CN113481316A - 玉米抗旱标记dresh8及其应用 - Google Patents

玉米抗旱标记dresh8及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113481316A
CN113481316A CN202110801680.7A CN202110801680A CN113481316A CN 113481316 A CN113481316 A CN 113481316A CN 202110801680 A CN202110801680 A CN 202110801680A CN 113481316 A CN113481316 A CN 113481316A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dresh8
drought
corn
marker
resistant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110801680.7A
Other languages
English (en)
Inventor
代明球
孙霄鹏
向艳丽
豆楠楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN202110801680.7A priority Critical patent/CN113481316A/zh
Publication of CN113481316A publication Critical patent/CN113481316A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种玉米抗旱标记DRESH8及其应用，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。所述抗旱标记DRESH8在玉米自交系B73的物理位置为8号染色体的139987478至140008873区间。本发明通过eQTL发现在玉米中存在一个长约21kb的反向重复序列，当它存在时会显著降低植物的抗旱性，通过深入的生信分析以及分子机制研究发现，该位点是由于产生大量的sRNA靶标降解下游抗旱基因导致的。这一研究发现DRESH8作为一个显著的玉米干旱分子标记，对推动玉米抗旱育种进程具有重要的理论和实践意义。

Description

玉米抗旱标记DRESH8及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种玉米抗旱标记DRESH8及其应用。
背景技术
玉米是我国主要粮食作物之一，多种植于我国的干旱和半干旱地区。近年来极端气候频发，玉米主要产区常出现大面积干旱造成严重的减产，制约我国农业发展，威胁农民利益和国家粮食安全。通过分子生物学手段解析玉米抗旱机理，利用遗传学手段进行玉米品种的培育和改良，可以提高玉米的耐旱性，保证干旱胁迫下玉米的稳产和高产。
植物营固着生长无法规避不利环境，因此在进化过程中产生了复杂的环境应答机制。植物可以通过感受脱落酸等信号分子，调节体内干旱应答转录因子的表达水平，进而调控下游基因参与干旱应答。植物中存在大量的单链小RNA(sRNA)分子，大量研究表明这些sRNA广泛参与到植物的干旱应答过程中。如sRNA中的miR169可以调控NF-YA基因的表达水平影响植物的耐旱性，在水稻中过量表达os-miR408可以提高植株的抗旱性，同时研究表明sRNA还广泛参与植物的生长发育及开花结实。反向重复序列是产生sRNA的主要结构之一，因此反向重复序列在植物抗旱育种的培育中有着潜在的应用价值。
玉米的产量其生产关系到国家粮食安全和社会稳定。干旱是影响玉米生长发育的主要逆境因素，提升玉米的抗旱性是玉米育种迫切需要解决的问题，因此筛选干旱相关基因分子标记的可以有效提高选育抗旱玉米品种的效率
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供了一种玉米抗旱标记DRESH8其应用，及该标记主要包含长度约20Kb的反向重复片段。该标记的存在将显著降低玉米植株的抗旱性，其作用机制为通过产生大量siRNA，介导干旱应答相关的靶标基因的表达水平，进而参与干旱应答。
为实现上述目的，本发明所设计一种玉米抗旱标记DRESH8，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。
上述DRESH8全长为21395bp的DNA序列；应当明确的是，DRESH8区间可以形成大量sRNA，本领域技术人员有能力根据本发明说明书公开文本中的内容判断DRESH8位点及产生sRNA表达水平对玉米抗旱能力强弱的影响，因此该判断方法并不仅限于PCR方法，还包括其他的针对该位点产生sRNA表达水平的检测方法等。
进一步地，所述抗旱标记DRESH8在玉米自交系B73的物理位置为8号染色体的139987478至140008873区间。
本发明还提供了一种上述玉米抗旱标记DRESH8在改良玉米抗旱性和辅助育种中的应用。
本发明还提供了一种引物对在鉴定抗旱玉米品种中的应用，所述引物对：
F1：5’-CTGTTCTCATGTTCTGTAGCATGG-3’，
R1：5’-AATCCAAGTGTGGCACAAGAAC-3’；
F2：5’-TGTTAGCTGGCTCTGAGCAAGAAC-3’，
R2：5’-ACCCTCGTCGCACAACGACC-3’。
本发明还提供了一种鉴定抗旱玉米品种的方法，包括以下步骤：
1)提取待检测玉米品种的DNA；
2)设计两对引物对，引物对如下：
F1：5’-CTGTTCTCATGTTCTGTAGCATGG-3’，
R1：5’-AATCCAAGTGTGGCACAAGAAC-3’；
F2：5’-TGTTAGCTGGCTCTGAGCAAGAAC-3’，
R2：5’-ACCCTCGTCGCACAACGACC-3’；
3)以上述DNA为模板进行PCR扩增；
4)电泳：
当一对引物F1物R1扩增出现目的条带，且一对引物F2和R2无法扩增出目的条带时，说明该玉米品种不含标记DRESH8，说明该品种抗旱性强；
或者，当一对引物F1物R1无法扩增出目的条带，且一对引物F2和R2引物扩增出现目的条带时，说明该玉米品种含有标记DRESH8，则说明该品种抗旱性弱。
本发明的有益效果：
本发明通过eQTL发现在玉米中存在一个长约21kb的反向重复序列，当它存在时会显著降低植物在逆境下的抗旱性，通过深入的生信分析以及分子机制研究发现，该位点是由于产生大量的small RNA(sRNA)靶标降解下游抗旱基因导致的。这一研究发现DRESH8作为一个显著的玉米干旱分子标记，对推动玉米抗旱育种进程具有重要的理论和实践意义。
附图说明
图1为玉米CRISPR-dDRESH8载体pCPB-ZmUbi-hspCas9构建示意图(通用载体图谱，无中文注释)；
图2为CRISPR-dDRESH8敲除玉米株系基因型鉴定图；
图3为dDRESH8材料的抗旱性检测；
图4为检测DRESH8位点对sRNA表达水平的影响；
图5为DRESH8-sRNA通过转录后水平基因沉默调控干旱应答基因ZmMYBR38的表达；
图6为关联群体及F2群体中DRESH8位点的基因型鉴定；
图7为关联群体及F2群体中DRESH8位点的自然变异影响玉米的抗旱性。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
对玉米关联群体自交系在干旱和对照下的small RNA测序数据进行分析，发现位于八号染色体140Mb区间处(在玉米自交系B73的物理位置为8号染色体的139987478至140008873区间)存在一个与大量干旱应答small RNA表达水平显著相关的eQTL热点区间，将该区间命名为抗旱标记DRESH8，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2玉米Crispr-dDRESH8载体构建
以pCPB-ZmUbi-hspCas9载体为基础，通过同源重组将U6启动子，gRNA和sgRNA骨架通过重叠PCR所得的片段插入pCPB-ZmUbi-hspCas9载体中(图1)。电泳检测及测序分析表明我们成功得到了玉米Crispr-dDRESH8载体，具体实验步骤如下：
1.U61启动子扩增
根据U6启动子序列设计一对引物进行PCR扩增，引物序列如下：
U6-F：5’-TGCACTGCACAAGCTGCTGTTTTTGTTAGCCCCATCG-3’，
U6-R：5’-AATTCGGTGCTTGCGGCTC-3’；
使用Vazyme Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase进行基因扩增，得到U6启动子序列，其反应体系如下(总体积20ul)：
2x phanta Buffer 10ul
dNTP 0.4ul
U6-F 0.8ul
U6-R 0.8ul
Phanta max 0.4u
Backbone 1.5ul
ddH<sub>2</sub>O 6.9ul
注：Backbone为同时含有U6启动子序列和sgRNA序列的模板质粒(来源于网上已公开论文,DOI:10.1105/tpc.19.00934)。
2.gRNA-sgRNA的扩增
gRNA1-F：5’-GAACATGGTAATTGTAAACGA-3’，
gRNA2-F：5’-GCTTGCAGGAACCATGCCATG-3’，
gRR1：5’-GGCCAGTGCCAAGCTTAAAAAAAGCACCGACTCG-3’；
使用Vazyme Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase进行基因扩增，得到连有sgRNA骨架的gRNA序列即gRNA-sgRNA，其反应体系如下(总体积20ul)：
2x phanta Buffer 10ul
dNTP 0.4ul
gRNA1-F/gRNA2-F 0.8ul
gRR1 0.8ul
Phanta max 0.4ul
Backbone 1.5ul
ddH<sub>2</sub>O 6.9ul
3.重叠PCR获得U6启动子、gRNA-sgRNA
使用Vazyme Phanta Max Super-Fidelity DNA polymerase进行基因扩增，得到含有U6启动子的gRNA-sgRNA序列即U6-gRNA1-sgRNA和U6-gRNA2-sgRNA，其反应体系如下(总体积20ul)：
2x phanta Buffer 10ul
dNTP 0.4ul
gRNA1-F/gRNA2-F 0.8ul
gRR1 0.8ul
Phanta max 0.4ul
模板一(U6启动子) 1.5ul
模板二(gRNA-sgRNA) 1.5ul
ddH<sub>2</sub>O 5.4ul
反应程序为：95℃3min；95℃15s；60℃30s；72℃60s；72℃5min；35循环。
4.线性化载体制备：使用限制性内切酶HindIII单酶切pCPB-ZmUbi-hspCas9载体，使环状载体线性化；
5.U6-gRNA1-sgRNA和U6-gRNA2-sgRNA与载体酶切产物的检测与回收：琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物与载体酶切产物，使用Omega Bio-tek Gel Extraction Kit回收目的片段；
6.胶回收产物重组：使用Vazyme ClonExpress II One Step Cloning Kit进行同源重组，反应体系如下：
线性化载体 200ng
插入片段 24ng
5x CE II buffer 4ul
Exnase II 2ul
ddH<sub>2</sub>O to 20ul
使用移液器轻轻吸打混匀，经短暂离心后将反应液收集至离心管管底；37℃水浴30min，放置冰上静置至室温；
7.重组产物转化：重组产物转化DH5α感受态细胞，参照分子克隆实验指南；
8.测序鉴定：经菌落PCR，质粒PCR,测序分析表明得到了连有gRNA1的中间载体；
9.重复步骤6至步骤8，进一步连接U6-gRNA2-sgRNA至中间载体，得到最终载体，即为Crispr-dDRESH8载体。检测涉及PCR及测序引物为：
CAS9-F：5’-AGATAAACTGCACTTCAAACAAGT-3’，
CAS9-R：5’-ATTAAGTTGGGTAACGCCAGG-3’。
实施例2：CRISPR-dDRESH8敲除玉米株系获得及检测
将实施例1构好的玉米Crispr-dDRESH8载体送至江苏未米生物科技有限公司转化，转化用背景自交系材料为B104，获得的T0代及后代植株进行基因型鉴定，筛选得到DRESH8位点被敲除的纯合子(即为dDRESH8植株)(图2)；其中，鉴定引物及反应体系如下：
F1：5’-CTGTTCTCATGTTCTGTAGCATGG-3’，
R1：5’-AATCCAAGTGTGGCACAAGAAC-3’；
F2：5’-TGTTAGCTGGCTCTGAGCAAGAAC-3’，
R2：5’-ACCCTCGTCGCACAACGACC-3’；
PCR体积15ul：
DNA 100ng
2Xtaq 7.5ul
F1/F2 0.3ul
R1/R2 0.3ul
Add ddH<sub>2</sub>O t o15ul
反应程序为：95℃3min；95℃15s；57℃30s；72℃60s；72℃5min；35循环。
实施例3 CRISPR-dDRESH8玉米材料的抗旱表型检测
将dDRESH8植株和野生型玉米材料同时种植在30cm×40cm×15cm规格的方盒中，左右对半种植。植株生长于温度为28℃的温室中，在正常状态下生长至四叶期时停止浇水进行干旱处理。干旱处理10天后植物呈现明显的萎蔫状态时进行复水，复水7天后统计每个方盒中阳性转基因材料和阴性分离材料的植株存活率。
结果表明：dDRESH8植株存活率显著高于阴性分离材料，说明DRESH8位点敲除的材料具有更强的抵抗干旱胁迫能力(图3)。
实施例4关联群体及CRISPR-dDRESH8玉米植株中sRNA表达量检测
通过在关联群体中检测不同自交系在DRESH8位点处的基因型，根据基因型将自交系分为包含DRESH8序列的自交系DRESH8(+)和不包含DRESH8(-)的自交系。比较DRESH8(+)和DRESH8(-)自交系间的sRNA表达水平，
结果显示dDRESH8材料中比对至DRESH8区间内的sRNA表达水平显著降低(图4)。
分别在花盆中种植dDRESH8植株及野生型玉米材料，三叶期前对照和干旱组材料均正常浇水，三叶期后对照组正常浇水，干旱组停止浇水。等干旱组的dDRESH8和野生型材料出现明显萎蔫时对干旱和对照组同时取样，取样部位为最上展开叶。利用TRIZOL法对样品总RNA进行提取，并交由华大公司进行sRNA测序。比较dDRESH8和野生型材料中比对至DRESH8区间内sRNA的表达水平，结果表明野生型材料中比对至该区间的sRNA在干旱处理下的表达水平显著高于对照组，而dDRESH8材料中比对至DRESH8区间内sRNA的表达水平在干旱和对照下均显著低于野生型。
以上结果表明DRESH8是玉米中一个产生sRNA的重要位点。
实施例5 DRESH8-sRNA对干旱应答基因ZmMYBR38的调控
利用网站预测DRESH8-sRNA的潜在靶标基因序列，并通过5’-RACE实验验证DRESH8-sRNA对靶标基因的调控功能，5’-RACE的操作步骤如下：
通过重叠PCR将sRNA整合到miR172骨架序列中，将整个片段通过同源重组的方法构建到pHTLIC1.0载体上，过表达sRNA。sRNA的靶标序列直接合成并在5’端和3’端分别加上XhoI和XbaI酶切位点通过酶切酶连的方式将靶标序列插入到含有GFP的pMS4载体上，插入的靶标序列位于GFP的5’端。然后将相关质粒转入GV3101中，注射烟草后弱光条件下培养48小时，剪取烟草叶片用Trizol法抽提总RNA。随后总RNA用Oligo d(T)25磁珠(New EnglandBiolabs)进行mRNA富集，再利用T4 RNA连接酶(New England Biolabs)将特异性的接头添加到mRNA的5’端。以此mRNA为模板利用M-MLV反转录酶合成cDNA，反转录所用的引物通过重叠PCR扩增目的片段。用T4 DNA连接酶将测序接头连接到PCR产物的5’端和3’端。通过PCR扩增对以上PCR产物进行富，跑胶，切割条带在200bp-500bp范围内的片段，送至诺禾致源进行测序。
5’-RACE的结果表明：DRESH8-sRNA可以通过转录后水平基因沉默途径调控干旱应答基因ZmMYBR38的表达水平，同时通过qPCR测定dDRESH8和野生型材料中ZmMYBR38的表达水平，发现dDRESH8材料中ZmMYBR38的表达量相较于野生型显著上升也进一步证实了这一点(图5)。
实施例6玉米DRESH8标记的基因型鉴定
参照实施例2中给出的两队引物F1、R1和F2、R2，分别对玉米基因组DNA进行扩增。若玉米为包含DRESH8标记的材料，F2和R2扩增到特异条带，F1和R1不会扩增到特异条带。若玉米为不含DRESH8的纯合基因型材料，F2和R2不会扩增出特异条带，F1和R1会扩增到特异条带。若DRESH8区间为杂合状态，则F1和R1，F2和R2均能扩增出特异条带(图6)。
使用引物信息如下：
F1：5’-CTGTTCTCATGTTCTGTAGCATGG-3’，
R1：5’-AATCCAAGTGTGGCACAAGAAC-3’；
F2：5’-TGTTAGCTGGCTCTGAGCAAGAAC-3’，
R2：5’-ACCCTCGTCGCACAACGACC-3’；
实施例7 DRESH8标记玉米材料的抗旱表型检测
通过在关联群体中检测不同自交系在DRESH8位点处的基因型，根据基因型将自交系分为包含DRESH8序列的自交系DRESH8(+)和不包含DRESH8(-)的自交系。比较DRESH8(+)和DRESH8(-)自交系间的存活率差异表明包含DRESH8的自交系存活率。
利用包含DRESH8位点的自交系CIMBL144同不包含DRESH8位点的自交系CIMBL70，CIMBL17分别进行杂交，并将得到的杂交F1材料进一步自交得到F2材料，对F2材料在干旱复水后的存活率进行统计；
结果表明：不含有DRESH8标记的材料存活率显著高于包含DRESH8位点的材料，说明DRESH8位点可以作为标记用于玉米材料抗旱性的选择(图7)。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 玉米抗旱标记DRESH8及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21396
<212> DNA
<213> 玉米(Zea may L)
<400> 1
tgttggggac ttgttctcaa atgctaagaa ttaagaacaa ggcaacataa aaagtgttaa 60
acgttaaagt ccttcgtcct tcgaagcatt atgtcccttc gggaaataat gagtttcgga 120
cgaaggtcat aagagacgta ccttcgtaaa cataacaagt gatgacgaag gatttatata 180
aagcatgaaa tataatataa gcatcatcat aaaatcattt ctattttatt aacatggaaa 240
aatagaaatg atttcaaatt acaaatgtac cttcggtcct gagagaaggt agatagtaca 300
ggcgttgtgc aaaagcaaaa tgccaagtca gcgtgaacag tacgggggta ctgttcatct 360
atttatagac acaggacgca gcctgtgacg aattacaatt atgcccttta caaaagttta 420
caacattatg ttagacttct atggataaaa aggtcattct gcctctatgt cggtttaaaa 480
cgccgaagct ccatgaaaag ggaccttcgg ccatctctta gaaacgactt tggccgaagc 540
tgcttcttcg tgtgagacct tcggcgtacc gaagcacgac cccaacagta gcccctttcg 600
cggtgctaga tcgttcttcg taacgagctt ggcccgtgaa aaaaaacctc ttcagcttcg 660
ggaagccgaa ggtccaaaaa acaccttccc tgagctcgtt gcggagaaac gatccgactt 720
ccgagcgcgt gccaagccca ctttgtagag ttactgtttg gtctttgcgg tccactgcac 780
agcgggtatg agttactgcg cgcctggtgt aacagttcca ccgcttcgcc ttcctacctg 840
cagcactata taaacaaaca ggtgggtgtg aagttaccac agcattcatt gctatttgca 900
ctgtttcgct gccaaaattt ttcaccatag ccgaagctta agtctcagaa tcgaacgaag 960
gtgcttctca acgtccgctt cgtcagaaag aagagcttcg gagaaaagaa aaaaggaaaa 1020
agtttttgac ttcccaaact tagaatcaaa tggcgagaat acgatctact gccaaagttg 1080
tacgtgaggg agacgaagcc gaaggttcag acactgtgcc catctccgaa gcaatgcagc 1140
gttccggtct actgactaca gaagaaatgc ctgctgctga agcagaccca acaactgccg 1200
aaggaaaaga aaacattgaa gggactgact ccgaagatga ctatcacctt gctatgccca 1260
gcaagcccag tcacttggat tttgggaaat caactgtttc aaaagctgac ctttcgaaga 1320
tggtgaaagc aggttatttc aatgaggacc agaagaagct actccgcttc ggggaagaag 1380
aaaccacccc gaagccaagg aaggatgaga ttgttatttt caagagtttt ttaaaagccg 1440
ggcttagatt ccctctccac gatattgttg cggagatact aaggaggttt ggtatctact 1500
ttcatcaatt gactcctaac gccatcgtta ggctcaatgt ttatatctgg gccctccgaa 1560
gccaagctgt ggaaccattt gctgacagct tctgccgagc tcacgaatta cattaccaaa 1620
caaaggccag aaaagatggg ctacatgata atttcggttg ctataatttt gcctaccgga 1680
agacaacaaa gtgtcctgtc atcagctacc gaagcaaatg gccagcaggt tggaaatctg 1740
agtggtttta tgtaaaagtc gatgaagaca aagaaaaatt ggtacaaagc cctctggagt 1800
taatcttcgg agagacaagg ccacaatgcc acattggcga cctaaaaggt cccacctggg 1860
ctgctctggg tgaatttgaa attatctcag aacatattgg caccagggat ctagttcaag 1920
agttcttggc attcagagtt ttccctactc taaaagagtg ggagatgccg aagctggagg 1980
gagagaagaa gaagggggag cttgtccggc ttccctatta cttcaagttc aagaagttct 2040
tcaaaaaacc ctgcaaagaa tggttagaca ctgttgaggt gatgtgcaac gaaatcctgg 2100
ggaattactc caaaaaagag gatcaactaa tgacagcagc cttcggtgcc cgaccgaaac 2160
gaaggctgaa ccgagtgttc gacgccctag gcttcgaata cccagactac gaacaattga 2220
acaagggcgc cgagggcctc aaaagaaaaa gagtagccga agctctgatc agagacgaag 2280
aaataccagc aaaggagaag aaagttctca agaaaagaaa aatatctgct ccgaagcgca 2340
aatcacccga agaagaggag acccccacac cgccttctac cagcgacgtg gaggaaattt 2400
taaaggtaat gactgaaccc atgcctacga agctaagtcc actagggctc caactgacga 2460
agctttttga aaaggtggac gagccggatc aaccgaagat aaacaaaccc aaacggcaaa 2520
gaattattgc ggtaactgag gttatcgaca aaactccacc taggttgtca attcagaaaa 2580
cggcagctgc tgaaggtaga gcttcggaag tcgcggctac cgaagctgcc acacccgaag 2640
atgtaaattt agaaactact cttgaaaata ttgacaaaat tttgacggaa aacattgaag 2700
aagctgccac cgttactgaa gaaatcctgg ccacagtgcc agggaaaggg aaagaaatag 2760
tcgaagaaac tccagacgac gaagcctatt ctttccagaa tttaattggg cagaaactga 2820
cgaaggacga aatagaagaa ctcaaagact atgccaaatc ttgcggctac aagccaggag 2880
cccttctatt tgggggtgta gatgatgaaa aactaggctg tattcgagac cagactggag 2940
ctaaggtaat ctgtactcta tcgaagagta tcggttttcc gaagttagag acagacatca 3000
gccgctaccg acgacaacat atcgtcggca gcttgtttta ttctaacttc aaggtaaaca 3060
acctttttct ctggttttta ttgccgttaa caatgaaaat attacttaac ataagttgtt 3120
tctgttcaga gcatgctact gagcaaagct ctgaagatgc aacaagactt ggaggacaaa 3180
aagcacgaag ctataattga aaacttggaa aacaaaataa aagagcaatc tgccatcatt 3240
gaaaagaaag acttcgagct ccaatcgacc gaaggcttgc tggctgaaac tgaggctaaa 3300
atattagagt taaattcgaa gcttatcaat caatcaaaac aatttgatca ggagaagcta 3360
gaactgaatt cgaagcttaa agccgaagtc cagaccagct cagaattgaa gaaagcatta 3420
ataagccttc aagacaaatg cttgaacttt ggcaataatt gtattggacg attaaagaag 3480
atattttact ctgttggagc cagcagtggg aaatttaacc cttcggcgga aaatttaccc 3540
caggccttcg atcatattga agctgaaatc gaagagcttg acgaagttat agccgggcac 3600
ggcgacttct gtgcctgggt agcctctcgg ggtaccgctg ctgcatttct gaaggccggc 3660
tgcgaacatg gaaaggttgt caacaggccc aacttcacct tatcttcatc aatcctggat 3720
gatatgcccg acctcgaccg aagtatctcc aatagattta taaaaatggt atggacaaag 3780
ggcgggcgag agaaagctgg agacgaagcc cgaagtcatc ttgaaccagt aagaaatgac 3840
atttcgtgct taccttttcc tttgggcttg attcttatga ttccttgact catgtaggat 3900
gacgaaggtg aagatgatgc ctaggatatg tcgccgaagt tgtcgtcgaa gctgaagctt 3960
aatgaagact agcagaagtg tgctttagaa aaactcagga taattttgta acaactcttg 4020
taaatagaat taaactgttc ttcaaggaac tttgtacata ccttgtaata tattcttacc 4080
cttcgattga ggtgctttga tgtggacgaa atcagttttt tgagccgaag gcgaaaaaac 4140
accttccctt cttttcgtac acaacgaagc ataaaaggcc gcttcctctt tttgccgaag 4200
cctttcctta cataacaaaa cataaaagac tgctactctt atctgccgaa gcttttattt 4260
acataacaaa acataaaaga ctgctactct tatctgccga agcttttatt tacataacaa 4320
aacataaaag actgctactc ttatacacaa cgattcataa aaaaccactt cttcgaaacc 4380
tttcttttac ataacgaatc ataacaaacc atttatccga aacttttctc tgtgccgaag 4440
caaccattta ggaacacaaa tgctatgaat gaatgcttat gcatgcaaat gccatgatgt 4500
aatgtgcaaa tgaatgtccg aagcgtatgt ccgaagccac actcatccat cattttctta 4560
ggagcaaaca cacgtcagct ctgcattccc ttaggaacga ctttggagca tctttgcctt 4620
ttacttaggc agtatcagcg ttgacttttc gctgtaagct ctgcatcccc ctagggacgt 4680
ctttggagct tcttcgtctt ttacttagac ggtataagct ctgcattccc ttaggaacga 4740
ctttggagct tcttcgcctt ttactttcgg cggaatcagc gttgactttt cgctgtgagc 4800
tctgcatccc cttagggacg tctttggagc ttcttctctt ttttagtttc ggcactcgat 4860
ggtgcgctct cagcttttac atttacattc tttgggggat tttgctctta taaaactaaa 4920
aaggaaatta cataagatgg ccccattaaa aacctttctc cccctttaga aaggaaaagg 4980
gtgccatgaa aaagaaaaga aaagtcaaaa ttacatcgag ttatacataa aaccgccgaa 5040
gctcatccgc attccaagat cttggaattt cattgccatc catgtccttc agtctgtacg 5100
aaccaggcct tgacgaagat gctactaaga aaggcccttc ccatttcagt tgcaatttgc 5160
ccactgtatc cggattggcc actctccgaa gcaccaagtg tcctggctca atatttttta 5220
gccggacctt tctatctcgc catttaactg tttcagcctg gtacttattg atattctcca 5280
cggcctgaag cctgatccct tctaaggcat ctttttccac gagacaagta tcttcgggac 5340
ctgattctgc cgaagctacc actcttattg atccagcttt ggcttcttcc ggggttattg 5400
cttcgtcacc aaataacaac ttaaatgggg taaagcctgt agatcttgat gttgttgtgt 5460
tatggctcca taccactttg gtaagctgat ctggccactt tccccttggt tgattaaaga 5520
ttagcttcat tattcctgtc attatgatgc cgttggccct ttcaacaagc ccattcgact 5580
ccgggtgcct gactgacgca aagtggatct tcgtgccaat ttgatcacaa aaatttctga 5640
attcttcgga gtcaaattgt gttccattat ctacagttat agccttcggc actccgaagc 5700
gacagacaat attctgccag aaaaattttt ggatagtggc cgaagttatt gtagctaatg 5760
gcttcgcctc aatccacttg gaaaaatatt ccacagcaac tacaacatat ttcagattgc 5820
cttgagccgg tggtaatggg cccagcaaat cgaggcccca cctttgcaat ggccagatgg 5880
gttgtattag ctgtgtcaaa gatgaaggtt gtttttgatc tcttgcacat ttctgacaac 5940
cttcgcactt ttgaactaac tcagctgcat ccgaagctgc cttcggccaa taaaatcctt 6000
gacggaacac ttttccaagt aacggcctgg atccgatgtg ggatccacaa aggcctgcat 6060
gtatctcctt catcaactct ataccttcgg ctctagacaa gcacttgagc agcggggcac 6120
aaactccatg cttgtataac tccccttcta taatgatata cggacgagct cttgcctcta 6180
ttcttttatt ataagcttcg tcatctgata ggaagttgcc ctgaaggtaa gaaattattt 6240
cagttctcca atcttcactg tacacaggag aaatagtaag aactgctctt tcaagtaact 6300
ccactgaagg tgcctttatt gtttcgaaga atacatccga aggtagcggc agcccctgtg 6360
ctgcagacct ggctaacaaa tcagcatgtt cattttgccc tcgagggata ttcttaacag 6420
aaaatccttc gaaggaagct tcgatccttc ggactgtgtc taggtatttt tcaagcttcg 6480
ggtctttagc cttgcaactt ttgtcaatat gacccgaaac aatctgagaa tcagttttaa 6540
ggatcgccct cctgatcccc atcgccttta gtttccgaag acccaggagc aaggcttcgt 6600
actcagcaat attatttgtg cagctgaagt ccagtcttgc tgcatagcaa gttttaacct 6660
cggacggtga aaccaaaaca gcagctgctc ctgctccgaa ggttccccag gagccatcac 6720
aaaacactgt ccatgcttcg gcatctttat tcgcttcttc gccctgagcc cctggcgtcc 6780
agtcggcaat aaaatctgcc aatgcttgag actggatcga ggatctgtgc acataatcaa 6840
tgtaaaattc attaagctcc gcagcccatt ttccaattcg gccagtagct tctttatttc 6900
tcatgatatc tttcaacggc tgcgaagaag gaacaataat attatatgcc tgaaaataat 6960
gccgaagctt cctggatgcc attagaacgg catacaacac cttctccagt tctgtataat 7020
ttttctttga gacactaagg acctcagata caaaatatac tgtgacctgc ttcttgattt 7080
gtccatcaaa cttctcctgc acaagtgccg cacttactgc tgagtgcgaa gctgccacat 7140
acaacaacag aggagcccct ggcattggtg gagttaatgt tgttagatct atcaggtatt 7200
gcttgagttc ttcgaaagct ttttgttgag ctgggcccca ttgaaagact tcagctgatt 7260
ttagcacctc gaagaagggt agatttcttt ccgctgatct ggatataatt ggggacttgt 7320
tctcaaatgc taagaattaa gaacaaggca acataaaaag tgttaaacgt taaagtcctt 7380
cgtccttcga agcattatgt cccttcggga aataatgagt ttcggacgaa ggtcataaga 7440
gacgtacctt cgtaaacata acaagtgatg acgaaggatt tatataaagc atgaaatata 7500
atataagcat catcataaaa tcatttctat tttattaaca tggaaaaata gaaatgattt 7560
caaattacaa atgtaccttc ggtcctgaga gaaggtagat agtacaggcg ttgtgcaaaa 7620
gcaaaatgcc aagtcagcgt gaacagtacg ggggtactgt tcatctattt atagacacag 7680
gacgcagcct gtgacgaatt acaattatgc cctttacaaa agtttacaac attatgttag 7740
acttctatgg ataaaaaggt cattctgcct ctatgtcggt ttaaaacgcc gaagctccat 7800
gaaaagggac cttcggccat ctcttagaaa cgactttggc cgaagctgct tcttcgtgtg 7860
agaccttcgg cgtaccgaag cacgacccca acagctgctt cggcttcgaa gctggtgctc 7920
ccgataacag gcggttcttg ctcagagcca gctaacaaaa agcagaagaa ggaggctcag 7980
agaagggtgc agcatgttgg agtgcaggga cccttcatta agtcaaaatg gtctcacatt 8040
ccaattacct tctctcagga agatcttcag ctcaaggact atcctcacaa tgatgctatg 8100
gtcatttctt gtgtgatcaa agggtttctg gttcacaatg tcctagttga cacaggcagt 8160
gcagctgaca ttatatttgc caaagccttc agacagatgc aagagcctga agacaagatt 8220
catgatgcta cgcaccctct ttgtggcttc ggagggcggc agattgtggc actcgggaag 8280
attaccatgc cggtaacctt cggatttgtt aataacacaa ggactgagca aattgtgttt 8340
gatattgttg acatggaata cccctacaac gccatcattg gtcgtggtac cctaaatgct 8400
tttgaagcaa ttcttcaccc agcttatctc tgcatgaaga taccttcgga ccaagggcct 8460
attgctattc atgggagtca ggaagctgcc agaagggccg aaggaaactg gactgattcc 8520
aaggcaatcc ataatataga tggagttgaa gcttgtgaac agtacaagtt caggagggaa 8580
aaagcagctt cggctgatca gccgaagccc atgctgctgt gtgaagatat agcagagcag 8640
aaggtgctat tgggctcgca attatctgaa gatcaagaga aaaccttgat aaggttttta 8700
ttcaacaata aagatgtttt tgcatggtca gccaatgatc tttgtggagt gaatcgggat 8760
gttattgaac attcgctcaa tgttgaccca tccttcagac cccgcaagca gaggcttcgg 8820
aaaatgtctg atgacaaggc cgaaggggct cgcaacgaag taaaaagact cttaagtgca 8880
ggagttatca gagaagtgaa gtatccagaa tggctagcta acactgttat ggtgaagaag 8940
gccaatggaa agtggagaat gtgtattgat ttcacagatc tcaacaaggc ttgtccgaag 9000
gatgagttcc cgctgccaag gatagactct ttagttgatg cagcagcttc ttcggaactc 9060
atgagtctcc tggattgtta ctcaggctat catcaaatct ggatgaaaaa ggaggatgag 9120
ccgaagacta gtttcataac cccaagtggt acatattgct atcttcggat gcctgagggg 9180
cttaagaatg ctggagggag tttcagcagg atgactgcga aggttctcca atctcagata 9240
ggcagaaatg tgttgaccta tgttgatgac attattgtaa aaagcacgaa gcaagaagac 9300
catattgctg atctgcagga gaccttcgcc agcttcagac aagctggtct gaagctgaat 9360
ccagaaaaat gtgtcttcgg agtaaagaag ggtaagttcc ttggatgctt ggtttcaaca 9420
aagggaattg aagctaatcc aaataaaatc gaagctatac ttcgaatgga gccaccaacc 9480
acaagaaagg gggcccaaag attgacagga agactgtaca gtgaagattg gagaactgaa 9540
ataatttctg ttggggactt gttctcaaat gctaagaatt aagaacaagg caacataaaa 9600
agtgttaaac gttaaagtcc ttcgtccttc gaagcattat gtcccttcgg gaaataatga 9660
gtttcggacg aaggtcataa gagacgtacc ttcgtaaaca taacaagtga tgacgaagga 9720
tttatataaa gcatgaaata taatataagc atcatcataa aatcatttct attttattaa 9780
catggaaaaa tagaaatgat ttcaaattac aaatgtacct tcggtcctga gagaaggtag 9840
atagtacagg cgttgtgcaa aagcaaaatg ccaagtcagc gtgaacagta cgggggtact 9900
gttcatctat ttatagacac aggacgcagc ctgtgacgaa ttacaattat gccctttaca 9960
aaagtttaca acattatgtt agacttctat ggataaaaag gtcattctgc ctctatgtcg 10020
gtttaaaacg ccgaagctcc atgaaaaggg accttcggcc atctcttaga aacgactttg 10080
gccgaagctg cttcttcgtg tgagaccttc ggcgtaccga agcacgaccc caacagctgc 10140
ttcggcttcg aagctggtgc tcccgataac aggcggttct tgctcagagc cagctaacaa 10200
aaagcagaag aaggaggctc agagaagggt gtagcatgtt ggagtgcagg gacccttcat 10260
taagtcaaaa tggtctcaca ttccaattac cttctctcag gaagatcttc agctcaagga 10320
ctatcctcac aatgatgcta tggtcatttc ttgtgtgatc aaagggtttc tggttcacaa 10380
tgtcctagtt gacacaggca gtgcagctga cattatattt gccaaagcct tcagacagat 10440
gcaagagcct gaagacaaga ttcatgatgc tacgcaccct ctttgtggct tcggagggcg 10500
gcagattgtg gcactcggga agattaccat gccggtaacc ttcggatttg ttaataacac 10560
aaggactgag caaattgtgt ttgatattgt tgacatggaa tacccctaca acgccatcat 10620
tggtcgtggt accctaaatg cttttgaagc aattcttcac ccagcttatc tctgcatgaa 10680
gataccttcg gaccaagggc ctattgctat tcatgggagt caggaagctg ccagaagggc 10740
cgaaggaaac tggactgatt ccaaggcaat ccataatata gatggagttg aagcttgtga 10800
acagtacaag ttcaggaggg aaaaagcagc ttcggctgat cagccgaagc ccatgctgct 10860
gtgtgaagat atagcagagc agaaggtgct attgggctcg caattatctg aagatcaaga 10920
gaaaaccttg ataaggtttt tattcaacaa taaagatgtt tttgcatggt cagccaatga 10980
tctttgtgga gtgaatcggg atgttattga acattcgctc aatgttgacc catccttcag 11040
accccgcaag cagaggcttc ggaaaatgtc tgatgacaag gccgaagggg ctcgcaacga 11100
agtaaaaaga ctcttaagtg caggagttat cagagaagtg aagtatccag aatggctagc 11160
taacactgtt atggtgaaga aggccaatgg aaagtggaga atgtgtattg atttcacaga 11220
tctcaacaag gcttgtccga aggatgagtt cccgctgcca aggatagact ctttagttga 11280
tgcagcagct tcttcggaac tcatgagtct cctggattgt tactcaggct atcatcaaat 11340
ctggatgaaa aaggaggatg agccgaagac tagtttcata accccaagtg gtacatattg 11400
ctatcttcgg atgcctgagg ggcttaagaa tgctggaggg agtttcagca ggatgactgc 11460
gaaggttctc caatctcaga taggcagaaa tgtgttgacc tatgttgatg acattattgt 11520
aaaaagcacg aagcaagaag accatattgc tgatctgcag gagaccttcg ccagcttcag 11580
acaagctggt ctgaagctga atccagaaaa atgtgtcttc ggagtaaaga agggtaagtt 11640
ccttggatgc ttggtttcaa caaagggaat tgaagctaat ccaaataaaa tcgaagctat 11700
acttcgaatg gagccaccaa ccacaagaaa gggggcccaa agattgacag gaagactggc 11760
atctcttaac agatttatat ccagatcagc ggaaagaaat ctacccttct tcgaggtgct 11820
aaaatcagct gaagtctttc aatggggccc agctcaacaa aaagctttcg aagaactcaa 11880
gcaatacctg atagatctaa caacattaac tccaccaatg ccaggggctc ctctgttgtt 11940
gtatgtggca gcttcgcact cagcagtaag tgcggcactt gtgcaggaga agtttgatgg 12000
acaaatcaag aagcaggtcc cagtatattt tgtatctgag gtccttagtg tctcaaagaa 12060
aaattataca gaactggaga aggtgttgta tgccgttcta atggcatcca ggaagcttcg 12120
gcattatttt caggcatata atattattgt tccttcttcg cagccgttga aagatatcat 12180
gagaaataaa gaagctactg gccgaattgg aaaatgggct gcggagctta atgaatttta 12240
cattgattat gtgcacagat cctcgatcca gtctcaagca ttggcagatt ttattgccga 12300
ctggacgcca ggggctcagg gcgaagaagc gaataaagat gccgaagcat ggacagtgtt 12360
ttgtgatggc tcctggggaa ccttcggagc aggagcagct gctgttttgg tttcaccgtc 12420
cgaggttaaa acttgctatg cagcaagact ggacttcagc tgcacaaata atattgctga 12480
gtacgaagcc ttgctcctgg gtcttcggaa actaaaggcg atggggatca ggagggcgat 12540
ccttaaaact gattctcaga ttgtttcggg tcatattgac aaaagttgca aggctaaaga 12600
cccgaagctt gaaaaatacc tagacacagt ccgaaggatc gaagcttcct tcgaaggatt 12660
ttctgttaag aatatccctc gagggcaaaa tgaacatgct gatttgttag ccaggtctgc 12720
agcacagggg ctgccgctac cttcggatgt attcttcgaa acaataaagg caccttcagt 12780
ggagttactt gaaagagcag ttcttactat ttctcctgtg tacagtgaag attggagaac 12840
tgaaataatt tcttaccttc agggcaactt cctatcagat gacgaagctt ataataaaag 12900
aatagaggca agagctcgtc cgtatatcat tatagaaggg gagttataca agcatggagt 12960
ttgtgccccg ctgctcaagt gcttgtctag agccgaaggt atagagttga tgaaggagat 13020
acatgcaggc ctttgtggat cccacatcgg atccaggccg ttacttggaa aagtgttccg 13080
tcaaggattt tattggccga aggcagcttc ggatgcagct gagttagttc aaaagtgcga 13140
aggttgtcag aaatgtgcaa gagatcaaaa acaaccttca tctttgacac agctaataca 13200
acccatctgg ccattgcaaa ggtggggcct cgatttgctg ggcccattac caccggctca 13260
aggcaatctg aaatatgttg tagttgctgt ggaatatttt tccaagtgga ttgaggcgaa 13320
gccattagct acaataactt cggccactat ccaaaaattt ttctggcaga atattgtctg 13380
tcgcttcgga gtgccgaagg ctataactgt agataatgga acacaatttg actccgaaga 13440
attcagaaat ttttgtgatc aaattggcac gaagatccac tttgcgtcag tcaggcaccc 13500
ggagtcgaat gggcttgttg aaagggccaa cggcatcata atgacaggaa taatgaagct 13560
aatctttaat caaccaaggg gaaagtggcc agatcagctt accaaagtgg tatggagcca 13620
taacacaaca acatcaagat ctacaggctt taccccattt aagttgttat ttggtgacga 13680
agcaataacc ccggaagaag ccaaagctgg atcaataaga gtggtagctt cggcagaatc 13740
aggtcccgaa gatacttgtc tcgtggaaaa agatgcctta gaagggatca ggcttcaggc 13800
cgtggagaat atcaataagt accaggctga aacagttaaa tggcgagata gaaaggtccg 13860
gctaaaaaat attgagccag gacacttggt gcttcggaga gtggccaatc cggatacagt 13920
gggcaaattg caactgaaat gggaagggcc tttcttagta gcatcttcgt caaggcctgg 13980
ttcgtacaga ctgaaggaca tggatggcaa tgaaattcca agatcttgga atgcggatga 14040
gcttcggcgg ttttatgtat aactcgatgt aattttgact tttcttttct ttttcatggc 14100
acccttttcc tttctaaagg gggagaaagg tttttaatgg ggccatctta tgtaatttcc 14160
tttttagttt tataagagca aaatccccca aagaatgtaa atgtaaaagc tgagagcgca 14220
ccatcgagtg ccgaaactaa aaaagagaag aagctccaaa gacgtcccta aggggatgca 14280
gagctcacag cgaaaagtca acgctgattc cgccgaaagt aaaaggcgaa gaagctccaa 14340
agtcgttcct aagggaatgc agagcttata ccgtctaagt aaaagacgaa gaagctccaa 14400
agacgtccct agggggatgc agagcttaca gcgaaaagtc aacgctgata ctgcctaagt 14460
aaaaggcaaa gatgctccaa agtcgttcct aagggaatgc agagctgacg tgtgtttgct 14520
cctaagaaaa tgatggatga gtgtggcttc ggacatacgc ttcggacatt catttgcaca 14580
ttacatcatg gcatttgcat gcataagcat tcattcatag catttgtgtt cctaaatggt 14640
tgcttcggca cagagaaaag tttcggataa atggtttgtt atgattcgtt atgtaaaaga 14700
aaggtttcga agaagtggtt ttttatgaat cgttgtgtat aagagtagca gtcttttatg 14760
ttttgttatg taaataaaag cttcggcaga taagagtagc agtcttttat gttttgttat 14820
gtaaataaaa gcttcggcag ataagagtag cagtctttta tgttttgtta tgtaaggaaa 14880
ggcttcggca aaaagaggaa gcggcctttt atgcttcgtt gtgtacgaaa agaagggaag 14940
gtgttttttc gccttcggct caaaaaactg atttcgtcca catcaaagca cctcaatcga 15000
agggtaagaa tatattacaa ggtatgtaca aagttccttg aagaacagtt taattctatt 15060
tacaagagtt gttacaaaat tatcctgagt ttttctaaag cacacttctg ctagtcttca 15120
ttaagcttca gcttcgacga caacttcggc gacatatcct aggcatcatc ttcaccttcg 15180
tcatcctaca tgagtcaagg aatcataaga atcaagccca aaggaaaagg taagcacgaa 15240
atgtcatttc ttactggttc aagatgactt cgggcttcgt ctccagcttt ctctcgcccg 15300
ccctttgtcc ataccatttt tataaatcta ttggagatac ttcgggcgag gtcgggcata 15360
tcatccagga ttgatgaaga taaggtgaag ttgggcctgt tgacaacctt tccatgttcg 15420
cagccggcct tcagaaatgc agcagcggta ccccgagagg ctacccaggc acagaagtcg 15480
ccgtgcccga ctataacttc gtcaagctct tcgatttcag cttcaatatg atcgaaggcc 15540
tggggtaaat tttccgccga agggttaaat ttcccactgc tggctccaac agagtaaaat 15600
atcttcttta atcgtccaat acaattattg ccaaagttca agcatttgtc ttgaaggctt 15660
attaatgctt tcttcaattc tgagctggtc tggacttcgg ctttaagctt cgaattcagt 15720
tctagcttct cctgatcaaa ttgttttgat tgattgataa gcttcgaatt taactctaat 15780
attttagcct cagtttcagc cagcaagcct tcggtcgatt ggagctcgaa gtctttcttt 15840
tcaatgatgg cagattgctc ttttattttg ttttccaagt tttcaattat agcttcgtgc 15900
tttttgtcct ccaagtcttg ttgcatcttc agagctttgc tcagtagcat gctctgaaca 15960
gaaacaactt atgttaagta atattttcat tgttaacggc aataaaaacc agagaaaaag 16020
gttgtttacc ttgaagttag aataaaacaa gctgccgacg atatgttgtc gtcggtagcg 16080
gctgatgtct gtctctaact tcggaaaacc gatactcttc gatagagtac agattacctt 16140
agctccagtc tggtctcgaa tacagcctag tttttcatca tctacacccc caaatagaag 16200
ggctcctggc ttgtagccgc aagatttggc atagtctttg agttcttcta tttcgtcctt 16260
cgtcagtttc tgcccaatta aattctggaa agaataggct tcgtcgtctg gagtttcttc 16320
gactatttct ttccctttcc ctggcactgt ggccaggatt tcttcagtaa cggtggcagc 16380
ttcttcaatg ttttccgtca aaattttgtc aatattttca agagtagttt ctaaatttac 16440
atcttcgggt gtggcagctt cggtagccgc gacttccgaa gctctacctt cagcagctgc 16500
cgttttctga attgacaacc taggtggagt tttgtcgata acctcagtta ccgcaataat 16560
tctttgccgt ttgggtttgt ttatcttcgg ttgatccggc tcgtccacct tttcaaaaag 16620
cttcgtcagt tggagcccta gtggacttag cttcgtaggc atgggttcag tcattacctt 16680
taaaatttcc tccacgtcgc tggtagaagg cggtgtgggg gtctcctctt cttcgggtga 16740
tttgcgcttc ggagcagata tttttctttt cttgagaact ttcttctcct ttgctggtat 16800
ttcttcgtct ctgatcagag cttcggctac tctttttctt ttgaggccct cggcgccctt 16860
gttcaattgt tcgtagtctg ggtattcgaa gcctagggcg tcgaacactc ggttcagcct 16920
tcgtttcggt cgagcaccga aggctgctgt cattagttga tcctcttttt tggagtaatt 16980
ccccaggatt tcgttgcaca tcacctcaac agtgtctaac cattctttgc agggtttttt 17040
gaagaacttc ttgaacttga agtaataggg aagccggaca agctccccct tcttcttctc 17100
tccctccagc ttcggcatct cccactcttt tagagtaggg aaaactctga atgccaagaa 17160
ctcttgaact agatccctgg tgccaatatg ttctgagata atttcaaatt cacccagagc 17220
agcccaggtg ggacctttta ggtcgccaat gtggcattgt ggccttgtct ctccgaagat 17280
taactccaga gggctttgta ccaatttttc tttgtcttca tcgactttta cataaaacca 17340
ctcagatttc caacctgctg gccatttgct tcggtagctg atgacaggac actttgttgt 17400
cttccggtag gcaaaattat agcaaccgaa attatcatgt agcccatctt ttctggcctt 17460
tgtttggtaa tgtaattcgt gagctcggca gaagctgtca gcaaatggtt ccacagcttg 17520
gcttcggagg gcccagatat aaacattgag cctaacgatg gcgttaggag tcaattgatg 17580
aaagtagata ccaaacctcc ttagtatctc cgcaacaata tcgtggagag ggaatctaag 17640
cccggctttt aaaaaactct tgaaaataac aatctcatcc ttccttggct tcggggtggt 17700
ttcttcttcc ccgaagcgga gtagcttctt ctggtcctca ttgaaataac ctgcttttac 17760
catcttcgaa aggtcagctt ttgaaacagt tgatttccca aaatccaagt gactgggctt 17820
gctgggcata gcaaggtgat agtcatcttc ggagtcagtc ccttcaatgt tttcttttcc 17880
ttcggcagtt gttgggtctg cttcagcagc aggcatttct tctgtagtca gtagaccgga 17940
acgctgtatt gcttcggaga tgggcacagt gtctgaacct tcggcttcgt ctccctcacg 18000
tacaactttg gcagtagatc gtattctcgc catttgattc taagtttggg aagtcaaaaa 18060
ctttttcctt ttttcttttc tccgaagctc ttctttctga cgaagcggac gttgagaagc 18120
accttcgttc gattctgaga cttaagcttc ggctatggtg aaaaattttg gcagcgaaac 18180
agtgcaaata gcaatgaatg ctgtggtaac ttcacaccca cctgtttgtt tatatagtgc 18240
tgcaggtagg aaggcgaagc ggtggaactg ttacaccagg cgcgcagtaa ctcatacccg 18300
ctgtgcagtg gaccgcaaag accaaacagt aactctacaa agtgggcttg gcacgcgctc 18360
ggaagtcgga tcgtttctcc gcaacgagct cagggaaggt gttttttgga ccttcggctt 18420
cccgaagctg aagaggtttt ttttcacggg ccaagctcgt tacgaagaac gatctagcac 18480
cgcgaaaggg gctactgttg gggtcgtgct tcggtacgcc gaaggtctca cacgaagaag 18540
cagcttcggc caaagtcgtt tctaagagat ggccgaaggt cccttttcat ggagcttcgg 18600
cgttttaaac cgacatagag gcagaatgac ctttttatcc atagaagtct aacataatgt 18660
tgtaaacttt tgtaaagggc ataattgtaa ttcgtcacag gctgcgtcct gtgtctataa 18720
atagatgaac agtacccccg tactgttcac gctgacttgg cattttgctt ttgcacaacg 18780
cctgtactat ctaccttctc tcaggaccga aggtacattt gtaatttgaa atcatttcta 18840
tttttccatg ttaataaaat agaaatgatt ttatgatgat gcttatatta tatttcatgc 18900
tttatataaa tccttcgtca tcacttgtta tgtttacgaa ggtacgtctc ttatgacctt 18960
cgtccgaaac tcattatttc ccgaagggac ataatgcttc gaaggacgaa ggactttaac 19020
gtttaacact ttttatgttg ccttgttctt aattcttagc atttgagaac aagtccccaa 19080
cagaaattat ttcagttctc caatcttcac tgtacagtct tcctgtcaat ctttgggccc 19140
cctttcttgt ggttggtggc tccattcgaa gtatagcttc gattttattt ggattagctt 19200
caattccctt tgttgaaacc aagcatccaa ggaacttacc cttctttact ccgaagacac 19260
atttttctgg attcagcttc agaccagctt gtctgaagct ggcgaaggtc tcctgcagat 19320
cagcaatatg gtcttcttgc ttcgtgcttt ttacaataat gtcatcaaca taggtcaaca 19380
catttctgcc tatctgagat tggagaacct tcgcagtcat cctgctgaaa ctccctccag 19440
cattcttaag cccctcaggc atccgaagat agcaatatgt accacttggg gttatgaaac 19500
tagtcttcgg ctcatcctcc tttttcatcc agatttgatg atagcctgag taacaatcca 19560
ggagactcat gagttccgaa gaagctgctg catcaactaa agagtctatc cttggcagcg 19620
ggaactcatc cttcggacaa gccttgttga gatctgtgaa atcaatacac attctccact 19680
ttccattggc cttcttcacc ataacagtgt tagctagcca ttctggatac ttcacttctc 19740
tgataactcc tgcacttaag agtcttttta cttcgttgcg agccccttcg gccttgtcat 19800
cagacatttt ccgaagcctc tgcttgcggg gtctgaagga tgggtcaaca ttgagcgaat 19860
gttcaataac atcccgattc actccacaaa gatcattggc tgaccatgca aaaacatctt 19920
tattgttgaa taaaaacctt atcaaggttt tctcttgatc ttcagataat tgcgagccca 19980
atagcacctt ctgctctgct atatcttcac acagcagcat gggcttcggc tgatcagccg 20040
aagctgcttt ttccctcctg aacttgtact gttcacaagc ttcaactcca tctatattat 20100
ggattgcctt ggaatcagtc cagtttcctt cggcccttct ggcagcttcc tgactcccat 20160
gaatagcaat aggcccttgg tccgaaggta tcttcatgca gagataagct gggtgaagaa 20220
ttgcttcaaa agcatttagg gtaccacgac caatgatggc gttgtagggg tattccatgt 20280
caacaatatc aaacacaatt tgctcagtcc ttgtgttatt aacaaatccg aaggttaccg 20340
gcatggtaat cttcccgagt gccacaatct gccgccctcc gaagccacaa agagggtgcg 20400
tagcatcatg aatcttgtct tcaggctctt gcatctgtct gaaggctttg gcaaatataa 20460
tgtcagctgc actgcctgtg tcaactagga cattgtgaac cagaaaccct ttgatcacac 20520
aagaaatgac catagcatca ttgtgaggat agtccttgag ctgaagatct tcctgagaga 20580
aggtaattgg aatgtgagac cattttgact taatgaaggg tccctgcact ccaacatgct 20640
gcacccttct ctgagcctcc ttcttctgct ttttgttagc tggctctgag caagaaccgc 20700
ctgttatcgg gagcaccagc ttcgaagccg aagcagctct agcttgagtg ttgaacgaag 20760
ccatcagctc agaaaggtgg aagtgagttg accggaggtg ggcgccaatg ttggggactt 20820
gttctcaaat gctaagaatt aagaacaagg caacataaaa agtgttaaac gttaaagtcc 20880
ttcgtccttc gaagcattat gtcccttcgg gaaataatga gtttcggacg aaggtcataa 20940
gagacgtacc ttcgtaaaca taacaagtga tgacgaagga tttatataaa gcatgaaata 21000
taatataagc atcatcataa aatcatttct attttattaa catggaaaaa tagaaatgat 21060
ttcaaattac aaatgtatct tcggtcctga gagaaggtag atagtacagg cgttgtgcaa 21120
aagcaaaatg ccaagtcagc gtgaacagta cgggggtact gttcatctat ttatagacac 21180
aggacgcagc ctgtgacgaa ttacaattat gccctttaca aaagtttaca acattatgtt 21240
agacttctat ggataaaaag gtcattctgc ctctatgtcg gtttaaaacg ccgaagctcc 21300
atgaaaaggg accttcggcc atctcttaga aacgactttg gccgaagctg cttcttcgtg 21360
tgagaccttc gacgtaccga agcacgaccc caacag 21396
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgttctcat gttctgtagc atgg 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatccaagtg tggcacaaga ac 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgttagctgg ctctgagcaa gaac 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
accctcgtcg cacaacgacc 20

Claims (5)

1.一种玉米抗旱标记DRESH8，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述玉米抗旱标记DRESH8，其特征在于：所述抗旱标记DRESH8在玉米自交系B73的物理位置为8号染色体的139987478至140008873区间。
3.一种权利要求1所述玉米抗旱标记DRESH8在改良玉米抗旱性和辅助育种中的应用。
4.一种引物对在鉴定抗旱玉米品种中的应用，其特征在于：所述引物对：
F1：5’-CTGTTCTCATGTTCTGTAGCATGG-3’，
R1：5’-AATCCAAGTGTGGCACAAGAAC-3’；
F2：5’-TGTTAGCTGGCTCTGAGCAAGAAC-3’，
R2：5’-ACCCTCGTCGCACAACGACC-3’。
5.一种鉴定抗旱玉米品种的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取待检测玉米品种的DNA；
2)设计两对引物对，引物对如下：
F1：5’-CTGTTCTCATGTTCTGTAGCATGG-3’，
R1：5’-AATCCAAGTGTGGCACAAGAAC-3’；
F2：5’-TGTTAGCTGGCTCTGAGCAAGAAC-3’，
R2：5’-ACCCTCGTCGCACAACGACC-3’；
3)以上述DNA为模板进行PCR扩增；
4)电泳：
当一对引物F1物R1扩增出现目的条带，且一对引物F2和R2无法扩增出目的条带时，说明该玉米品种不含标记DRESH8，说明该品种抗旱性强；
或者，当一对引物F1物R1无法扩增出目的条带，且一对引物F2和R2引物扩增出现目的条带时，说明该玉米品种含有标记DRESH8，则说明该品种抗旱性弱。
CN202110801680.7A 2021-07-15 2021-07-15 玉米抗旱标记dresh8及其应用 Pending CN113481316A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110801680.7A CN113481316A (zh) 2021-07-15 2021-07-15 玉米抗旱标记dresh8及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110801680.7A CN113481316A (zh) 2021-07-15 2021-07-15 玉米抗旱标记dresh8及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113481316A true CN113481316A (zh) 2021-10-08

Family

ID=77939623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110801680.7A Pending CN113481316A (zh) 2021-07-15 2021-07-15 玉米抗旱标记dresh8及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113481316A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656125A (zh) * 2019-09-23 2020-01-07 四川育良生物科技有限公司 一种耐干旱玉米的遗传转化方法
CN115786559A (zh) * 2022-07-13 2023-03-14 四川农业大学 玉米干旱响应基因miR528b启动子的Indel标记及其应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106480075A (zh) * 2016-10-15 2017-03-08 华中农业大学 一种调控玉米干旱应激抗性的基因及其应用
CN106701895A (zh) * 2015-07-23 2017-05-24 中国科学院植物研究所 与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记
CN107419025A (zh) * 2017-08-29 2017-12-01 中国农业科学院作物科学研究所 玉米snac基因中的遗传变异在玉米耐旱性检测中的应用
KR102019041B1 (ko) * 2018-10-02 2019-09-09 동국대학교 산학협력단 옥수수 한발 내성 판별방법
CN110643589A (zh) * 2019-09-19 2020-01-03 华中农业大学 一种提高植物抗旱性的蛋白及其应用
US20200015444A1 (en) * 2012-11-07 2020-01-16 Monsanto Technology Llc Methods of creating drought tolerant corn plants using markers linked to cold shock domain-containing proteins and compositions thereof
CN111763682A (zh) * 2020-03-27 2020-10-13 华南农业大学 ZmSBP12基因在调控玉米抗旱性、株高及穗位高中的用途
WO2020229533A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Drought tolerance in corn
CN112877456A (zh) * 2021-02-02 2021-06-01 中国科学院植物研究所 一种玉米耐旱持绿和高效磷再动员能力的分子标记及应用
CN113004383A (zh) * 2021-04-13 2021-06-22 华中农业大学 玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200015444A1 (en) * 2012-11-07 2020-01-16 Monsanto Technology Llc Methods of creating drought tolerant corn plants using markers linked to cold shock domain-containing proteins and compositions thereof
CN106701895A (zh) * 2015-07-23 2017-05-24 中国科学院植物研究所 与玉米抗旱性相关的单体型及其分子标记
CN106480075A (zh) * 2016-10-15 2017-03-08 华中农业大学 一种调控玉米干旱应激抗性的基因及其应用
CN107419025A (zh) * 2017-08-29 2017-12-01 中国农业科学院作物科学研究所 玉米snac基因中的遗传变异在玉米耐旱性检测中的应用
KR102019041B1 (ko) * 2018-10-02 2019-09-09 동국대학교 산학협력단 옥수수 한발 내성 판별방법
WO2020229533A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 KWS SAAT SE & Co. KGaA Drought tolerance in corn
CN110643589A (zh) * 2019-09-19 2020-01-03 华中农业大学 一种提高植物抗旱性的蛋白及其应用
CN111763682A (zh) * 2020-03-27 2020-10-13 华南农业大学 ZmSBP12基因在调控玉米抗旱性、株高及穗位高中的用途
CN112877456A (zh) * 2021-02-02 2021-06-01 中国科学院植物研究所 一种玉米耐旱持绿和高效磷再动员能力的分子标记及应用
CN113004383A (zh) * 2021-04-13 2021-06-22 华中农业大学 玉米基因ZmEREB102在提高玉米产量中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEI ZHANG等: "Genomic basis underlying the metabolome-mediated drought adaptation of maize", 《GENOME BIOLOGY》 *
TINASHE ZENDA等: "Key Maize Drought-Responsive Genes and Pathways Revealed by Comparative Transcriptome and Physiological Analyses of Contrasting Inbred Lines", 《INT. J. MOL. SCI.》 *
孙霄鹏: "利用高通量测序技术解析玉米sRNA自然变异及其在抗旱应答中的功能", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士) 农业科技辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110656125A (zh) * 2019-09-23 2020-01-07 四川育良生物科技有限公司 一种耐干旱玉米的遗传转化方法
CN115786559A (zh) * 2022-07-13 2023-03-14 四川农业大学 玉米干旱响应基因miR528b启动子的Indel标记及其应用
CN115786559B (zh) * 2022-07-13 2023-09-26 四川农业大学 玉米干旱响应基因miR528b启动子的Indel标记及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109321582A (zh) 粗山羊草Yr4DS基因在麦族植物抗条锈病育种的应用
WO2013044742A1 (en) Spl16 compositions and methods to increase agronomic performance of plants
CN105695478B (zh) 调节植物株型和产量的基因及其应用
CN114071993B (zh) 栽培马铃薯的自交亲和性
CN113481316A (zh) 玉米抗旱标记dresh8及其应用
CN110777153B (zh) 一种美洲黑杨促雄基因MmS及其应用
CN110551719B (zh) 长链非编码rna基因alex1及其在提高水稻白叶枯病抗性中的应用
CN114540357A (zh) 玉米长链非编码RNA lncRNA25659及其用途
CN106554964B (zh) 棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用
CN109112227A (zh) 油菜开花关键基因作为油菜生态型改良和早熟育种的分子标记及应用
CN102604963B (zh) 柑橘早花基因PtELF5的分离克隆及应用
Naoumkina et al. A deletion/duplication in the Ligon lintless-2 locus induces siRNAs that inhibit cotton fiber cell elongation
CN116144697A (zh) GhKV3WRKY29基因及其蛋白在提高植物抗大丽轮枝菌黄萎病中的应用
CN111100868B (zh) 美洲黑杨的促雌基因ferr和抑雌基因ferr-r及其应用
CN109082425B (zh) 油菜硼高效基因BnA3NIP5；1Q的转座子插入片段TEQ和引物及其应用
CN111138520A (zh) 小麦磷脂酰肌醇转运蛋白TaSec14基因及其应用
CN114164291B (zh) 水稻粒长基因gl10等位基因的应用
CN117363631B (zh) Glyma.08g111100基因在鉴定大豆耐盐碱性中的应用
CN113637681B (zh) 海岛棉跨膜蛋白GbTMEM214-A07/D07基因及应用
CN117187260B (zh) 玉米耐旱基因ZmPRX1及其功能性分子标记和应用
CN113430289B (zh) 一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法
CN104024416A (zh) 用于植物基因表达的终止子序列
CN114752698B (zh) 引起番茄抗坏血酸合成差异的snp位点、筛选方法及鉴别方法
CN116970734B (zh) 一种棉花多心室控制基因GaMV连锁的SNP位点及其应用
KR102530404B1 (ko) 내염성 토마토 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 선별방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination