CN111286555B

CN111286555B - 基于pgx4基因的SNP分子标记，其在尖孢镰刀菌检测中的应用，检测方法和试剂盒

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Publication number: CN111286555B
Application number: CN202010254429.9A
Authority: CN
Inventors: 叶青静; 周国治; 王荣青; 阮美颖; 姚祝平; 程远; 万红建; 李志邈; 杨悦俭
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-02
Filing date: 2020-04-02
Publication date: 2022-09-27
Anticipated expiration: 2040-04-02
Also published as: CN111286555A

Abstract

本发明提供一组基于多聚半乳糖醛酸外切酶基因的SNP分子标记，用于检测所述SNP分子标记的引物组，所述SNP分子标记或引物组在制备用于检测番茄枯萎病和颈腐根腐病的病原菌的检测试剂盒中的应用，所述试剂盒，及检测方法。本发明基于KASP技术通过上述SNP分子标记以及引物组对尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici，FOL)和尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusarium oxysporum f.sp.radicis‑lycopersici，FORL)进行鉴定，可以快速准确的将FOL race 1,2,3和FORL病原菌从发病植物和土壤中鉴定出来，操作简单，检测结果准确可靠，对于FOL race 1,2,3和FORL引起的病害防治具有重要的实用价值。

Description

基于pgx4基因的SNP分子标记，其在尖孢镰刀菌检测中的应用，检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物技术研究领域，特别涉及基于pgx4基因的SNP分子标记，其在尖孢镰刀菌检测中的应用，检测SNP分子标记的方法和试剂盒。

背景技术

尖孢镰刀菌在番茄上有尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici，FOL)和尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(Fusarium oxysporumf.sp.radicis-lycopersici，FORL)两种专化型，尖孢镰刀菌番茄专化型有3种生理小种，不同的生理小种和专化型侵染番茄品种所造成的病害程度不同。

番茄枯萎病(Fusarium wilt,FW)是由尖孢镰刀菌番茄专化型(FOL)侵染番茄根部引起的病害。番茄颈腐根腐病(Fusarium crown and root rot,FCRR)是由尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型(FORL)侵染番茄根部或茎基部引起的病害(例如见，

A.和

M.PCR detection of Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici and races ofF.oxysporum f.sp.lycopersici of tomato in protected tomato-growing areas ofthe eastern Mediterranean region of Turkey.Turkish Journal of Agriculture andForestry,2013,37(4):457-467；Manzo D.,Ferriello F.,Puopolo G.,Zoina A.,D’Esposito D.,Tardella L.和Ercolano M.R.Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici induces distinct transcriptome reprogramming in resistant andsusceptible isogenic tomato lines.BMC Plant Biology,2016,16(1):53-66)，田间常常存在着两种病原菌的复合侵染，给番茄根腐病或枯萎病的防治增加了难度。因尖孢镰刀菌孢子可借助水、种子或者农具等传播，发病区域不断增加，根腐病或枯萎病已成为危害我国番茄种植区的严重病害。近年来，番茄“死棵”的发生十分严重，如浙江、山东、陕西、海南、北京、东北、甘肃、江苏等地(刘晖，郑是琳，黄艳萍，番茄枯萎病菌生理小种及其生物学特性研究初报，山东农业大学学报，1991，22(4)：356-360；张斌，杨晓云，陈志谊，番茄枯萎病致病镰刀菌种类鉴定及优势种群的研究，植物病理学报，2016，46(4)：561-565；程琳，张生，李艳青，陈福东，程斐，张晓艳，国家进，番茄颈腐根腐病病原菌鉴定与抗病种质材料的筛选，园艺学报，2016，43(4)：781-788；李景富，孙亚莉，赵婷婷，姜景彬，许向阳，番茄颈腐根腐病菌分离鉴定与生物学特性研究，东北农业大学学报，2018，49(2)：22-30；李潇，李雪萍，漆永红，郭成，李敏权，番茄颈腐根腐病病原鉴定及其品种抗性鉴定，甘肃农业大学学报，2019，54(5)：121-127)，一旦发生，被侵染的植株必须尽快清除以阻止病害蔓延，因为目前还没有根治由尖孢镰刀菌引起根腐病或枯萎病的有效方法。对尖孢镰刀菌进行鉴定，了解病原菌不同生理小种及专化型的类型和分布，对监测和控制根腐病或枯萎病流行、生物防治及抗病育种具有重要意义。

KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)是一项竞争性等位基因特异性PCR技术体系，可对各种样品基因组的SNP/InDel等二态性标记类型进行基因分型检测，该技术易操作、灵活、高效，成本较低，分析准确、稳定。利用多聚半乳糖醛酸外切酶(pgx4)基因的SNP信息开发KASP分子标记，并结合KASP分型技术，对病原菌FOL race 1，2，3及FORL进行检测。KASP技术是一个重要的辅助手段，可极大地节省成本，增加病原菌鉴定的效率和准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供基于pgx4基因的SNP分子标记，其在尖孢镰刀菌检测中的应用，检测SNP分子标记的方法和试剂盒。本发明提供基于KASP技术用于番茄尖孢镰刀菌专化型及生理小种检测的引物及应用。

本发明根据对镰刀菌属(Fusarium spp.)pgx4基因的核苷酸序列的相互比较，找到了在FOL race 1，2，3和FORL病原菌中存在，但在其它物种当中不存在的特异核酸位点。针对这些SNP位点，本发明人设计了用于KASP技术检测的引物。经过尝试，该引物可以在实验室内快速鉴定番茄枯萎病和颈腐根腐的病原菌。

为了实现本发明目的，本发明提供的基于pgx4基因开发的用于鉴定FOL race 1，2，3和FORL的分子标记，所述分子标记的位点信息如表1所示：

表1

基于KASP技术开发的用于检测上述分子标记的引物，所述引物的信息见表2：

表2

其中，表2中GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为FAM标签序列，GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为HEX标签序列。

本发明还提供所述SNP分子标记或所述引物组在制备用于检测番茄枯萎病和颈腐根腐病原菌的检测试剂盒中的应用。

在一个实施方式中，所述试剂盒用于检测尖孢镰刀菌番茄专化型FOL，其生理小种FOL race1、FOL race2和FOL race3，和/或尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型FORL。

本发明还提供一种用于检测番茄枯萎病和颈腐根腐病的病原菌的试剂盒，所述试剂盒包含检测上述SNP分子标记的试剂。

在一个实施方式中，所述检测上述SNP分子标记的试剂包含上述引物组。

本发明提供了检测番茄枯萎病和颈腐根腐病的病原菌的方法，所述方法通过竞争性等位基因特异性PCR检测上述SNP分子标记，

其特征在于，所述SNP分子标记反应体系为10μL，PCR扩增体系的组成如下：

取浓度10ng/μL的DNA模板2.5μL，KASP引物混合液0.14μL，2×KASP Master Mix 5μL，加ddH₂O至10μL，进行PCR扩增；引物混合液中引物FAM-f、引物HEX-h终浓度均为10μM，引物c终浓度为20μM；

PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，30个循环。

在一个实施方式中，所述DNA模板为提取自待测病原菌的DNA。

在一个实施方式中，所述方法检测尖孢镰刀菌番茄专化型FOL，其生理小种FOLrace1、FOL race2和FOL race3，和/或尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型FORL。

在一个实施方式中，所述PCR为采用上述所述引物组的KASP。

本发明提供的4对SNP引物可以基于KASP平台实现基因分型数据获得。具体方案为，根据KASP技术要求针对于本发明提供的位点设计引物，引物为普通引物不含荧光基团；购置KASP技术配套的PCR扩增体系MasterMix；配置反应体系加入DNA、引物和MasterMix；运行反应程序；原位扫描荧光信号；数据分析获得基因型数据。

本发明的有益效果是：利用本发明提供的KASP标记及其引物组合能够快速检测FOL race 1，2，3和FORL病原菌，成本低，操作简单，检测结果准确可靠，对于FOL race 1，2，3和FORL引起的病害防治具有重要的实用价值。

附图说明

图1为本发明基于KASP技术检测从发病番茄植株根部分离病原菌的基因型方法一个分型结果图。图中A代表FORL的基因型。靠近横轴红色圆点(右侧)代表C基因型；纵轴蓝色圆点(上方)代表T基因型；对角线附近的紫色圆点(左侧，下方)代表杂合型C/T，黑色圆点代表ddH₂O空白对照。

图2：FOLrace1标记的KASP分型结果，图中B代表FOL race 1的基因型。靠近纵轴蓝色圆点(上方)代表C基因型；横轴红色圆点(右侧)代表G基因型；对角线附近的圆点(左侧，下方)代表杂合型C/G，黑色圆点代表ddH₂O空白对照。

图3：FOLrace2标记的KASP分型结果，图中C代表FOL race 2的基因型。靠近纵轴蓝色圆点(上方)代表T基因型；横轴红色圆点(右侧)代表C基因型；对角线附近的圆点(左侧，下方)代表杂合型C/T，黑色圆点代表ddH₂O空白对照。

图4：FOLrace3标记的KASP分型结果，图中D代表FOL race 3的基因型。靠近横轴红色圆点(右侧)代表A基因型；纵轴蓝色圆点(上方)代表G基因型；对角线附近的紫色圆点(左侧，下方)代表杂合型A/G，黑色圆点代表ddH₂O空白对照。

图5：病原菌分离物pgx4基因核苷酸序列同源性。

图6：基于pgx4基因序列构建的系统进化树。

图7：病原菌分离物pgx4基因核苷酸序列多重比对分析的计算机软件屏幕截图。

图8：病原菌分离物XA-8、JH-15、JH-16和HN-R-2d致病毒性检测。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明所用引物由上海生物技术有限公司合成。

实施例1、(FOL race 1，2，3及FORL病原菌SNP分子标记的开发)1、基于KASP技术体系FOL race 1，2，3及FORL病原菌鉴定引物的获得

从National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站下载19种尖孢镰刀菌的pgx4基因，包括AB256798、AB256831、AF136444、AB256820、AB256797、AB256818、AB256796、AB256816、AB256795、AB256800、AB256804、AB256805、AB256809、AB256825、AB256829、AB256833、AB256833、AB256835、AB256838。同时，下载5种其它镰刀菌属(Fusarium spp.)的pgx4基因，包括F.solani、F.proliferatum、F.fujikuroi、F.graminearum和F.equiseti。利用MegAlign(Lasergene，DNAStar)软件将上述基因序列比对分析，找到了分别在FOL race 1，2，3及FORL病原菌中存在，但在其它物种当中不存在的SNP位点，如表1所示。

针对SNP位点设计KASP检测专用引物，利用Oligo 7软件设计引物FORL-FAM-f(GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATGGTGGAACGGTATGACC，SEQ ID NO：1)，FORL-HEX-h(GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATGGTGGAACGGTATGACT，SEQ ID NO：2)，FORL-c(AAGAATCTCCTTGCCGGCAAACTCTGCATA，SEQ ID NO：3)，FOLrace1-FAM-f(GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCTTGAACGAGATGTCCTTGGCTAG，SEQ ID NO：4)，FOLrace1-HEX-h(GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCTTGAACGAGATGTCCTTGGCTAC，SEQ ID NO：5)，FOLrace1-c(GTCGTCACCTGTAAGGAACCCT，SEQ ID NO：6)，FOLrace2-FAM-f(GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGTCCTTGAAGTGAACTCCC，SEQ IDNO：7)，FOLrace2-HEX-h(GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGTCCTTGAAGTGAACTCCT，SEQ ID NO：8)，FOLrace2-c(TCCGACCTATTCTGTTCTATGCT，SEQ ID NO：9)，FOLrace3-FAM-f(GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTGTGTTAGTGCTACT AGTGCGGCA，SEQ ID NO：10)，FOLrace3-HEX-h(GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTGTGTTAGTGCTAC TAGTGCGGCG，SEQ ID NO：11)，FOLrace3-c(TAACCTTGAAAGGGCTCGCAGAAGCCTGAG，SEQ ID NO：12)。

2、用本发明的引物对FOL race 1，2，3及FORL病原菌进行KASP检测，测试标记分型情况，同时对从发病番茄植株根部分离病原菌进行KASP检测。

本例所述病原菌：

浙江省农科院蔬菜所提供ZAAFOL1(GenBank登录号MN708360)、ZAAFOL2(GenBank登录号MN708361)、ZAAFOL3(GenBank登录号MN708362)和ZAAFORL8(GenBank登录号MN708359)病原菌菌株，ZAAFOL1是FOL race 1的阳性对照，ZAAFOL2是FOL race 2的阳性对照，ZAAFOL3是FOL race 3的阳性对照，ZAAFORL8是FORL的阳性对照；其他的病原菌是从杭州、金华、海宁、萧山、寿光、淄博及西安番茄种植区根腐病或枯萎病发病严重的病株上分离获得；

检测方法按以下步骤进行：

(1)菌丝DNA的提取：用灭菌牙签从平板上刮取菌丝约0.1克，置于2.0mL离心管中，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；

(2)PCR扩增：反应体系为10μL：取浓度10ng/μL的DNA模板2.5μL，KASP引物混合液0.14μL，2×KASP Master Mix 5μL，加ddH₂O至10μL，进行PCR扩增；引物混合液中引物FAM-f、引物HEX-h终浓度均为10μM，引物c终浓度为20μM。

(3)PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒(每个循环降低0.6℃)，10个循环；94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，30个循环。

(4)PCR反应结束后，利用BIO-RAD CFX Connect荧光定量PCR仪对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果导出成列表格式，即得到表3中基因分型结果。结果显示，ZAAFOL1、ZAAFOL2、ZAAFOL3和ZAAFORL8的SNP位点分子标记均能够清晰地将测试病原菌进行分型；中国番茄主栽区番茄病株根部分离获得的90个病原菌中12个FORL病原菌，8个FOLrace 1病原菌，1个FOL race 2病原菌，40个FOL race 3病原菌。

表3病原菌分离物KASP检测结果

实施例2、(病原菌的pgx4基因克隆、测序及分析)

本例所述病原菌：来自实施例1基因分型检测的部分FOL race 1，2，3及FORL病原菌；

按以下步骤进行：

(2)PCR扩增：病原菌pgx4基因扩增引物：Fo-1F：5’-CTGCCCGCTGGGAACAAGCT-3’(序列表中SEQ ID NO：13)，Fo-3R：5’-CTTAACCGTTGAACTTTCTAAC-3’(序列表中SEQ ID NO：14)。在各PCR管中分别加入步骤1提取的各样品DNA 1μL后，再依次加入2×Taq PCR MasterMix(市售，TAKARA)5μL，上下游引物各0.25μL(终浓度0.25μM)，加ddH₂O至10μL后，按PCR反应程序：94℃预变性3分钟，94℃变性50秒，55℃退火60秒，72℃延伸90秒，35个循环进行扩增，72℃延伸10分钟，产物4℃保存。

(3)pgx4基因克隆测序：将扩增的pgx4基因片段经1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收、连入pMD-18T载体，然后送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

(4)生物信息学分析：测序结果采用DNAStar、TexShade和MEGA等生物信息学分析软件进行序列分析。通过TexShade分析软件进行多序列比对，DNAStar分析软件进行序列同源性比较，并采用MEGA软件进行构建系统发育树。

核苷酸同源性分析(图5)和进化树分析(图6)显示，XA-1、XA-5、XA-8、ZB-1、ZB-5与ZAAFORL8聚在同一个分支Ⅲ上，亲缘关系最近，同源性为99.7％-99.9％；JH-15、JH-20、SY-11-2、SY-2-14与ZAAFOL1属于Ⅰ分支，同源性为99.5％-99.7％；JH-16与ZAAFOL2属于Ⅳ分支，同源性为99.9％；ZB-32、HN-R-2d、SG-1-25、XS-1-3与ZAAFOL3属于Ⅱ分支，同源性为99.7％-99.9％。

病原菌pgx4核苷酸序列多重比对显示，在FORL SNP标记位点XA-1、XA-5、XA-8、ZB-1、ZB-5与ZAAFORL8的位点C一致，在FOL race1SNP标记位点JH-15、JH-20、SY-11-2、SY-2-14与ZAAFOL1的位点C一致，在FOL race 2SNP标记位点JH-16与ZAAFOL2的位点T一致，在FOLrace 3SNP标记位点ZB-32、HN-R-2d、SG-1-25、XS-1-3与ZAAFOL3的位点A一致(图7)。

实施例3、(病原菌致病毒力检测)

以番茄品系7969和T15196为材料(浙江省农科院蔬菜所提供)，进行接种试验。具体如下：

(1)准备待鉴定番茄幼苗；以番茄品系7969和T15196为材料，选取健康饱满的种子播种于育苗培养基质中，25℃环境温度下进行培养，幼苗长到2-4片真叶，挑选健康、均匀一致的幼苗作为待鉴定番茄幼苗，备用。

(2)制备病原菌分离物孢子液：将XA-8、JH-15、JH-16和HN-R-2d病原菌接种于PDA培养基中，置于22℃下培养15天，将菌丝刮入到无菌水中，再配制成孢子浓度为1-2×10⁶个孢子/ml的悬液孢子液。

(3)病原菌侵染处理：每个病原菌分离物，选取9株幼苗进行病原菌侵染处理，将步骤(1)的待鉴定番茄幼苗从育苗培养基质中取出(在提苗过程使之自然摩擦伤根)，轻轻提苗并抖动进行清洗，清洗后得自然伤根幼苗，然后将自然伤根幼苗置于步骤(2)的病原菌孢子液中浸泡3-4小时，然后移入清水为培养液的水培装置中，以无菌水为对照，环境温度控制在22-25℃。(4)病原菌致病力检测：病原菌侵染处理15天后，进行病情调查。病情指数按0～4级进行鉴定(参考文献：Sharma A.,Sharma N.K.,Srivastava A.,Kataria A.,DubeyS.,Sharma S.,and Kundu B.Clove and lemongrass oil based non-ionicnanoemulsion for suppressing the growth of plant pathogenic Fusariumoxysporum f.sp.lycopersici.Ind.Crops Prod.2018,123：353-362)。0级：根茎无症状；1级：主根和侧根中度变褐，但是没有出现腐烂状况(出现水渍状褐色斑点)；2级：主根开始腐烂，腐烂面积不超过根部总面积的25％，茎基部开始出现缢缩现象，但是可以发现新生的侧根，上部叶片无明显症状；3级：主根大部分腐烂，根部腐烂面积达到根部总面积26％～75％，同时茎基部缢缩，无新生侧根，上部叶片枯萎；4级：主根和上部叶片及植株生长点严重腐烂，根部腐烂面积达到根部总面积的76％以上，根茎部位缢缩成线状，植株几乎死亡。

病情指数(DI)的计算按如下公式计算：

病情指数＝Σ(级数×发病株数)/(最高病情级数×总株数)×100，式中Σ为和。

根据病情指数鉴定致病菌毒力。病原菌致病能力分为4类(参考文献：BertoldoC.,Gilardi G.,Spadaro D.,Gullino M.L.,and Garibaldi A.Genetic diversity andvirulence of Italian strains of Fusarium oxysporum isolated from Eustomagrandiflorum.Eur.J.Plant Pathol.2015,141：83-97)。无毒性(N)(DI＝0to 10)；低毒性(L)(DI＝11to 30)；中等毒性(M)(DI＝31to 60)；强毒性(H)(DI＝61to 100)。

利用番茄材料7969和T15196对病原菌进行了致病毒性的鉴定(图8)，其中XA-8和HN-R-2d具有高致病毒性(H)，JH-16具有中等致病毒性(M)，JH-15具有低致病力(L)(表4)。

T15196：从西安引进的T0P1374(F₁)的高度分离后代经连续7代选择而成。

7969：从以色列尼瑞特种业有限公司引进耐贮运、抗线虫、中果型、大红、杂交一代番茄品种‘NEMO-TAMMI’。将其与自育、大果型、抗叶霉病株系材料‘9179’进行杂交。对其高度分离后代进行连续9代的抗性及园艺性状筛选，获得果实性状优良，长势强株系‘7969’。

表4病原菌分离物对番茄材料T15196和7969的致病力

以上所述的实施例只是本发明的示例性实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 基于pgx4基因的SNP分子标记，其在尖孢镰刀菌检测中的应用，检测方法和试剂盒

<130> GY20100081

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tatggtggaa cggtatgacc 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tatggtggaa cggtatgact 40

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

aagaatctcc ttgccggcaa actctgcata 30

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tccttgaacg agatgtcctt ggctag 46

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tccttgaacg agatgtcctt ggctac 46

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

gtcgtcacct gtaaggaacc ct 22

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc tgtccttgaa gtgaactccc 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat tgtccttgaa gtgaactcct 40

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

tccgacctat tctgttctat gct 23

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 10

gaaggtgacc aagttcatgc tttgtgttag tgctactagt gcggca 46

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 11

gaaggtcgga gtcaacggat tttgtgttag tgctactagt gcggcg 46

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 12

taaccttgaa agggctcgca gaagcctgag 30

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 13

ctgcccgctg ggaacaagct 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 14

cttaaccgtt gaactttcta ac 22

Claims

1.一种用于检测基于多聚半乳糖醛酸外切酶基因的一组SNP分子标记的引物组，所述引物组通过KASP技术检测所述SNP分子标记，对于各SNP，所述引物组包括以下引物：

用于SNP标记物F1的引物：

FORL-FAM-f，5’-3’ ：SEQ ID No.: 1所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：C

FORL-HEX-h，5’-3’ ：SEQ ID No.: 2所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：T

FORL-c，5’-3’ ：SEQ ID No.: 3所示的核苷酸序列；

用于SNP标记物F2的引物：

FOLrace1-FAM-f，5’-3’ ：SEQ ID No.: 4所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：G

FOLrace1-HEX-h，5’-3’：SEQ ID No.: 5所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：C

FOLrace1-c，5’-3’：SEQ ID No.: 6所示的核苷酸序列；

用于SNP标记物F3的引物：

FOLrace2-FAM-f，5’-3’：SEQ ID No.: 7所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：C

FOLrace2-HEX-h，5’-3’：SEQ ID No.: 8所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：T

FOLrace2-c，5’-3’：SEQ ID No.: 9所示的核苷酸序列；和

用于SNP标记物F4的引物：

FOLrace3-FAM-f，5’-3’：SEQ ID No.: 10所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：A

FOLrace3-HEX-h，5’-3’：SEQ ID No.: 11所示的核苷酸序列，用于检测等位基因：G

FOLrace3-c，5’-3’：SEQ ID No.: 12所示的核苷酸序列，

其中，上述各引物核苷酸序列中，GAAGGTGACCAAGTTCATGCT为FAM标签序列，GAAGGTCGGAGTCAACGGATT为HEX标签序列。

2.权利要求1所述的引物组在制备用于检测番茄枯萎病和颈腐根腐病的病原菌的检测试剂盒中的应用，所述试剂盒用于检测尖孢镰刀菌番茄专化型FOL，其生理小种FOL race1、FOL race2和FOL race3，和/或尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型FORL；对于SNP标记物F1，当在病原菌中的等位基因为C时，病原菌为FORL；对于SNP标记物F2，当在病原菌中的等位基因为C时，病原菌为FOL race1；对于SNP标记物F3，当在病原菌中的等位基因为T时，病原菌为FOL race2；对于SNP标记物F4，当在病原菌中的等位基因为A时，病原菌为FOL race3。

3.一种用于检测番茄枯萎病和颈腐根腐病的病原菌的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其用于检测尖孢镰刀菌番茄专化型FOL，其生理小种FOLrace1、FOL race2和FOL race3，和/或尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型FORL。

5.一种检测番茄枯萎病和颈腐根腐病的病原菌的方法，其特征在于：

所述方法通过竞争性等位基因特异性PCR利用权利要求1所述的引物组检测基于多聚半乳糖醛酸外切酶基因的一组SNP分子标记；

所述方法检测尖孢镰刀菌番茄专化型FOL，其生理小种FOL race1、FOL race2和FOLrace3，和/或尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型FORL；

对于SNP标记物F1，当在病原菌中的等位基因为C时，病原菌为FORL；对于SNP标记物F2，当在病原菌中的等位基因为C时，病原菌为FOL race1；对于SNP标记物F3，当在病原菌中的等位基因为T时，病原菌为FOL race2；对于SNP标记物F4，当在病原菌中的等位基因为A时，病原菌为FOL race3。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SNP分子标记反应体系为10μL，PCR扩增体系的组成如下：

PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应： 94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，每个循环降低0.6℃ ，10个循环；94℃变性20秒， 55℃退火并延伸60秒，30个循环。