CN113430289B

CN113430289B - 一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN113430289B
Application number: CN202110923299.8A
Authority: CN
Inventors: 马媛媛; 吴秀芹; 张健男; 李斌; 安千里
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: CN113430289A

Abstract

本发明公开了一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法。所述引物对包括正向引物和反向引物，正向引物为DicCSP‑F1或DicCSP‑F2，反向引物为DicCSP‑R1或DicCSP‑R2，其中，DicCSP‑F2和DicCSP‑R2为简并引物。使用本发明引物对进行PCR，能且只能从含有Dickeya属细菌基因组DNA的样品中扩增出123～124bp的基因片段，用于鉴定和检疫Dickeya属细菌。此引物对也适用于荧光定量PCR，检测灵敏度比常规PCR高100倍，能准确灵敏地检验检疫Dickeya属细菌。

Description

一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法。

背景技术

肠杆菌目(Enterobacteriales)果胶杆菌科(Pectobacteriaceae)细菌通过产生果胶酶，降解植物细胞壁中的果胶，破坏植物细胞，导致植物细胞死亡和组织软化，发生植物软腐病，为害众多蔬菜和粮食作物、观赏花卉和林木。其中Dickeya属细菌寄主范围广泛，包括10个目的11种双子叶植物和5个目的10种单子叶植物，如马铃薯、甘薯、水稻和玉米等。

目前，Dickeya属已被鉴定了12个种，其中绝大多数种的菌株是植物病原菌。如D.dadantii能够引起甘薯茎腐病；D.zeae可以危害水稻、香蕉、芭蕉芋等重要作物；D.dianthicola已被发现在马铃薯、番茄、菊苣、洋蓟以及观赏性植物如秋海棠、大丽花、小苍兰、风信子、鸢尾花、长寿花和马蹄莲属中引起病害。此外，Dickeya属不同种的菌株能侵染同一种植物产生相似的病症，如D.solani，D.dianthicola，D.dadantii，D.chrysanthemi和D.zeae等种的细菌都能侵染马铃薯并导致软腐病害。因为Dickeya属多数细菌是检疫性有害生物，检疫时没必要区分不同种，所以适合用属水平的通用引物来检测鉴定Dickeya属的病原菌。

目前，国内外用聚合酶链式反应(PCR)检测鉴定Dickeya属细菌所用的引物有针对Dickeya属16S～23S间隔区设计的引物对Df/Dr(Laurila等，European Journal of PlantPathology，2010，126：249-262)，针对Dickeya属细菌特有标志基因的引物Dda1F/Dda1R(Kabir等，Microorganisms，2020，358)，以及基于细菌全基因组序列设计高通量PCR引物的流程设计的Dickeya属细菌的通用引物DIC-D(Pritchard等，Plant Pathology，2013，62：587-596)。但是，这些引物对或不具有Dickeya属特异性或不具有Dickeya属通用性。如用引物对Df/Dr，只能检测Dickeya属的部分细菌，得到假阴性结果。用引物对Dda1F/Dda1R不仅能扩增出Dickeya属细菌，还能扩增出部分Pectobacterium属细菌；引物DIC-D不仅能扩增出Dickeya属细菌，还能扩增出Pectobacterium属、Brenneria属、Erwinia属和Pantoea属的细菌，得到假阳性结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有PCR检测Dickeya属细菌引物特异性低或通用性低、检测易出现假阳性或假阴性的缺点，目的在于提供一种能够准确鉴定和检疫Dickeya属细菌的方法。

本发明的解决方案是，基于NCBI数据库中Pectobacteriaceae科细菌的全基因组序列，进行泛基因组分析找到Dickeya属的保守标志蛋白(conserved signatureproteins，CSPs)，以CSP基因序列为靶序列设计Dickeya属的特异引物，在NCBI数据库中BLAST评估引物对Dickeya属细菌的通用性和特异性。选择通用性和特异性强的引物，对Dickeya属和近缘属进行PCR检测，检验引物的通用性和特异性，确定Dickeya属特异的通用引物。

本发明首先提供了一种用于检测鉴定狄克氏属(Dickeya)细菌的引物对，包括正向引物和反向引物，正向引物为DicCSP-F1或DicCSP-F2，反向引物为DicCSP-R1或DicCSP-R2，其中，DicCSP-F2和DicCSP-R2为简并引物，

引物的核苷酸序列分别为：

正向引物DicCSP-F1：5’-GCGCTCAGATTGGTAACCGTTC-3’；

正向引物DicCSP-F2：5’-GCGCTCAGHTTGGTAACCGBTC-3’；

反向引物DicCSP-R1：5’-GAACCAAAAGTGAACAACTTGAAG-3’；

反向引物DicCSP-R2：5’-GAACCAAAAGTGAACAACTHGAAG-3’，

其中，简并碱基H代表A、T或C，简并碱基B代表G、C或T。

简并引物中简并碱基表示该位置可以有多种碱基，在合成的时候也是在该简并碱基位置加入多种碱基，最后得到的引物是多种序列的混合物，比如简并碱基H代表A、T或C，则最后的引物混合物中存在H位点是A、T或C的三种序列。

即，可用的引物对为DicCSP-F1/DicCSP-R1、DicCSP-F1/DicCSP-R2、DicCSP-F2/DicCSP-R1和DicCSP-F2/DicCSP-R2。

正向引物DicCSP-F1和DicCSP-F2对应Dickeya dadantii 3937的一个未知功能蛋白(GenBank收录号ADM98147.1)编码基因的核苷酸序列的4～23位；反向引物DicCSP-R1和DicCSP-R2对应此核苷酸序列的103～126位，对应于D.dianthicola同源序列的104～127位。PCR扩增出核酸片段的长度为123bp或124bp，且仅能从Dickeya属细菌扩出123bp或124bp的核酸片段。

本发明又提供了所述引物对在检测鉴定狄克氏属细菌中的应用。

本发明又提供了所述引物对在制备用于检测鉴定狄克氏属细菌的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的试剂盒，包括所述引物对。

本发明还提供了一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的方法，包括以下步骤：

(1)以样品的DNA作为扩增模板，使用所述引物对进行扩增；

(2)检测扩增产物，若扩增出123bp或124bp的DNA片段，则样品含有狄克氏属细菌。

优选的，步骤(1)中样品为细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。

优选的，扩增时使用PCR扩增，然后用电泳检测PCR扩增产物；或者使用荧光定量PCR扩增并检测。

优选的，PCR扩增时，扩增反应体系组成为：

100ng/μL的DNA模板：1μL；

10μM的正向引物DicCSP-F1：1μL，或10μM的正向引物DicCSP-F2：5μL；

10μM的反向引物DicCSP-R1：1μL，或10μM的反向引物DicCSP-R2：2μL；

2×Taq PCR Mix：12.5μL；

补无菌超纯水至25μL。

优选的，PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。

本发明所述方法是用DNA引物扩增DNA模板的方法，包括使用常规PCR扩增后通过凝胶电泳检测扩增结果，也包括使用荧光定量PCR方法进行检测，也可以是其他衍生的方法。检测的结果说明样品中是否含有Dickeya属细菌特有标志蛋白的编码基因片段，检测的对象可以是提取纯化的DNA、细菌菌体、含有细菌或细菌DNA的样品(如植物组织、土壤和灌溉水等)。

本发明所述的方法，用常规PCR扩增时，可检测DNA的最低浓度为10pg·μL^-1。用荧光定量PCR扩增时，可检测DNA的最低浓度为100fg·μL^-1，比常规PCR检测的灵敏度(10pg·μL^-1)高100倍。

本发明所述的方法，用于检测鉴定的Dickeya属细菌包括D.dadantii、D.dianthicola、D.solani、D.fangzhongdai、D.undicola、D.poaceiphila、D.chrysanthemi、D.oryzae、D.zeae等。

本发明针对Dickeya属细菌的保守标志蛋白ADM98147.1(GenBank收录号)，设计了针对Dickeya属细菌的通用特异引物DicCSP-F1/DicCSP-F2与DicCSP-R1/DicCSP-R2，用此引物对能且只能从含有Dickeya属细菌基因组DNA的样品(包括Dickeya属细菌DNA、Dickeya属细菌菌体、或含有Dickeya属细菌或其DNA的样品)中扩增出123bp或124bp的DNA片段，用于鉴定和检疫Dickeya属细菌。因为扩增出DNA片段的长度小于300bp，此引物对也适用于检测灵敏度更高的荧光定量PCR，能准确灵敏地检验检疫Dickeya属细菌。

附图说明

图1为正向引物DicCSP-F1与反向引物DicCSP-R1与Dickeya属细菌基因对应的核苷酸序列。正向引物DicCSP-F1对应Dickeya dadantii 3937的一个未知功能蛋白(GenBank收录号ADM98147.1)编码基因的核苷酸序列的4～25位；反向引物DicCSP-R1对应此核苷酸序列的103～126位。图中与引物对应核苷酸相同的核苷酸用“·”显示，与对应核苷酸不同的核苷酸用代表核苷酸的字母显示。菌株名后括号内是菌株全基因组序列或片段在GenBank中的收录号。

图2为琼脂糖凝胶电泳显示用正向引物DicCSP-F1或DicCSP-F2和反向引物DicCSP-R1或DicCSP-R2进行PCR，从Dickeya属细菌的基因组DNA中扩增出123或124bp片段，而从Pectobacterium属、Brenneria属、Lonsdalea属、Erwinia属、Pantoea属、Kosakonia属和Klebsiella属细菌的基因组DNA中没有扩增出123或124bp片段。

图3为琼脂糖凝胶电泳显示以10倍系列稀释的Dickeya dadantii CZ1501基因组DNA为模板，用引物对DicCSP-F1或DicCSP-F2和反向引物DicCSP-R1或DicCSP-R2进行PCR，扩增出123bp的目标片段。扩增阳性的DNA模板最低浓度为10pg·μL^-1。

图4为以10倍梯度稀释的Dickeya dadantii CZ1501基因组DNA为模板，用引物对DicCSP-F1和DicCSP-R1，用SYBR Green法进行荧光定量PCR的扩增曲线图，扩增阳性的DNA模板最低浓度为100fg·μL^-1。

图5为以10倍梯度稀释的Dickeya dadantii CZ1501基因组DNA为模板，用引物对DicCSP-F1和DicCSP-R1，用SYBR Green法进行荧光定量PCR的溶解曲线图，表明DicCSP-F1/DicCSP-R1引物特异性强，没有非特异性产物出现。

具体实施方式

实施例1

针对Dickeya属细菌特有基因序列设计Dickeya属细菌的通用特异引物：

从NCBI基因组数据库中下载Pectobacteriaceae科细菌的全基因组序列。对于不同机构或不同方法测得的同一菌株的全基因组序列，选取测序组装质量高的序列，ContigN50大于50000，假基因率小于10％；且用CheckM检验基因组的完整度和受污染的程度，然后选择完整度大于95％，污染度小于5％的全基因组序列进行泛基因组学分析。从泛基因组分析得到的Orthologs_Cluster结果中找到Dickeya属的特有蛋白，然后使用NCBI中的NR数据库检索特有蛋白的氨基酸序列，排除在其他科属菌株有同源序列的蛋白。针对筛选得到的Dickeya属特有蛋白的核苷酸序列，用Primer-BLAST进行特异引物的设计及在线比对(图1)，选择只比对到Dickeya属细菌的引物对，用于进一步实验。

筛选到一对特异性引物DicCSP-F1/DicCSP-R1，序列如下：

正向引物DicCSP-F1：5’-GCGCTCAGATTGGTAACCGTTC-3’；

反向引物DicCSP-R1：5’-GAACCAAAAGTGAACAACTTGAAG-3’；

正向引物DicCSP-F1对应Dickeya dadantii 3937的一个未知功能蛋白(GenBank收录号ADM98147.1)编码基因的核苷酸序列的4～25位；反向引物DicCSP-R1对应此核苷酸序列的103～126位，对应于D.dianthicola同源序列的104～127位。将DicCSP-F1和DicCSP-R1引物序列与Dickeya属细菌同源序列整列，将引物个别位点简并化以增强引物通用性，设计出引物DicCSP-F2和DicCSP-R2，序列如下：

正向引物DicCSP-F2：5’-GCGCTCAGHTTGGTAACCGBTC-3’；其中简并碱基H代表A、T、C，简并碱基B代表G、C、T；

反向引物DicCSP-R2：5’-GAACCAAAAGTGAACAACTHGAAG-3’；其中简并碱基H代表A、T、C。

使用正向引物DicCSP-F1或DicCSP-F2中的一种与反向引物DicCSP-R1或DicCSP-R2中的一种配合(即引物对DicCSP-F1/DicCSP-R1、DicCSP-F1/DicCSP-R2、DicCSP-F2/DicCSP-R1和DicCSP-F2/DicCSP-R2)可以从Dickeya属细菌的基因组DNA中扩增出123～124bp片段。

检验引物对Dickeya属细菌的通用性和特异性：

1)制备引物：用全自动DNA合成仪合成引物核苷酸序列，用ULTRAPAGE方法纯化得到白色结晶，用Tris-EDTA缓冲液(pH 8.0)或超纯水稀释到10μM，分装到0.5mL离心管内，在-20℃保存。

2)制备模板：选择Dickeya属的10个菌株和近缘的Pectobacterium属、Brenneria属、Lonsdalea属、Erwinia属、Pantoea属、Kosakonia属和Klebsiella属的23个菌株(表1)，在固体丰富培养基上培养细菌，挑取测试菌株长成的单菌落，用10μL无菌纯水悬浮菌体，取1μL菌悬液作为PCR反应的模板。或在液体丰富培养基中培养细菌，从菌体中提取细菌基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA在260nm和280nm处的吸收值，评价所提取DNA的质量，计算DNA的浓度，储存在-20℃备用。

3)PCR扩增：以25μL反应液总体积为例，扩增反应体系组成为1μLDNA模板(100ng/μL)、正向引物1μL(DicCSP-F1)或5μL(DicCSP-F2)、反向引物1μL(DicCSP-R1)或2μL(DicCSP-R2)、12.5μL 2×Taq PCR Mix、补无菌超纯水至25μL。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。取5μL扩增后反应液，在1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶中和0.5×TBE缓冲液(pH 8.3)中电泳，用凝胶成像仪观察PCR产物。结果是从Dickeya属细菌基因组DNA中扩增出了123～124bp的目标片段，而从其他属细菌基因组DNA中没有扩增出核酸片段(以图2代表)。引物对DicCSP-F1/DicCSP-R1、DicCSP-F1/DicCSP-R2、DicCSP-F2/DicCSP-R1和DicCSP-F2/DicCSP-R2具有检测鉴定Dickeya属细菌的特异性。

表1.检验引物对DicCSP-F1或DicCSP-F2和DicCSP-R1或DicCSP-R2从Dickeya属细菌扩增目标片段的通用性和特异性所用菌株

实施例2

验证引物对检测Dickeya属细菌的灵敏度。

将浓度为100ng/μL的Dickeya dadantii菌株CZ1501基因组DNA以10倍系列稀释，取每个稀释度的1μL DNA溶液为模板，用引物DicCSP-F1或DicCSP-F2和DicCSP-R1或DicCSP-R2，在25μL反应体系中，用上海翊圣生物科技有限公司生产的2×Hieff PCPMaster Mix，以上述扩增程序进行PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物(123bp)，显示可检测DNA的最低浓度为10pgμL^-1(以图3为代表)。

实施例3

用引物对DicCSP-F/DicCSP-R进行荧光定量PCR检测Dickeya属细菌。

将浓度为100ng/pL的Dickeya dadantii菌株CZ1501基因组DNA以10倍系列稀释8个稀释度，各取1μL DNA溶液为模板，在20μL反应体系中，加0.4μL引物DicCSP-F1(10μM)、0.4μL引物DicCSP-R1(10μM)、10μL 2×T5 Fast qPCR Mix、9.2μL无菌超纯水，用Bio-RadCFX-96实时荧光定量PCR仪，以扩增程序(95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸15s，40个循环)进行荧光定量PCR。

扩增阳性的最低DNA浓度为100fgμL^-1(图4)，比常规PCR检测DNA的灵敏度(10pgμL^-1)高100倍。扩增结果的溶解曲线有且只有一个峰(图5)，表明扩增产物单一，没有非特异性产物出现，说明荧光定量PCR扩增的特异性高。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的引物对、试剂盒及方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgctcagat tggtaaccgt tc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> h is a, t or c.

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> b is g, c or t.

<400> 2

gcgctcaght tggtaaccgb tc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaccaaaag tgaacaactt gaag 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> h is a, t or c.

<400> 4

gaaccaaaag tgaacaacth gaag 24

Claims

1.一种用于检测鉴定狄克氏属(Dickeya)细菌的引物对，其特征在于，包括正向引物和反向引物，正向引物为DicCSP-F1或DicCSP-F2，反向引物为DicCSP-R1或DicCSP-R2，其中，DicCSP-F2和DicCSP-R2为简并引物，

引物的核苷酸序列分别为：

正向引物DicCSP-F1：5’-GCGCTCAGATTGGTAACCGTTC-3’；

正向引物DicCSP-F2：5’-GCGCTCAGHTTGGTAACCGBTC-3’；

反向引物DicCSP-R1：5’-GAACCAAAAGTGAACAACTTGAAG-3’；

反向引物DicCSP-R2：5’-GAACCAAAAGTGAACAACTHGAAG-3’，其中，简并碱基H代表A、T或C，简并碱基B代表G、C或T。

2.如权利要求1所述引物对在检测鉴定狄克氏属细菌中的应用。

3.如权利要求1所述引物对在制备用于检测鉴定狄克氏属细菌的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述引物对。

5.一种用于检测鉴定狄克氏属细菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以样品的DNA作为扩增模板，使用权利要求1所述引物对进行扩增；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中样品为细菌、提取的细菌DNA或含有细菌/细菌DNA的粗提液。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，扩增时使用PCR扩增，然后用电泳检测PCR扩增产物；或者使用荧光定量PCR扩增并检测。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增时，扩增反应体系组成为：

100ng/μL的DNA模板：1μL；

2×Taq PCR Mix：12.5μL；

补无菌超纯水至25μL。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增时，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸5min。