入带有不同Barcode标签的第二轮PCR上游引物，以及下游引物，
20μL的PCR反应体系参考设计如下：
胶回收的首轮PCR产物（100 ng/μL），1.0μL；
第二轮PCR上游引物（10 μmol/L），1.0μL；
第二轮PCR下游引物（10 μmol/L），1.0μL；
2× PCR SuperMix，10μL；
ddH2O补至20μL；
具体操作过程中，每孔加入相同的试剂时可使用排枪，吹打混匀后整板离心，用封口膜将96孔板封好，放入PCR仪；
PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火35 s，72℃延伸25 s，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存；
（4）高通量测序
步骤（3）中第二轮PCR反应结束后，使用排枪把96孔板不同排的样品先混合到其中一排，再将这一排的样品混合在一起，Control孔单独处理；
1%琼脂糖凝胶电泳检测混合后的PCR产物，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，提高文库质量，避免或减少杂带对测序的不利影响；
胶回收产物进行高通量测序的要求为：总浓度≥1.0 ng/μL，总质量≥30 ng，总体积≥15 μL；使用Illumina HiSeq2500对混合样本进行高通量测序，测序数据1.0-1.5 G。
总体上，本申请筛选鉴定CRISPR/Cas9基因编辑突变体过程中，配合高通量测序技术应用，可以部分克服现有鉴定过程繁琐的缺陷，而且具有可以批量应用的优点，尤其是相较于现有常规的Sanger测序，本申请的高通量测序可以大幅降低测序成本，表现出较好的实用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例
以烟草CRISPR/Cas9基因编辑突变体为例，本实施例就具体CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定过程介绍说明如下。
（一）获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA
以烟草CRISPR/Cas9基因编辑突变体为例，其获得过程为：首先构建目标基因（本实施例分别以RAX23、MYC2b基因为例）的CRISPR/Cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘（0.5~1 cm2），通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为CRISPR/Cas9基因编辑突变体。最后采集适量CRISPR/Cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组DNA备用，以便进一步检测、筛选或应用。
针对目的基因的具体CRISPR/Cas9载体构建时，首先根据目的基因序列信息，选取合适的靶点位置（protospacer-adjacent motif，PAM），并针对此靶点进行引物设计，然后参考现有常规操作构建CRISPR/Cas9载体。
就本实施例所涉及的具体目标基因RAX23、MYC2b而言，本实施例中所选择的具体靶点序列及所设计引物序列如下：
将所构建CRISPR/Cas9载体转化植物体时，具体操作可参考如下：
将烟草种子用次氯酸钠（30%，NaClO）消毒30 min，然后用无菌水冲洗5~6次，点种至MS培养基中，培养箱内培养；
将培养幼苗叶片消毒后，分切成0.5~1 cm2左右大小的正方形（刀片要锋利，切片时要将叶边缘和叶脉去掉，切片时要迅速，防止撕扯，挤压，尽量避免叶片损伤），然后置于含有转染菌液的培养皿中侵染1.5 min左右（所述转染菌液事先制备，具体方式为：将转化CRISPR/Cas9载体载体的农杆菌在抗性（卡那霉素和利福霉素抗性）培养基中，28℃摇菌培养至OD600 = 0.6~0.8，集菌，4℃、5000 rpm离心10 min后收集菌体，用液体MS0（不加糖和琼脂的MS培养基，pH 5.8）重悬，调整OD600 = 0.6左右），迅速取出后用无菌滤纸吸干菌液；
将叶片均匀的平铺在不含抗生素的MS分化培养基上（叶表面向上），26℃暗培养2 d；暗培养后转入潮霉素抗性的分化培养基中进行选择培养；7-15 d为一周期，换新鲜培养基直至叶片分化出小苗；
在小苗（再生苗）长到1~2 cm时切下，转入伸长培养基中培养；长到一定高度时转入生根培养基中培养；
待转基因烟草长到3-4片叶，根系发育好后，炼苗1 d，再种到含蛭石的育苗盘中，种时将根部培养基洗干净，防止根部腐烂，将育苗盘盖上薄膜，约一周后在膜上扎孔，让其透气，观察生长情况，如有萎蔫就停止透气，若生长良好，可先揭开一半薄膜，隔几天再全部揭开，这一过程不需要在培养间。
烟草基因组DNA时，利用QIAGEN 公司的DNeasy Plant nimi试剂盒提取烟草叶片基因组DNA，具体操作可参考如下：
1)称取约100 mg植物叶片，在液氮保护下研磨后转入离心管，加入400 μL缓冲液AP1和4 μL RNase A储备液（100 mg/mL），剧烈震荡；
2)65 ℃条件下温育10 min，期间震荡混合2-3次；加入130 μL 的AP2缓冲液，混匀，冰上放置5 min；
3)将裂解液转移至粉色柱中，10000 rpm离心2 min，转移滤液至一新管中；
4)加入1.5倍体积的AP3/E缓冲液上下吹打混匀，转移至吸附离心柱中，放入2 mL收集管；10000 rpm离心1 min，弃滤液，重复此操作一次；
5)加入500 μL AW缓冲液于离心柱，10000 rpm离心1 min，弃滤液，重复此操作一次；
6)在吸附柱中加入100 μL TE Buffer，室温下静置3 min， 10000 rpm离心1 min，测定浓度，-20℃保存备用。
（二）利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体
利用高通量测序方法对步骤（1）中获得的CRISPR/Cas9基因编辑突变体进行筛选鉴定，具体而言：
（1）针对靶位点设计PCR引物
靶位点设计好之后，在靶位点上下游大约200 bp位置设计特异性检测引物，引物设计时，参考如下原则：
正向检测引物5’端增加正向前序列P1：5’-GTGCAGTGTCGAGATTGC-3’，形成“P1+正向检测引物”；
反向检测引物5’端需要增加反向前序列P2：5’-GATTCAGATGAGTTGATC-3’，形成“P2+反向检测引物”；
（2）对目的片段进行首轮PCR扩增
以提取的烟草基因组DNA为模板，利用步骤（1）中针对靶位点所设计的PCR引物进行扩增；PCR过程中，20μL反应体系参考设计如下：
基因组DNA（100 ng/μL），1.0μL；
P1+正向检测引物（10 μmol/L），1.0μL；
P2+反向检测引物（10 μmol/L），1.0μL；
2× PCR SuperMix，10μL；
ddH2O补至20μL；
PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸25 s， 35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。
对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，以避免或减少第二轮PCR的非特异性扩增。
（3）第二轮PCR
高通量测序是多样本平行混合测序，为了能够区分不同的样本，需要给每个样本的序列中加入一段代表样本来源的Barcode序列标签，若某个样本序列中不含Barcode序列标签，就无法追溯该样本来源，进而在后续的生物信息学分析过程中会产生意义不明或错误的信息。因此，需要在上游引物的5’端加入测序接头和Barcode标签序列，形成融合引物“5’-测序接头+Barcode标签+上游引物-3’”作为测序端，下游引物则可保持不变；
而为便于批量检测样本，第二轮PCR反应可在96孔板中进行，其中有一孔为Control，PCR模板则是蒸馏水；
综上，第二轮PCR反应中，
上游引物为：“5’-测序接头+不同的Barcode标签+2.1中正向前序列P1”，
下游引物同则为反向前序列P2；
测序接头长度为20-25 bp，序列相同；
具体参考设计如下：
RAX23-F：5'-TCTGATAATGATCACATGGTTCA-3'，
RAX23-R：5'-TGTTATTAGACTGGTACCTGAGTG-3'；
MYC2b-F：5'-TGCACGACAGATCCTGCAATAG-3'，
MYC2b-R：5'-CTTCACCTTTGGGATCACGG-3'。
第二轮PCR扩增过程中，在96孔板的每孔分别加入步骤（2）中胶回收的首轮PCR产物作为模板，再分别加入带有不同Barcode标签的第二轮PCR上游引物，以及下游引物，
20μL的PCR反应体系参考设计如下：
胶回收的首轮PCR产物（100 ng/μL），1.0μL；
第二轮PCR上游引物（10 μmol/L），1.0μL；
第二轮PCR下游引物（10 μmol/L），1.0μL；
2× PCR SuperMix，10μL；
ddH2O补至20μL；
具体操作过程中，每孔加入相同的试剂时可使用排枪，吹打混匀后整板离心，用封口膜将96孔板封好，放入PCR仪；
PCR反应条件为：95℃预变性4min；95℃变性30s，55℃退火35 s，72℃延伸25 s，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。
（4）高通量测序
步骤（3）中第二轮PCR反应结束后，使用排枪把96孔板不同排的样品先混合到其中一排，再将这一排的样品混合在一起，Control孔单独处理；
1%琼脂糖凝胶电泳检测混合后的PCR产物，胶回收特异性目的条带，确保目标产物的特异性良好，提高文库质量，避免或减少杂带对测序的不利影响；
胶回收产物进行高通量测序的要求为：总浓度≥1.0 ng/μL，总质量≥30 ng，总体积≥15 μL；使用Illumina HiSeq2500对混合样本进行高通量测序，测序数据1.0-1.5 G。
（5）结果分析
96孔板中每孔对应一个待鉴定的样本，下述表格中列举的是筛选出来的阳性突变体。
从对于上述鉴定过程进行分析，可以看出：传统的鉴定方法是先提取待鉴定样品的DNA，使用检测引物进行PCR扩增，连接转化，挑取单克隆进行测序分析。一个待鉴定样品平均需要挑取大约15个单克隆，一个单克隆的Sanger测序大约需要20元，检测96个样品则需要测序费用15×20×96=28800元。而本申请所提供的方法一次可以鉴定96个样品，测序费用大约只需要2000元，比传统的鉴定方法测序成本下降93%。因此，该方法不仅准确率高，还大幅降低了鉴定成本。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120> CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法
<130> none
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
acatgattaa ctgctctttg ttg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
acctggtgcg atgtaataat gg 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 3
ggacttctgt tgcttggaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 4
attgtacggg attcgtggtg 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 5
ttggggattt caccggacat aa 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 6
tactaattca ggctggcaca 20
Claims (5)
1.一种CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，该方法适用于烟草基因编辑突变体筛选鉴定，具体包括如下步骤：
（一）获得CRISPR/Cas9基因编辑突变体、并提取突变体基因组DNA
具体CRISPR/Cas9基因编辑突变体获得过程为：
首先构建目标基因的CRISPR/Cas9载体，然后利用电转法将阳性载体转入农杆菌，利用农杆菌介导侵染烟草叶盘，通过共培养以及筛选培养获得愈伤组织及阳性小芽，然后将其移栽至基质中，继续培养至开花结果，此即为CRISPR/Cas9基因编辑突变体；最后采集适量CRISPR/Cas9基因编辑突变体烟株叶片作为样品，提取其基因组DNA备用；
（二）利用高通量测序筛选鉴定基因编辑阳性突变体
利用高通量测序方法对步骤（1）中获得的CRISPR/Cas9基因编辑突变体进行筛选鉴定，具体而言：
（1）针对靶位点设计PCR引物
靶位点设计好之后，在靶位点上下游设计特异性检测引物；
（2）对目的片段进行首轮PCR扩增
以提取的烟草基因组DNA为模板，利用步骤（1）中针对靶位点所设计的PCR引物进行扩增；
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收特异性目的条带；
（3）第二轮PCR
高通量测序前，给每个样本的序列中加入一段代表样本来源的Barcode序列标签；
（4）高通量测序
步骤（3）中第二轮PCR反应结束后，把孔板上不同排的样品先混合到其中一排，再将这一排的样品混合在一起，Control孔单独处理；
琼脂糖凝胶电泳检测混合后的PCR产物，胶回收特异性目的条带；
胶回收产物进行高通量测序的要求为：总浓度≥1.0 ng/μL，总质量≥30 ng，总体积≥15 μL；测序数据1.0~1.5 G。
2.如权利要求1所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（一）中，所述基因编辑突变体，目标基因为RAX23或MYC2b基因；
就目标基因RAX23、MYC2b，具体靶点序列及所设计引物序列如下：
3.如权利要求2所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（二）的步骤（1）中，引物设计时，
正向检测引物5’端增加正向前序列P1：5’-GTGCAGTGTCGAGATTGC-3’；
反向检测引物5’端增加反向前序列P2：5’-GATTCAGATGAGTTGATC-3’。
4.如权利要求3所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（二）的步骤（3）中，具体引物序列设计为：
RAX23-F：5'-TCTGATAATGATCACATGGTTCA-3'，
RAX23-R：5'-TGTTATTAGACTGGTACCTGAGTG-3'；
MYC2b-F：5'-TGCACGACAGATCCTGCAATAG-3'，
MYC2b-R：5'-CTTCACCTTTGGGATCACGG-3'。
5.如权利要求1所述CRISPR/Cas9基因编辑突变体的筛选鉴定方法，其特征在于，步骤（二）的步骤（4）中，使用Illumina HiSeq2500进行高通量测序。
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-
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