CN113355337A - 一种创制地黄杂合突变体的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种创制地黄杂合突变体的方法和应用，属于分子生物学技术领域，本发明所述的CRISPR/Cas9系统靶向地黄RgPDS1基因，RgPDS1基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶位点序列如SEQ ID NO.2所示，本发明根据靶序列合成一对互补的上下游引物；引物退火形成双链后通过酶切连接法插入CRISPR/Cas9植物表达载体pKSE401，进一步筛选出构建成功的重组质粒；将重组质粒转化根癌农杆菌，采用叶盘法遗传转化技术侵染地黄外植体并获得杂合突变体植株。首次实现了利用CRISPR/Cas9基因编辑体系在地黄中创制杂合突变体，为加速地黄分子育种进程，品种改良及种质资源的创新提供新的研究手段，还有利于进一步研究一些关键调控基因的功能。

Description

一种创制地黄杂合突变体的方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种创制地黄杂合突变体的方法及应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是广泛应用于生物体目标DNA修饰的基因编辑技术之一，其由gRNA与Cas9两部分组成。CRISPR/Cas9技术具有构建方法简单、应用范围广、编辑效率高和成本低等优点。CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于拟南芥、水稻、大豆、番茄等作物中，而在药用植物中的应用还较少。八氢番茄红素脱氢酶（PDS）的沉默或缺失会抑制类胡萝卜素的正常合成，从而影响类胡萝卜素对叶绿素的保护，造成富含叶绿素的绿色植物褪色而呈现白化现象。因此，PDS基因常被作为一种标记基因用于CRISPR/Cas9系统的适用性研究。

地黄（Rehmannia glutinosa）作为常用的大宗药材，为著名的“四大怀药”之一。其块根鲜品入药为鲜地黄（生地黄），能够清热生津、凉血、止血；经炮制后的地黄块根入药称熟地黄，能够滋阴补血，益精填髓。地黄中含有丰富的药用活性成分，如梓醇、地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷等，在抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗高血压、提高免疫力等方面具有重要的药理活性。然而，由于地黄长期进行无性繁殖，病虫害种类多，品种退化严重。而且地黄的基因组高度杂合，遗传基础狭窄，自交不亲和性，无法获得自交种子从而很难获得纯系。因此，地黄育种进程缓慢，新品种少，制约了地黄的规范化、产业化生产。基因编辑技术在克服植物自交不亲和、遗传改良和野生驯化等方面具有非常大的应用潜力，因此，基因编辑技术有利于推动地黄的种质创新和新品种培育，同时可以大大促进地黄的功能基因组学研究。然而，目前还未见关于CRISPR/Cas9基因编辑体系在地黄中的应用研究。

在植物生长发育中一些具有重要功能的基因纯合突变往往导致植株无法存活，而杂合突变仅仅降低了功能基因的作用使植株能够存活，便于分析目标基因部分缺失的遗传效应，有利于致死性基因的分子功能研究。对于生产上以无性繁殖为主的药用植物而言，杂合突变材料可以通过无性繁殖进行保存和扩大种植，目标基因的杂合突变体具有在生产上直接利用的潜力，为中药材的生产提供优异种质材料。目前植物基因编辑常用花序、悬浮细胞、胚性愈伤组织为遗传转化的受体，获得的纯合突变体所占比例高。本发明利用根癌农杆菌介导的叶盘法对CRISPR/Cas9基因编辑载体进行转化，首次实现了对地黄基因组DNA靶序列进行遗传修饰，并成功获得了高比例的目标基因的杂合突变体，对地黄的功能基因组学研究奠定了基础，而且为地黄的种质资源创新和新品种选育提供新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种创制地黄杂合突变体的方法和应用，在地黄中首次实现利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑地黄PDS基因，并成功获得pds基因突变的杂合突变体植株，为地黄遗传改良、种质资源创新、野生种质驯化和新品种选育等研究提供新的技术支持。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种创制地黄杂合突变体的方法，包括以下步骤：

（1）地黄总RNA的提取与反转录：取地黄块根鲜样置于液氮中冷冻后研磨，进行总RNA的提取，然后将提取的RNA反转录合成cDNA；

（2）地黄PDS基因的克隆：以拟南芥AtPDS3基因序列为参考，在已获得的地黄转录组数据库中进行同源比对筛选获得地黄PDS基因作为CRISPR/Cas9的靶向基因，并命名为RgPDS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据RgPDS1的序列，设计一对特异性引物RgPDS1_F和RgPDS1_R，取反转录合成的cDNA，稀释50倍后作为PCR扩增模板进行目的基因的克隆；

（3）靶位点的设计：根据PDS基因的序列在RgPDS1基因上设计靶位点，所述的靶位点序列如SEQ ID NO.2所示；

（4）构建地黄PDS基因的CRISPR/Cas9载体：根据靶序列信息合成一对反向互补的上下游引物，所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的sgPDS_F和SEQ ID NO.4所示的sgPDS_R，根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体；

（5）获得地黄杂合突变体：将重组载体转化农杆菌，并对地黄外植体进行遗传转化获得突变植株。

进一步的，所述步骤（2）中RgPDS1_F和RgPDS1_R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

进一步的，所述步骤（4）中根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体的具体操作为，将上下游引物退火形成双链后通过酶切连接法插入CRISPR/Cas9植物表达载体pKSE401，再次筛选出构建成功的重组质粒。

进一步的，所述靶序列引物包含Bsal I内切酶粘性末端。

进一步的，所述的农杆菌为根癌农杆菌LBA4404。

一种创制地黄杂合突变体的方法中利用靶位点或靶位点序列引物制备得到的CRISPR/Cas9系统用载体。

一种创制地黄杂合突变体的方法中CRISPR/Cas9载体在敲除地黄PDS基因并获得pds基因突变的杂合突变体中的应用。

一种利用CRISPR/Cas9系统创制地黄杂合突变体的方法在地黄pds基因杂合突变体表型分析与类胡萝卜素含量测定中的应用。

发明原理：本发明利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑地黄的PDS基因；利用在线网站根据PDS基因序列设计靶位点，根据靶位点序列合成一对互补的且含有Bsal I粘性末端的上下游引物；引物退火形成双链，通过酶切连接法构建含PDS靶序列的CRISPR/Cas9载体；将重组载体转化感受态大肠杆菌DH 5α，经菌液PCR鉴定与测序验证；将已鉴定的含正确靶序列的载体转化农杆菌，并保存菌株；菌株进行活化培养后，采用叶盘法遗传转化技术对地黄外植体进行侵染，进一步共培养、筛选培养后获得转基因植株。其中获得的转基因植株中含有杂合表型的pds基因突变体。提取这些杂合体植株DNA进行TA克隆测序，测序结果进一步显示PDS基因靶位点发生突变，其突变类型主要是碱基的缺失，然后是插入和替换。

本发明具有的优点是：本发明公布了一种利用CRISPR/Cas9系统通过叶盘法遗传转化技术侵染地黄，并获得地黄杂合突变体的方法，选择地黄PDS基因作为靶基因，并公布了地黄PDS基因的核苷酸序列，根据序列信息设计靶位点及引物的合成，并将其重组构建于CRISPR/Cas9系统，首次实现了基因编辑技术在地黄中的应用并成功获得地黄杂合突变体，为进一步挖掘功能基因、改良地黄种质、加速新品种选育等研究工作的开展提供新的研究途径，还有利于进一步研究一些关键调控基因的功能。

附图说明

图1是地黄PDS基因靶位点设计示意图；

图2是pKSE401-PDS重组质粒构建图；

图3是地黄PDS基因叶盘法遗传转化及再生植株的示意图；

图4是pds1转基因杂和突变体表型及含量测定图；

图5是转基因植株PCR阳性鉴定凝胶电泳结果图；

图6是地黄杂合突变体植株PDS1靶位点序列测序结果图。

具体实施方式

实施例

为使本发明实施目的、技术方案、优点更加清楚，下面将结合本发明实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而并非全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

本发明中生物材料的来源

pKSE401质粒由中国农业大学陈其军教授馈赠，其他常规试剂、药品及耗材均为现有技术中常规物质。

本发明第一方面提供了一种利用CRISPR/Cas9系统创制地黄杂合突变体的方法，其中以地黄PDS基因为靶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

本发明第二方面提供了一种利用CRISPR/Cas9系统创制地黄杂合突变体的方法在地黄pds1基因杂合突变体表型分析与类胡萝卜素含量测定中的应用。

1.地黄PDS基因的克隆

1.1.地黄总RNA的提取与反转录

取地黄（种植于河南农业大学的地黄85Z-5）块根鲜样置于液氮中迅速冷冻后研磨，进行总RNA的提取，其中RNA的提取方法按照RNA提取试剂盒（TaKaRa，大连）说明书进行；总RNA的浓度和质量采用超微量核酸蛋白测定仪进行测定，其A260/A280比值在1.9~2.0之间，A260/A230的比值大于2，说明总RNA几乎没有其他蛋白和多糖类物质的污染；同时采用琼脂糖凝胶电泳对总RNA的完整性进行验证，其中28S、18S和5S处条带清晰，说明RNA的完整性较好。反转录合成cDNA按照反转录试剂盒6210A型（TaKaRa，大连）试剂盒说明书进行。

1.2.地黄PDS基因的克隆

以拟南芥AtPDS3基因序列为参考，在已获得的地黄转录组数据库中进行同源比对筛选获得地黄PDS基因，并命名为RgPDS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述；根据RgPDS1的序列，设计一对特异性引物RgPDS1_F和RgPDS1_R（SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6），取反转录合成的cDNA，稀释50倍后作为PCR扩增模板，采用宝生物的Prime STAR高保真酶进行PCR扩增目的基因，其具体反应体系按照说明书进行。

2.含地黄PDS基因的CRISPR/Cas9载体的构建

2.1.靶点的设计与引物合成

利用基因编辑靶位点设计在线网站http://crispor.tefor.net/在地黄PDS1基因上设计靶位点；根据CRISPR/Cas9系统对PAM结构的识别特征，同时考虑靶位点的序列特征与位置，最终在地黄PDS1基因的第3个外显子上设计了长度为19 bp且3’端含有TGG的靶序列（图1），靶序列核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；根据靶序列信息合成一对反向互补的引物并包含Bsal I粘性末端，引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3的sgPDS_F和SEQ ID NO.4的sgPDS_R所示。

2.2.CRISPR/Cas9重组质粒的构建

取上述引物上下游各15μL，加入5μL NEB Buffer，去离子水15μL，在沸水中冷却至室温以形成双链；进一步通过混合酶切连接构建含靶序列的CRISPR/Cas9载体，取引物退火产物2μL，pKSE401约200 ng，10×NEB T4 Buffer 1.5μL，10×BSA 1.5 μL，Bsal I-HF 1μL，T4连接酶1μL，去离子水补足15μL体系；PCR反应条件为37℃，5 h；50℃，10 min；80℃，10min；重组质粒含有含靶序列的gRNA、Cas9及卡那霉素抗性基因（图2）。

2.3.农杆菌菌株的获得

将上述重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞并涂布于含卡那霉素抗生素的LB培养基上，挑取白色单克隆菌落进行菌液PCR验证，将PCR鉴定阳性的菌液送样测序；测序由上海生工生物有限公司完成；根据测序结果提取含有正确靶序列的CRISPR/Cas9质粒，进一步转化农杆菌LBA4404，经菌液PCR鉴定后保存阳性菌株。

3.根癌农杆菌介导的地黄遗传转化

3.1.农杆菌菌株的活化

取上述农杆菌菌株涂布于含卡那霉素的LB培养基上进行活化2次，挑取已活化的单克隆菌落以网线格方式划线于LB培养基上培养2 d，用MS液体培养基冲洗菌体后加入乙酰丁香酮用于遗传转化。

3.2.农杆菌与外植体的共培养

取地黄85Z-5组培苗的叶片剪成0.5 cm²大小的叶盘，放入上述含菌体、乙酰丁香酮（50~100 µmol/L）的MS液体中悬浮震荡培养7 min后取出，叶盘表面的液体用无菌滤纸吸干后放置于含有乙酰丁香酮（50~100 µmol/L）的MS固体培养基上，25℃暗培养2 d。

3.3.地黄转化体的抗性筛选与继代培养

将上述共培养的地黄叶盘放置于抗性筛选培养基，培养基中含有乙酰丁香酮、特美汀（200~300 mg/L）和卡那霉素（30~100 mg/L）；在25℃条件下继续暗培养，每两周换一次培养基，直至叶盘周围长出愈伤后放置于光照培养箱中继续培养；待愈伤分化长出再生芽后剪取芽尖放置于培养瓶中使之生根，一般20 d左右继代培养一次（图3-A）。

4.转基因植株的鉴定与分析

4.1.地黄转基因植株的获得与阳性鉴定

本发明基于根癌农杆菌介导的叶盘法遗传转化技术共获得37个再生芽，包括11个具有白化表型的再生芽；具有杂合白化表型的再生芽有5个，有表型的比例为38.46%。进一步根据CRISPR/Cas9载体特征，在Cas9蛋白（SEQ ID NO. 7的Cas9_F 和SEQ ID NO.8的Cas9_R）及靶点前侧设计特异性引物RgPDS_iF（SEQ ID NO.9）靶点下游引物sgPDS_R（SEQID NO.4），用于鉴定地黄转基因再生植株；采用CTAB法对8个具有代表性表型的地黄转基因植株提取总DNA，以该DNA为模板采用宝生物ExTaq酶进行PCR扩增。结果表明，利用上述特异性引物进行PCR扩增，8个再生植株在474 bp和281 bp处均有明显的电泳条带（图4），其阳性率达100%，表明所获得的地黄转基因再生苗中含有CRISPR/Cas9重组质粒。

4.2.地黄转基因再生植株的表型分析与含量测定

已获得的地黄pds1杂合突变转基因再生植株的表型主要包含两种类型：叶片白色而茎部绿色的杂合突变体（图3-B）及叶和茎均部分白化（图3-C）的植株。pds1纯合突变或复等位突变由于自身叶绿体降解，导致植株无法存活，而杂合体由于能够产生少量的类胡萝卜素保护叶绿体不被破坏而使植物能够存活。叶生杂色的嵌合体植株表现株型矮化（图5-A），块根表皮由桔红色变为白色（图5-B）；pds1基因编辑的杂合地黄突变体叶中总类胡萝卜素、叶绿素a、叶绿素b较野生型分别下降了96.94%、94.21%和89.32%（图5-C），块根中的类胡萝卜素含量下降为野生型块根的1.83%（图5-D）。

4.3.TA克隆分析靶位点碱基突变类型

本发明在地黄PDS基因靶位点上下游分别设计特异性引物（SEQ ID NO.10的RgPDS_NF和SEQ ID NO.11的RgPDS_NR），以杂合突变体植株的DNA为模板，采用ExTaq酶进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；对能够在432bp处扩增出特异性目标条带的PCR产物采用天根胶回收试剂盒回收目标产物；利用Illumina MiSeq平台对PCR产物进行高通量测序，靶位点突变类型分析结果显示，所有的突变体至少有2种主要的突变类型，8个具有白化表型的地黄pds1突变体，只有株系#9为复等位突变，其余均为杂合突变，杂合突变率达87.5%（图6）。该结果表明CRISPR/Cas9基因编辑技术实现了对地黄PDS基因的靶向编辑并高效获得了地黄的杂合突变体。

序列表

<110> 河南农业大学

焦作市玖道种苗繁育有限公司

<120> 一种创制地黄杂合突变体的方法及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1764

<212> DNA

<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)

<400> 1

atggcccaat tcggacacgt ttctgctgtt agcttgaaca gtcaaaatag cactgccaat 60

gtttggagtt tacagtccgc taggagacat ggctgcactg ctagcagatg tggcagcact 120

gttgggcaaa cgggtgggct gtcatttaca ggtagtgatg cgatgggtca taaattaagg 180

attccagctg cacgtgcttt tacaacgaga tcgaacaggg atgcatccgt tttgaaagtt 240

gtttgcatcg actatccgag accagagctc gagaatacag tcaactattt ggaagctgct 300

tacttatcct catcatttcg tacttctcct cgtccaaaca agccattgca agtggtcatt 360

gctggtgcag gtttggctgg tttgtctact gcgaagtatt tggcagatgc aggccataaa 420

ccaatattgt tggaagcaag ggatgtgctg ggtggaaaag tggctgcatg gaaagatgac 480

gaaggagact ggtacgagac tgggttgcac atattttttg gagcttatcc aaatgtgcag 540

aacctgtttg gagagctagg cattaatgat cggttgcaat ggaaggagca ttctatgata 600

ttcgcaatgc caaacaaacc aggagagttt agccggttcg attttcctga aatcttacct 660

gcaccaataa atggaatatt ggccatcttg aagaacaatg aaatgcttac ttggccagat 720

aaagtcaagt ttgccattgg acttttgcct gccataattg gcggtcagtc ttatgttgaa 780

gctcaagatg gaataacagt caaagactgg atgagaaagc agggtgtacc agatagggtg 840

accgatgaag tgttcattgc catgtcaaag gcactgaact tcataaaccc tgatgagctt 900

tcaatgcaat gtgttttgat tgctttgaac cgatttctgc aggagaagca tggttccaag 960

atggcttttt tggatggtaa tcccccagaa agactatgca tgccaattgt tgatcatatt 1020

gagtctcgag gtggccaagt ccgacttaac tcacgaatac aaaagattga gctaaatgaa 1080

gatggaagtg tcaaaagctt catactgaat gatggaaatg tgatcgaagg agatgcatat 1140

gtatttgcaa ctccagttga tatcctgaag ctgcttctgc ctgaggactg gaaaaagatg 1200

caatatttca gtaaattgga gaaattagtc ggagtgccag ttataaatgt tcacatatgg 1260

tttgacagaa aactgaagaa cacatatgat catctacttt tcagcagaag cccacttctc 1320

agcgtatacg ctgacatgtc cgtaacttgt aaggaatatt acaaccctaa tcagtctatg 1380

ttggagttgg tttttgcacc cgctgaggaa tggatatcgc gaagtaatga agaaatcatt 1440

gaagctacta tgaaggaact cgcgaaacta tttcctgatg aaatttccgc tgatcagagc 1500

aaagcaaaaa tattgaaata ccacattgtc aaaactccta ggtctgtata taaaactaca 1560

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ggtgattaca caaagcaaaa gtacttggca tcgatggaag gtgctgtcct atcgggaaag 1680

ctttgtgctc aggccattgt aaaggattct gaaatgttgg ctcccaaaga acagagagag 1740

ttggcagagg caaccgttgc ctaa 1764

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)

<400> 2

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<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)

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<210> 4

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<212> DNA

<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)

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<210> 5

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<210> 6

<211> 20

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<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)

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tcaacggcat tcgggacaag 20

<210> 8

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<210> 9

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<400> 9

tgtcccagga ttagaatgat taggc 25

<210> 10

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<212> DNA

<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)

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agcctcttcc tcaacactga 20

<210> 11

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<212> DNA

<213> 地黄(Rehmannia glutinosa)

<400> 11

atatgtgcaa cccagtctcg 20

Claims (8)

1.一种创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

地黄总RNA的提取与反转录：取地黄块根鲜样置于液氮中冷冻后研磨，进行总RNA的提取，然后将提取的RNA反转录合成cDNA；

地黄PDS基因的克隆：以拟南芥AtPDS3基因序列为参考，在已获得的地黄转录组数据库中进行同源比对筛选获得地黄PDS基因作为CRISPR/Cas9的靶向基因，并命名为RgPDS1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，根据RgPDS1的序列，设计一对特异性引物RgPDS1_F和RgPDS1_R，取反转录合成的cDNA，稀释50倍后作为PCR扩增模板进行目的基因的克隆；

靶位点的设计：根据PDS基因的序列在RgPDS1基因上设计靶位点，所述的靶位点序列如SEQ ID NO.2所示；

构建地黄PDS基因的CRISPR/Cas9载体：根据靶序列信息合成一对反向互补的上下游引物，

所述的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的sgPDS_F和SEQ ID NO.4所示的sgPDS_R，根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体；

获得地黄杂合突变体：将重组载体转化农杆菌，并对地黄外植体进行遗传转化获得突变植株。

2.如权利要求1所述的创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于：所述步骤（2）中RgPDS1_F和RgPDS1_R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO.6所示。

3.如权利要求2所述的创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于：所述步骤（4）中根据靶位点或靶序列引物制备得到含靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑系用载体的具体操作为，将上下游引物退火形成双链后通过酶切连接法插入CRISPR/Cas9植物表达载体pKSE401，再次筛选出构建成功的重组质粒。

4.如权利要求3所述的创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于：所述靶序列引物包含Bsal I内切酶粘性末端。

5.如权利要求4所述的创制地黄杂合突变体的方法，其特征在于：所述的农杆菌为根癌农杆菌LBA4404。

6.一种如权利要求1-5任一所述的创制地黄杂合突变体的方法中利用靶位点或靶位点序列引物制备得到的CRISPR/Cas9系统用载体。

7.一种如权利要求1-5任一所述的创制地黄杂合突变体的方法中CRISPR/Cas9载体在敲除地黄PDS基因并获得pds基因突变的杂合突变体中的应用。

8.一种利用CRISPR/Cas9系统创制地黄杂合突变体的方法在地黄pds基因杂合突变体表型分析与类胡萝卜素含量测定中的应用。

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