CN117363631B - Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用 - Google Patents

Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用，涉及生物技术领域。该Glyma.08g111100基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列存在SNP1‑SNP77个SNP位点，所述SNP1‑SNP7依次位于136bp、291bp、575bp、644bp、1272bp、1638bp和1639bp碱基处，依次为A/T、G/T、G/A、T/C、A/G、T/C和G/A突变。本发明经过单倍型分析和酵母转基因验证实验证实，Glyma.08g111100基因的突变类型可以影响大豆芽期的耐盐碱能力，因此该基因可应用于鉴定大豆耐盐碱性。

Description

Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用。
背景技术
大豆是重要的粮食作物以及油料作物，是提供优质植物蛋白和油分的作物原料，而土壤盐碱化是一个世界性的生态问题，是一种严重影响植物生长发育的非生物胁迫；而盐碱胁迫又不同干旱胁迫，它会从植物的萌发阶段就开始进行胁迫，一直胁迫到植物的衰老。而芽期作为受胁迫的敏感时期，容易影响植株的后期生长，从而使得产量严重减产，造成很大的经济损失。
当前，人类所面临的粮食问题日益加剧，有必要充分利用盐碱地这种后备资源，通过培育芽期耐盐碱大豆，使得其能够在盐碱地上正常种植，从而对保障粮食储备起到重要作用。因此，亟需挖掘大豆的耐盐碱基因，来应用于大豆耐盐碱品种的育种。
发明内容
本发明的目的是提供Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现Glyma.08g111100基因与大豆芽期的耐盐碱性相关，可应用于鉴定大豆耐盐碱性，从而为大豆耐盐碱品种的育种提供了技术支持。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种鉴定大豆耐盐碱性的Glyma.08g111100基因，所述Glyma.08g111100基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列存在SNP1-SNP77个SNP位点，所述SNP1-SNP7依次位于136bp、291bp、575bp、644bp、1272bp、1638bp和1639bp碱基处，依次为A/T、G/T、G/A、T/C、A/G、T/C和G/A突变。
本发明还提供上述的Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用，所述大豆耐盐碱性为大豆芽期耐盐碱性。
进一步地，所述SNP1-SNP7的单倍型为TTACGCA时，提示大豆芽期耐盐碱性高。
本发明还提供一种鉴定大豆耐盐碱性的SNP位点组合，所述SNP位点组合包括SNP1-SNP77个SNP位点，所述SNP1-SNP7依次位于如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的136bp、291bp、575bp、644bp、1272bp、1638bp和1639bp碱基处，依次为A/T、G/T、G/A、T/C、A/G、T/C和G/A突变。
本发明还提供上述的SNP位点组合在鉴定大豆耐盐碱性中的应用，所述大豆耐盐碱性为大豆芽期耐盐碱性。
进一步地，所述SNP1-SNP7的单倍型为TTACGCA时，提示大豆芽期耐盐碱性高。
本发明还提供一种鉴定大豆芽期耐盐碱性的方法，包括以下步骤：
提取得到待检大豆样品的总RNA，反转录得到cDNA；
以所述cDNA为模板扩增得到包含上述的SNP位点组合的DNA片段；
对所述DNA片段进行测序，当上述的SNP1-SNP7的单倍型为TTACGCA时，提示所述待检大豆样品的芽期耐盐碱性高。
本发明还提供一种鉴定大豆芽期耐盐碱性的试剂盒，其特征在于，包括扩增包含上述SNP位点组合的DNA片段的引物对。
本发明公开了以下技术效果：
本发明采用基于混合线性模型(MLM)的GEMMA对990份大豆种质材料的5294832个SNP进行GWAS分析，筛选得到了大豆芽期的耐盐碱性相关的Glyma.08g111100基因，经过单倍型分析和酵母转基因验证实验证实，Glyma.08g111100基因的突变类型确实可以影响大豆芽期的耐盐碱能力，Hap2单倍型的大豆植株具有更强的耐盐碱能力。
本发明证明了Glyma.08g111100基因与大豆芽期的耐盐碱性相关，可应用于鉴定大豆耐盐碱性，从而为大豆耐盐碱品种的育种提供了技术支持。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为大豆种质资源的耐盐碱能力鉴定结果；
图2为大豆芽期耐盐碱性状的关联分析曼哈顿图；
图3为大豆芽期耐盐碱候选区段的连锁不平衡模块图；
图4为Glyma.08g111100基因的单倍型分析结果；其中，A为核苷酸序列比对结果；B为氨基酸序列比对结果；C为蛋白结构示意图；D为盐碱胁迫指数检测结果；在A、B和D中，Hap1为敏感单倍型，Hap2代表耐盐碱单倍型；
图5为盐碱敏感型和耐盐碱型Glyma.08g111100蛋白的氨基酸序列比对结果；
图6为Glyma.08g111100的转基因酵母验证实验结果；其中，CK为正常培养基；SA为盐碱胁迫培养基。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1大豆耐盐碱优异基因挖掘
(1)GWAS分析挖掘芽期耐盐碱优异基因
GWAS分析挖掘芽期耐盐碱优异基因：采用基于混合线性模型(MLM)的GEMMA对899份材料(见表1)的5294832个SNP进行GWAS分析，种群结构由PLINKv1.90软件进行SNP主成分分析(PCA)中的前三个分量控制。结果P值采用Bonferroni校正在α＝0.05的水平上进行调整，截止值为9.44×10-09。
表1
经过三次重复，对899份大豆种质资源进行芽期耐盐碱鉴定，结果见图1，其中耐盐胁迫(数值越大代表胁迫越强，数值越小代表胁迫越弱，下同)指数平均值为36.15％，中位数是37.51％，峰度为0.179，偏度为-0.313，结果符合正态分布，可作为后续实验进行分析。
利用GEMMA的MLM模型对大豆芽期耐盐碱等进行GWAS分析，在P≤9.44×10-9阈值下检测到了37个SNPs，主要分布在8号染色体上，效应值最高的SNP为Gm08_8423277(图2)。
选取Peak点前后100Kb区域，利用连锁不平衡分析进一步对于8号染色体区间进行分析，将区间成功缩小至8.37Mb至8.70Mb范围内，并作为重点候选区段进行锚定(图3)。
对区间内重要的候选基因进行单倍型分析，在基因Glyma.08g111100中，在DNA区段中在多个bp处发生突变，碱基的突变会导致蛋白质的氨基酸发生变化(见表2、图4中A-B和图5)，从而导致了蛋白的结构发生改变(图4中C)，进而芽期耐盐碱的能力也发生了改变(图4中D)。耐盐碱型Glyma.08g111100基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，盐碱敏感型Glyma.08g111100基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；耐盐碱型Glyma.08g111100蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，盐碱敏感型Glyma.08g111100蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
表2耐盐碱型和盐碱敏感型Glyma.08g111100基因和蛋白的序列比对
注：“/”表示氨基酸未发生变化。
Glyma.08g111100基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：
ATGAGTGTTGATGCCATACCTTTAAAGTCTTCTGGTAAACCTAGCCTTCAAACGTTTATGGTTGTTGTGGAGAAGGAGCTGTCTACTTTAGTGCATCAGATTACATCATTGCTCCATAATTCTTCACTTCATAGTWATTCAAAACAGGTTTCTGGACTCCACGAGGCTCTTCAAAATGAGAATCAAATTCGTGAAAAATACTCCAGTGGCTCTGATATATTATATTCTGTGGAAGATCTGCAAGAGGAGTTGACAAAGCTTTCTCAAGGTCGACGATTGCAGCTAACTTTKGGGGGACAAGGGTACTCCACTTTTTCTTACAGAGCTGTAATTCTTGATGCTGAGGAACAGGCTGACCCATTTACCTATCACTGTGGGGTTTTCATTGTGCCTAAGACTCGTGCACGTGAATGGCTTTTCTATTCTGAAGAAGGACAGTGGATGGTGGTCAGAAGCTCCAAAGCAGCTCGTCTCATAATGGTTTACTTGGATGCCAGCCATTCAGATACCAGCATGGAGGAGATTCAGAAGGATTTGTCTCCGTTGGTTACACAGTTGGCACCTGCAGAAAATGRGAATGGAGCTAAAATACCTTTCATGATGGCAAGTGAGGGGATCAAGGAGCGAAACATCATTCATAAGGYCACATCTTCATTAACTGGATCAATTATTGTTGAAGATGTAATTTATGAAAATGTTGATAGTGAAGTCAGTTGTATTTTTCCTTCTGGAGAGTTGATGTTTCGACGCCTTGTATTCGAGAGAGCTGCAAATTTGGTGCAGTCTGAAGCTTTGCTAAAAGATGAACAGTTGCCTACCAAATTGGTTAGTGAGACAGGGAAGAAGAAAAACAATGCATCTTCCAAATCTAGGAAAAGTGGATCTTGGAGAGACAGTGTTGGAGCAAGCAGTCAGTTGACTGTCTATCATGGCTATGTAGCTAGTTCTTATCATACAGGGATTATTTCAGGATTCATGCTAATATCTTCTCACATGGAAAATGTGGCATCAAGTGGGAAAATGGTAAAAGCTGTAATAATAGGTCTTGGAGCAGGTTTACTTCCCATGTTTCTTCACGGATGTATCCCCTTTTTGGAAATTGAGACTGTGGAGTTAGACCCCATGATTGTTGATATTGCAAGGGACTACTTCAGTTTTGTTGAGGATAAACATGTAAAGGTGCATATAGCTGATGGGATCCAGTTTGTCCGGGAGATTGACAGTTCTGGAGCAGCTCAGATTCATGGAAAAAGTAATGATCCTAGCTATACRGATACCGCTTTAAATGCAAGTTCAGCTGTGTCTCATGCTGATGTAGAAGTGACAAAAGTTGATATAATTATTGTTGATGTTGACTCTTCAGACCCAAGCTCGGGATTGACATGCCCTGCTCCGGATTTTTTGGATGAGTCTTTTCTTGAGACTGTAAAGGATAGACTTTCAGAGGATGGTCTCTTTGTTGTCAATTTGGTGTCACGGTCCCAAGCCATTAAAGATATGGCTCTCTCAAAAATGAAAAAGGTTTTCAGCCACCTCTTCTGCCTCCAGCTTGACGAGGACGTCAATGAGGTTCATTTTGCCCTCAAATCTGAGTCCTGTATTGAGGATAGCTGTTTCTCCGAAGCTTCTCTTAAACTYRATAAATTGTTGGAGTTCAAACACCCGGAGATAGGTCAAAACATTATCAATGCGACAAAAAAGATCAGACGTTTAAAGTGA；其中，下划线处为突变位点，W为A或T，K为G或T，R为A或G，Y为C或T。
耐盐碱型Glyma.08g111100基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：
ATGAGTGTTGATGCCATACCTTTAAAGTCTTCTGGTAAACCTAGCCTTCAAACGTTTATGGTTGTTGTGGAGAAGGAGCTGTCTACTTTAGTGCATCAGATTACATCATTGCTCCATAATTCTTCACTTCATAGTTATTCAAAACAGGTTTCTGGACTCCACGAGGCTCTTCAAAATGAGAATCAAATTCGTGAAAAATACTCCAGTGGCTCTGATATATTATATTCTGTGGAAGATCTGCAAGAGGAGTTGACAAAGCTTTCTCAAGGTCGACGATTGCAGCTAACTTTTGGGGGACAAGGGTACTCCACTTTTTCTTACAGAGCTGTAATTCTTGATGCTGAGGAACAGGCTGACCCATTTACCTATCACTGTGGGGTTTTCATTGTGCCTAAGACTCGTGCACGTGAATGGCTTTTCTATTCTGAAGAAGGACAGTGGATGGTGGTCAGAAGCTCCAAAGCAGCTCGTCTCATAATGGTTTACTTGGATGCCAGCCATTCAGATACCAGCATGGAGGAGATTCAGAAGGATTTGTCTCCGTTGGTTACACAGTTGGCACCTGCAGAAAATGAGAATGGAGCTAAAATACCTTTCATGATGGCAAGTGAGGGGATCAAGGAGCGAAACATCATTCATAAGGCCACATCTTCATTAACTGGATCAATTATTGTTGAAGATGTAATTTATGAAAATGTTGATAGTGAAGTCAGTTGTATTTTTCCTTCTGGAGAGTTGATGTTTCGACGCCTTGTATTCGAGAGAGCTGCAAATTTGGTGCAGTCTGAAGCTTTGCTAAAAGATGAACAGTTGCCTACCAAATTGGTTAGTGAGACAGGGAAGAAGAAAAACAATGCATCTTCCAAATCTAGGAAAAGTGGATCTTGGAGAGACAGTGTTGGAGCAAGCAGTCAGTTGACTGTCTATCATGGCTATGTAGCTAGTTCTTATCATACAGGGATTATTTCAGGATTCATGCTAATATCTTCTCACATGGAAAATGTGGCATCAAGTGGGAAAATGGTAAAAGCTGTAATAATAGGTCTTGGAGCAGGTTTACTTCCCATGTTTCTTCACGGATGTATCCCCTTTTTGGAAATTGAGACTGTGGAGTTAGACCCCATGATTGTTGATATTGCAAGGGACTACTTCAGTTTTGTTGAGGATAAACATGTAAAGGTGCATATAGCTGATGGGATCCAGTTTGTCCGGGAGATTGACAGTTCTGGAGCAGCTCAGATTCATGGAAAAAGTAATGATCCTAGCTATACGGATACCGCTTTAAATGCAAGTTCAGCTGTGTCTCATGCTGATGTAGAAGTGACAAAAGTTGATATAATTATTGTTGATGTTGACTCTTCAGACCCAAGCTCGGGATTGACATGCCCTGCTCCGGATTTTTTGGATGAGTCTTTTCTTGAGACTGTAAAGGATAGACTTTCAGAGGATGGTCTCTTTGTTGTCAATTTGGTGTCACGGTCCCAAGCCATTAAAGATATGGCTCTCTCAAAAATGAAAAAGGTTTTCAGCCACCTCTTCTGCCTCCAGCTTGACGAGGACGTCAATGAGGTTCATTTTGCCCTCAAATCTGAGTCCTGTATTGAGGATAGCTGTTTCTCCGAAGCTTCTCTTAAACTCAATAAATTGTTGGAGTTCAAACACCCGGAGATAGGTCAAAACATTATCAATGCGACAAAAAAGATCAGACGTTTAAAGTGA；其中，下划线处为突变位点。
盐碱敏感型Glyma.08g111100基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.3)：
ATGAGTGTTGATGCCATACCTTTAAAGTCTTCTGGTAAACCTAGCCTTCAAACGTTTATGGTTGTTGTGGAGAAGGAGCTGTCTACTTTAGTGCATCAGATTACATCATTGCTCCATAATTCTTCACTTCATAGTAATTCAAAACAGGTTTCTGGACTCCACGAGGCTCTTCAAAATGAGAATCAAATTCGTGAAAAATACTCCAGTGGCTCTGATATATTATATTCTGTGGAAGATCTGCAAGAGGAGTTGACAAAGCTTTCTCAAGGTCGACGATTGCAGCTAACTTTGGGGGGACAAGGGTACTCCACTTTTTCTTACAGAGCTGTAATTCTTGATGCTGAGGAACAGGCTGACCCATTTACCTATCACTGTGGGGTTTTCATTGTGCCTAAGACTCGTGCACGTGAATGGCTTTTCTATTCTGAAGAAGGACAGTGGATGGTGGTCAGAAGCTCCAAAGCAGCTCGTCTCATAATGGTTTACTTGGATGCCAGCCATTCAGATACCAGCATGGAGGAGATTCAGAAGGATTTGTCTCCGTTGGTTACACAGTTGGCACCTGCAGAAAATGGGAATGGAGCTAAAATACCTTTCATGATGGCAAGTGAGGGGATCAAGGAGCGAAACATCATTCATAAGGTCACATCTTCATTAACTGGATCAATTATTGTTGAAGATGTAATTTATGAAAATGTTGATAGTGAAGTCAGTTGTATTTTTCCTTCTGGAGAGTTGATGTTTCGACGCCTTGTATTCGAGAGAGCTGCAAATTTGGTGCAGTCTGAAGCTTTGCTAAAAGATGAACAGTTGCCTACCAAATTGGTTAGTGAGACAGGGAAGAAGAAAAACAATGCATCTTCCAAATCTAGGAAAAGTGGATCTTGGAGAGACAGTGTTGGAGCAAGCAGTCAGTTGACTGTCTATCATGGCTATGTAGCTAGTTCTTATCATACAGGGATTATTTCAGGATTCATGCTAATATCTTCTCACATGGAAAATGTGGCATCAAGTGGGAAAATGGTAAAAGCTGTAATAATAGGTCTTGGAGCAGGTTTACTTCCCATGTTTCTTCACGGATGTATCCCCTTTTTGGAAATTGAGACTGTGGAGTTAGACCCCATGATTGTTGATATTGCAAGGGACTACTTCAGTTTTGTTGAGGATAAACATGTAAAGGTGCATATAGCTGATGGGATCCAGTTTGTCCGGGAGATTGACAGTTCTGGAGCAGCTCAGATTCATGGAAAAAGTAATGATCCTAGCTATACAGATACCGCTTTAAATGCAAGTTCAGCTGTGTCTCATGCTGATGTAGAAGTGACAAAAGTTGATATAATTATTGTTGATGTTGACTCTTCAGACCCAAGCTCGGGATTGACATGCCCTGCTCCGGATTTTTTGGATGAGTCTTTTCTTGAGACTGTAAAGGATAGACTTTCAGAGGATGGTCTCTTTGTTGTCAATTTGGTGTCACGGTCCCAAGCCATTAAAGATATGGCTCTCTCAAAAATGAAAAAGGTTTTCAGCCACCTCTTCTGCCTCCAGCTTGACGAGGACGTCAATGAGGTTCATTTTGCCCTCAAATCTGAGTCCTGTATTGAGGATAGCTGTTTCTCCGAAGCTTCTCTTAAACTTGATAAATTGTTGGAGTTCAAACACCCGGAGATAGGTCAAAACATTATCAATGCGACAAAAAAGATCAGACGTTTAAAGTGA；其中，下划线处为突变位点。
耐盐碱型Glyma.08g111100蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)：
MSVDAIPLKSSGKPSLQTFMVVVEKELSTLVHQITSLLHNSSLHSYSKQVSGLHEALQNENQIREKYSSGSDILYSVEDLQEELTKLSQGRRLQLTFGGQGYSTFSYRAVILDAEEQADPFTYHCGVFIVPKTRAREWLFYSEEGQWMVVRSSKAARLIMVYLDASHSDTSMEEIQKDLSPLVTQLAPAENENGAKIPFMMASEGIKERNIIHKATSSLTGSIIVEDVIYENVDSEVSCIFPSGELMFRRLVFERAANLVQSEALLKDEQLPTKLVSETGKKKNNASSKSRKSGSWRDSVGASSQLTVYHGYVASSYHTGIISGFMLISSHMENVASSGKMVKAVIIGLGAGLLPMFLHGCIPFLEIETVELDPMIVDIARDYFSFVEDKHVKVHIADGIQFVREIDSSGAAQIHGKSNDPSYTDTALNASSAVSHADVEVTKVDIIIVDVDSSDPSSGLTCPAPDFLDESFLETVKDRLSEDGLFVVNLVSRSQAIKDMALSKMKKVFSHLFCLQLDEDVNEVHFALKSESCIEDSCFSEASLKLNKLLEFKHPEIGQNIINATKKIRRLK*。
盐碱敏感型Glyma.08g111100蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：
MSVDAIPLKSSGKPSLQTFMVVVEKELSTLVHQITSLLHNSSLHSNSKQVSGLHEALQNENQIREKYSSGSDILYSVEDLQEELTKLSQGRRLQLTLGGQGYSTFSYRAVILDAEEQADPFTYHCGVFIVPKTRAREWLFYSEEGQWMVVRSSKAARLIMVYLDASHSDTSMEEIQKDLSPLVTQLAPAENGNGAKIPFMMASEGIKERNIIHKVTSSLTGSIIVEDVIYENVDSEVSCIFPSGELMFRRLVFERAANLVQSEALLKDEQLPTKLVSETGKKKNNASSKSRKSGSWRDSVGASSQLTVYHGYVASSYHTGIISGFMLISSHMENVASSGKMVKAVIIGLGAGLLPMFLHGCIPFLEIETVELDPMIVDIARDYFSFVEDKHVKVHIADGIQFVREIDSSGAAQIHGKSNDPSYTDTALNASSAVSHADVEVTKVDIIIVDVDSSDPSSGLTCPAPDFLDESFLETVKDRLSEDGLFVVNLVSRSQAIKDMALSKMKKVFSHLFCLQLDEDVNEVHFALKSESCIEDSCFSEASLKLDKLLEFKHPEIGQNIINATKKIRRLK*。
实施例2Glyma.08g111100基因的功能验证
1.材料
1.1菌株和载体
大肠杆菌菌株DH5α购自北京擎科生物科技股份有限公司；酿酒酵母INVScⅠ和酵母表达质粒载体pYES2均购自北京酷来搏科技有限公司。
1.2主要试剂
HindⅢ、EcoRⅠ限制性内切酶购自NEB(北京)有限公司；同源重组酶购自北京擎科生物科技股份有限公司；RNA提取试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；KOD-Fx高保真酶、无水乙醇、琼脂糖等。
1.3主要设备仪器
高速低温离心机、漩涡震荡仪、水浴锅、高压灭菌锅、核酸蛋白检测仪、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液枪、枪头及EP管等。
2.植物总RNA的提取与检测
对大豆种子进行萌发，取4天后胚根作为样品。样品采集后应立即置于液氮中冷冻，
转入-80℃超低温冰箱中保存。RNA提取方法参照RNA提取试剂盒说明书。最后溶解于无RNase水中，检测所制备样品质量。
首先测定所提取RNA浓度及OD260/280、OD260/230数值，随后进行电泳检测RNA完整性。
3.Glyma08G.111100基因的分子克隆
3.1cDNA第一链的合成
根据RNA样品浓度计算体积，取1μg总RNA作为模板，参考反转录试剂盒说明书进行RT-PCR反转录成cDNA。
3.2Glyma08G.111100基因的克隆及PCR产物的回收纯化
3.2.1引物设计
首先利用Phytozome找出CDS序列，使用Snapgene进行引物设计，送至上海生工合成。引物序列如表3所示：
表3引物序列
3.2.2 Glyma08G.111100基因片段扩增和PCR产物的回收纯化
PCR扩增体系如表4所示：
表4 PCR体系
组成成分 体积
10×Buffer for KOD-Fx 25μL
2mM dNTPs 10μL
Primer 3μL
Template 1μL
Nuclease-free Water 10μL
KOD-Fx 1μL
PCR反应程序为：94℃预变形2min；98℃变形10s，55℃退火45s；68℃延伸2min，设置35次循环；68℃延伸5min。将PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳验证长度，在紫外灯下，使用新拆封刀片尽可能切除下单一目的DNA条带。将切下的含有DNA片段的凝胶装入已称重1.5mL离心管中，称重后计算凝胶重量，使用回收试剂盒进行产物回收，参照说明书进行实验操作，收集DNA溶液于-20℃保存。
3.3pYES2质粒的获取
本试验所用酵母表达载体为pYES2，将购买得到的少量pYES2质粒经平板化线接种于LB固体培养基(抗生素为100mg/mL氨苄青霉素)上过夜培养，随后挑取单菌落于液体培养基中过夜摇菌，参照质粒提取试剂盒说明书提取pYES2质粒。
为将扩增出的目的片段连接到载体上，需要制备具有相同粘性末端的pYES2质粒与基因片段。首先，用EcorRⅠ和HindⅢ双酶切pYES2质粒，经过琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收相应片段。
酶切体系如表5所示：
表5酶切体系
组成成分 体积
限制性内切酶 各1μL
DNA 1μg
10×NEBuffer 5μL
无核酸酶水 补足至50μL
将体系成分加入到200μL离心管中，轻弹混匀，短暂离心5s后，37℃30min，65℃20min热失活。
3.4目的片段与酵母表达载体的连接及转化
测取回收纯化后相应片段的浓度，使用同源重组酶将目的片段与载体片段连接，构建重组质粒载体。连接体系如表6所示：
表6连接体系
组成成分 体积
2×SoSoo Mix 5μL
线性载体 4μL
目的片段 1μL
将体系成分加入到200μL离心管中，轻弹混匀，短暂离心5s后，放置于50℃30min。
将重组质粒载体转入到DH5α感受态细胞中，培养基抗生素为100mg/mL氨苄青霉素。经过夜培养后，平板中生长菌落为转化后具有氨苄青霉素抗性菌，挑取单菌落接种于含有氨苄青霉素的液体培养基中，于200rpm 37℃过夜培养。以培养过夜的菌液为模板，进行菌液PCR。选择PCR鉴定为阳性菌液，采用质粒提取试剂盒提取重组质粒载体。
3.5酵母转化
取新鲜制备的酵母感受态细胞，参照说明书转化部分，于室温下进行酵母的转化。最终取50μL转化混合物均匀涂布在SD-Ura(葡萄糖)固体培养基上，置于30℃培养3d至长出白色菌落。
挑取生长的白色单菌落于SD-Ura液体培养基中，30℃200rpm培养过夜，取菌液于100℃5min破胞处理，以5μL破胞菌液为模板进行PCR检测，以确定目的基因是否准确整合到酵母表达载体中。
3.6重组酵母的表型鉴定
将重组酵母分别重新命名为INVScⅠ(pYES2-Glyma08G.111100N)和INVScⅠ(pYES2-Glyma08G.111100M)；其中，INVScⅠ(pYES2-Glyma08G.111100N)为导入实施例1的耐盐碱型Glyma.08g111100基因；NVScⅠ(pYES2-Glyma08G.111100M)为导入实施例1的盐碱敏感型Glyma.08g111100基因。
为验证盐碱胁迫对转基因酵母的影响，采用NaCl、Na2CO3、NaHCO3和Na2SO4(摩尔比为1:1:9:9)的混合盐碱胁迫的方法，观察其生长状况，并重复三次。
(1)在超净工作台，挑取验证成功的重组酵母与转空载体酵母于YPDA液体培养基(葡萄糖)中，30℃200rpm震荡培养过夜；
(2)测定过夜菌液OD600，计算所需菌液量，使5mL的添加半乳糖(SD-Ura)的诱导培养基OD值为0.4；
(3)取所需体积的菌液量，于8000rpm离心1min；
(4)先用1mL SD-Ura重悬菌体，然后补足至5mL；
(5)于30℃200rpm震荡培养过夜；
(6)测定过夜菌液OD600，计算后统一调整OD600为2.0；
(7)统一将菌液分别稀释10-1倍、10-2倍、10-3倍、10-4倍、10-5倍；
(8)以转入空载体酵母的INVScⅠ(pYES2)作为对照，将未稀释菌液与稀释后菌液各取5μL，分别接种于正常的YPDA固体培养基和混合盐碱胁迫的YPDA固体培养基上；
(9)30℃培养5d；
(10)观察并记录平板生长情况，分析比较酵母生长的差异。
4.结果
本实施例在酵母中进行转基因验证实验，对Glyma.08g111100的功能进行验证，结果显示，转基因酵母耐盐碱单倍型(N：Hap2)在耐盐碱培养基中产生了耐盐碱能力；而转基因酵母敏感单倍型(M：Hap1)在耐盐碱培养基中未产生耐盐碱能力(图6)。
综上所述，以上实验结果充分说明，Glyma.08g111100基因的突变类型可以影响大豆芽期的耐盐碱能力，Hap2单倍型的大豆植株具有更强的耐盐碱能力。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种大豆耐盐碱性相关基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用，其特征在于，所述Glyma.08g111100基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列存在SNP1-SNP7共7个SNP位点，所述SNP1-SNP7依次位于136bp、291bp、575bp、644bp、1272bp、1638bp和1639bp碱基处，当所述SNP1-SNP7的单倍型为TTACGCA时，提示大豆芽期耐盐碱性高。
3.一种SNP位点组合在鉴定大豆耐盐碱性中的应用，其特征在于，所述SNP位点组合共7个SNP位点，位于核苷酸如SEQ ID NO.1所示的基因上，SNP1-SNP7依次位于136bp、291bp、575bp、644bp、1272bp、1638bp和1639bp碱基处，当所述SNP1-SNP7的单倍型为TTACGCA时，提示大豆芽期耐盐碱性高。
4.一种鉴定大豆芽期耐盐碱性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取得到待检大豆样品的总RNA，反转录得到cDNA；
以所述cDNA为模板扩增得到包含权利要求3所述的SNP位点组合的DNA片段；
对所述DNA片段进行测序，当权利要求3所述的SNP1-SNP7的单倍型为TTACGCA时，提示所述待检大豆样品的芽期耐盐碱性高。
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