CN103789418B - 检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本方法基于该病原的尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的特异保守引物和TaqMan探针建立了一种实时荧光PCR定性检测方法，能够在1.5小时内同时分别对尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种进行准确高效的定性和定量检测，具有高特异性和高灵敏度，较之前的普通PCR检测研究提高了检测灵敏度达1－2个数量级，且能够进行定量检测，突破了SYBR？GREEN荧光染料法不能进行两重或多重检测的限制。该实时荧光PCR定性检测方法行准确高效，能够用于加强该病害防控检测和检疫工作。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种快速鉴定与定量检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针实时荧光引物及其检测方法。
背景技术
由尖孢镰刀菌1号（Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace1，FOC1）和4号生理小种（F.oxysporumf.sp.cubenserace4，FOC4）引起的香蕉镰刀菌枯萎病，是世界上香蕉的毁灭性病害，给世界的香蕉产业带来巨大的危害。香蕉主要集中于非洲、南美洲和亚洲，年产量近一亿吨，是世界第二大水果作物，同时为近5亿人口的主要粮食之一，是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。日前共有120个国家和地区生产香蕉。近年来我国香蕉生产发展迅猛，居全球第二。香蕉业己成为我国热带地区农业的支柱产业。但是，随着香蕉种植面积逐年增加，香蕉病害的危害也日益严重，尤其是香蕉枯萎病给香蕉生产带来极大的威胁。1876年，JosephBancroft在澳大利亚首次报道了香蕉枯萎病。1904年在美国夏威夷也发现此病，1910年，巴拿马因香蕉枯萎病大发生，造成惨重损失，因而香蕉枯萎病又称为香蕉巴拿马病。同年，由ErwinF.Smith在古巴从香蕉病组织中分离到该病的病原菌，并将其命名为Fusariumoxysporumf.cubenseE.F.Smith。1913年Ashby对该病害及其病原菌首次做了详细的描述，Brandes于1919年首次确证了该病菌的致病性，1940年由Snyder和Hansen建议将该病菌正式命名为F.oxysporumSchlecht.f.sp.cubense(E.F.Smith)SnyderetHansen。目前，该病害已广泛分布于亚洲、非洲、澳大利亚、南太平洋及热带美洲的香蕉产区。该病（1号小种）于1940—1950在中南美洲国家爆发感染，使风糜世界的国际贸易香蕉品种大蜜哈（GrosMichel）退出历史舞台。1967年我国台湾省发生香蕉枯萎病,20世纪70年代后流行,使台湾的香蕉面积从最高峰时期的50000公顷降至近年的5000公顷,而且其中的一半仍受到枯萎病的影响。菲律宾、澳大利亚、马来西亚、非洲等国家和地区的香蕉也相继局部发生枯萎病。
在中国于十九世纪五六十年代在广东、广西、海南发现该病侵染为害粉蕉，1996年广东番禺万顷沙镇的巴西及广东2号香蕉出现枯萎病，现已通过种苗和流水等传染途径扩散至中山、珠海、东莞、肇庆、信宜、高州和湛江（雷州半岛）等地，该病每年以30—50公里速度传播，使许多蕉园不能种植香蕉，目前已有1000多公顷蕉园弃耕。现广东、广西（如南宁、百色）、福建（如漳州）、海南（如文昌、万宁、儋州、安定、澄迈）、云南（如河口、景洪）和台湾均有分布，对我国香蕉种植业构成严重威胁。
该菌因生理小种不同而危害不同品种的香蕉，世界上已报道有3个生理小种，其中1号小种世界性分布，感染粉蕉、香蕉的栽培品种大蜜哈(AAA)和Apple(AAB)、Silk(AAB)、TaiwanLatundan(AAB)和IC2(AAAA)等香蕉品系；2号小种在中美洲洪都拉斯、萨尔瓦多、波多黎哥、多米尼加和维尔京群岛分布，仅感染杂种三倍体Bluggoe(ABB)及其近缘品种和某些Jamaica四倍体(AAAA)蕉；4号小种主要分布在澳大利亚、非洲以及菲律宾（卡拉雷群岛）等部分亚洲国家，可感染大蜜哈(AAA)、TaiwanLatundan(AAB)、PisangLilin(AA)、野蕉(BB)等所有香蕉和大蕉品种及对其他小种有抗性的香牙蕉（AAA），故危险性和毁灭性最大，引起世界各香蕉种植国家的高度关注。目前中国以小种4号和1号危害最为严重。
目前该病害没有好的防治措施，而且危害的区域在不断扩大，且对于粉蕉更存在FOC1侵染的现象。粉蕉经济价值高，且随着种植面积的增大，病害发生也日趋严重，对于粉蕉苗的检测和发病初期的早期检测而言，需要更为灵敏和准确有效的检测方法。对香蕉枯萎病及其病原的检测鉴定和监控防疫工作是解决香蕉枯萎病问题的前提和基础，检测方法的建立和应用对于阻止病害蔓延和发生具有重要的意义。
国内的检测鉴定研究，如王国芬等根据香蕉枯萎病菌ITS序列设计合成的三条引物:FusF1(5′AACCCCTGTGAACATACCACTTG3′)、FusR1(5′GAGGAACGCGAATTAACGCGAC3′)和FusR2(5′GACGATTACCAGTAGCGAGGGT3′)构成引物对A(FusF1/R1)和B(FusF1/R2),对尖孢镰刀菌古巴专化型病菌进行了有效的PCR特异扩增试验。
对于生理小种检测鉴定方面主要集中在4号生理小种，如台湾LinYinghong等建立了针对FOC4特异性404bp序列的普通PCR检测引物，并应用SYBRGREEN荧光染料进行了实时荧光PCR检测。福建Li等建立了针对FOC4特异性404bp序列的LAMP方法检测4号生理小种。
近年来，有研究报道解决了两个生理小种的普通PCR鉴定问题。如刘景梅等尝试用RAPD技术区分生理小种，经过随机引物筛选出4个RAPD标记成功地转化为SCAR标记，其中Race1－SCAR标记1个、Race4－SCAR标记2个、同时能鉴定出2个小种的SCAR标记1个。应用这4个SCAR标记同时对采自田间的9个病菌分离物进行检测，能够准确地鉴定出广东蕉区的尖孢镰刀菌古巴专化型Racel和Race4。2012年李敏慧等已建立了能够区分两个生理小种的普通PCR分子检测体系。但田间样品病菌含量低，干扰物质多，内生真菌、细菌和土壤中放线菌等分布广泛，对检测的灵敏度和特异性均构成了极大的干扰，造成现有检测方法往往因为灵敏度和特异性的限制而呈现检测结果不稳定的现象，对病害的早期检测带来了一个巨大的障碍。
实时荧光PCR技术是使用实时荧光扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。该方法较普通PCR方法更为灵敏可靠，较环介导等温扩增方法更稳定，不易污染，且可以实现多重检测，是现在通行灵敏并且可靠的检测方法，应用广泛。尤其是探针法实时荧光PCR技术因其特异性高、可多重检测，故常用于SNP解析，病毒、病原菌检测。但目前尚未有探针法实时荧光PCR检测尖孢镰刀菌的报道，更缺乏专门针对尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的实时荧光PCR检测方法。
本方法建立了能够准确高效区分尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。希望能够通过该方法的建立，解决含量低、干扰多的难题；同时，建立了一种能够定量检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的方法以应用于菌含量的对比研究。
本方法能用于同时实时荧光PCR法检测两个生理小种，且更稳定，灵敏度较高，符合“快、准、稳、省”的检测一般要求。相对于其他更灵敏的方法如LAMP方法更为稳定，不易污染，相对传统PCR方法和接种鉴定生理小种方法更为灵敏和快速，可以在幼苗期进行检测，对于香蕉生产上意义重大。因为香蕉属于三倍体作物，不能通过传统的杂交育种来繁殖，生产上采用组培苗来做田间种植，所以对于田间香蕉枯萎病的控制主要在种苗的监测上，而种苗中的含菌量是很低的，需要灵敏度较高的检测方法，而本研究建立的方法能够较好地解决这一问题，应用前途广泛。而且，由于FOC4在中国境内危害日益严重，主栽品种巴西蕉也日益减少，粉蕉和大蕉的种植越来越广泛，而两者都是FOC1的寄主，因此，田间调查发现FOC1的危害有进一步扩大的趋势。本方法首次针对FOC1建立了实时荧光检测方法，对于监控和防止该生理小种的进一步蔓延有重大意义。
本方法基于该病原的尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的特异保守引物和TaqMan探针建立了一种实时荧光PCR定性检测方法，能够在1.5小时内同时分别对尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种进行准确高效的定性和定量检测，具有高特异性和高灵敏度，较之前的普通PCR检测研究提高了检测灵敏度达1－2个数量级，且能够进行定量检测，突破了SYBRGREEN荧光染料法不能进行两重或多重检测的限制。该实时荧光PCR定性检测方法行准确高效，能够用于加强该病害防控检测和检疫工作。
发明内容
本发明的首要目的是克服现有技术的缺点与不足之处，提供一种快速准确灵敏的检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针引物及其定量检测方法。
本发明的另一目的在于提供所述检测方法的应用。
本发明是采用以下方案实现的：一种快速检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的TaqMan探针检测方法，包含以下步骤：
1.引物和探针
引物采用PrimerExpress3.0软件设计，由华大基因公司合成。
FOC1所用引物和探针如下：
Foc1-0422F15’AGGTGAGAAATCTGTTGAGTCTCGAT3’；
Foc1-0422R15’AACTCCTTCACCAGCCTTTCG3’；
Foc1-0422P15’Cy5-AGCATGGCAGGTCGT-BHQ33’；
2.DNA提取和浓度测量
样品DNA提取采用CTAB两步法，提取前用液氮充分研磨，提取后用NanoDrop1000型核酸微量测定仪测定核酸浓度。具体提取步骤如下：
称取1g样品（根据样品的DNA含量，可以调整样品量），加入到50mL的离心管中；加入5mLCTAB提取液和20μL蛋白酶K溶液，充分混匀。65℃孵育30min，不时振荡；65℃过夜后,8000r/min室温离心10min,取1ml上清液入2ml离心管中；加入700μL氯仿后用力振荡，13000×g离心10min，转移上清液600μL到新的2ml离心管中;加入2倍体积的CTAB沉淀溶液颠倒数次后室温静置60min，13000×g离心10min，弃去上清，加入350μLNaCl溶液将沉淀进行悬浮，再加入350μL氯仿，涡旋振荡进行混匀，13000×g离心10min，转移上清后加入0.8倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000×g离心10min，弃去上清，加入500μL70％乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于50μLTE溶液中。
3.实时荧光PCR检测方法特异性验证
使用荧光探针Foc1-0422P1及引物Foc1-0422F1/Foc1-0422R1进行实时荧光PCR，共同检测香蕉串珠镰刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龙果枯萎病菌等镰刀菌属内近似种及镰刀菌属外青霉属。扩增试剂盒采用ABI试剂盒2×TaqManUniversalPCRMasterMixII。
实时荧光PCR反应体系如下：
| 试剂名称 | 体积 |
| TE缓冲液 | 8.25μL |
| 引物(上游) | 0.75μL |
| 引物(下游) | 0.75μL |
| 探针 | 0.25μL |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | 12.5μL |
| DNA模板(10-100ng/μL) | 2.5μL |
| 总体积 | 25μL |
仪器采用ABI7500荧光PCR仪，实时荧光定量PCR的反应参数为：50℃，5min；预变性94℃，3min；94℃，15s，55℃，1min，40个循环。
4.普通PCR灵敏度分析
使用荧光探针所用引物Foc1-0422F1/Foc1-0422R1进行普通PCR，FOC1的浓度梯度分别设置采用提取的质粒DNA（100ng/μL）进行1：10系列稀释，分别为1、1：10、1：100、1：1000、1：10000、1：1000000、1：10000000、1：100000000等八个点，各为三重复。采用TAKARAExTaqPCR扩增试剂盒，反应体系参照试剂盒说明进行,预期扩增片段为100bp。反应条件如下:94℃预变性3min;94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸20s,25个循环;最后72℃延伸10min。
5.单管双重实时荧光PCR灵敏度分析
稀释梯度设计同普通PCR。采用提取的质粒DNA（100ng/μL）进行1：10系列稀释，分别为1、1：10、1：100、1：1000、1：10000、1：1000000、1：10000000、1：100000000等八个点，各为三重复。反应体系及参数设置同上。每样品设三个平行反应,并设置阴性对照与空白对照。利用ABI7500型荧光定量PCR仪自带软件进行结果分析,扩增曲线及样品Ct值由软件自动生成。以Ct值35为判断结果阴阳性的阈值。根据标准扩增Ct值得出线形方程，再由待测样品所测得的Ct值即可计算出模板初始浓度。
6.定量检测菌含量（拷贝数）计算公式
假定双链DNA的分子量为660Da,拷贝数计算公式如下：
7.检测重复性评价
批内变异性采用检测低限模板浓度0.00001ng/μL，每个反应体系含有模板1μL，在一块96孔板上进行一次荧光PCR过程，每次各8个孔的重复，对所得的Ct值进行分析，计算FOC1的变异系数；批间变异性采用模板浓度0.000001ng/μL，每个反应体系含有模板1μL，分为21天进行，每隔两天进行一次PCR过程，每次各3个孔的重复，对所得的Ct值进行分析，计算FOC1的变异系数。
本发明设计了尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种的实时荧光PCR定量引物；提供了标准定量检测体系。达到了如下效果：
1.荧光PCR特异性验证
荧光PCR检测结果显示(如图1所示)：FOC1样品出现明显扩增信号且曲线平滑，其余近似种及属外样品未出现扩增信号。故单管双重荧光PCR体系能够在香蕉串珠镰刀菌、冬瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌和甜瓜枯萎病菌、火龙果枯萎病菌等镰刀菌属内近似种及镰刀菌属外青霉属共同检测时，特异性地检测到FOC1,所见FOC1引物和探针的扩增曲线平滑，而作为阴性对照的健康巴西蕉根组织、球茎组织、假茎组织和叶组织未检测到荧光信号。
2.FOC1探针引物的灵敏度
质粒DNA的PCR产物电泳结果显示（如图2a所示）：克隆质粒DNA10-2-10-5四个稀释度检测到了100bp目的条带，而10-6-10-8三个稀释度未见目的条带，故普通PCR检测质粒DNA灵敏度的低限达到10-5稀释度，即0.001ng。
同上采用相同的稀释度和重复数，经单管双重荧光PCR灵敏度测试，质粒DNA的荧光PCR结果显示（如图2b所示）：质粒DNA10-4-10-7四个稀释度的平均Ct值均小于35（见表1），判为阳性，而质粒DNA10-8-10-10三个稀释度的平均Ct值均大于35（见表1），判为未检出。故检测灵敏度的低限达到10-7稀释度，即0.00001ng，91258个拷贝数，较普通PCR引物高100倍。
为了定量分析待检模板的初始浓度，根据每个反应管测定的Ct值（见表1）与管中所含模板浓度之间的对应关系，应用EXCEL软件统计分析，绘制成标准曲线，得到FOC1荧光检测质粒DNA的标准曲线（如图2所示）的线性方程：Y=-3.593logX+50.49（Y为Ct值,X为模板拷贝数）,相关系数R2=0.999，扩增效率Eff%=89.81。从结果可以看出标准曲线的线性关系良好，可以准确的计算出模板浓度。
3.重复性评价
检测结果显示：批内变异性(Intra-assayvariation)的各处理（见表2）中，变异系数为1.03%；批间变异性（Inter-assayvariation）各处理中，1-21天，FOC1变异系数（见表2）第3天最高为4.83%，第18天最低为0.83%。无论是批内变异性，还是批间变异性，变异系数CV值均小于5%，说明该体系变异性小，稳定性好。同时也验证了低浓度处理（检测低限）的检测结果具有较高的重复性，实验结果均为阳性，且超低浓度处理（检测低限稀释10倍）未出现假阳性的情况。
表1单管双重探针的灵敏度检测Ct值
表2批内变异性分析
表3FOC1批间变异性分析
附图说明
图1：荧光PCR特异性检测图；
图2：FOC1引物普通PCR及荧光PCR灵敏度检测图（质粒DNA），：a为质粒DNA的PCR产物电泳结果显示；b为质粒DNA的荧光PCR结果显示；其中M：DL2000Marker；1：10-2；2：10-3；3：10-4；4：10-5；5：10-6；6：10-7；7：10-8；8：10-9；9：10-10；10：N；
图3：探针检测质粒DNA标准曲线；
图4：双重实时荧光PCR检测应用，其中1：粉蕉；2：巴西蕉；3：巴西蕉；4：粉蕉；5-8：巴西蕉。
具体实施方式
1、用FOC1和FOC4分生孢子5×106孢子液分别伤根接种广粉一号粉蕉各20株，接种14天后分别观察症状，两组接种植株见维管束变黑，叶片变黄。从症状上看，叶片的变黄程度接种FOC1的要重于接种FOC4的。取有发病症状的球茎组织进行TaqMan探针法单管双重实时荧光PCR检测，比较FOC1病菌在球茎中的含量与FOC4病菌的拷贝数差异。结果显示：FOC1接种的假茎检测到FOC1的平均Ct值为28.74，拷贝数达1130934；FOC4接种的假茎检测到FOC4的平均Ct值为34.22，拷贝数达31653。因此，接种粉焦14天后，FOC1病菌在粉蕉球茎中的含量要高于FOC4病菌，且前者含量约为后者的36倍。
2、采集田间发病广粉一号粉蕉30株，经普通PCR方法检测和TaqMan探针法单管双重实时荧光PCR检测，以比较感染FOC1大田粉蕉植株根、球茎、假茎、叶中菌含量差异。采自发病广粉一号粉蕉30株，症见维管束变黑，叶片变黄凋萎。经普通PCR方法检测发现为FOC1感染，对其进行TaqMan探针法单管双重实时荧光PCR检测，结果显示：根中检测平均Ct值为33.22，拷贝数约为64057；球茎中平均Ct值为38.14，拷贝数为2737；假茎和叶片中未见扩增信号，判定为未检出。因此，在大田中，根中的FOC1病菌含量要高于球茎中的，且前者含量约为后者的23倍。
3、采集田间8类共80株代表性香蕉根组织样品，并使用所建立的荧光PCR方法，对所采集的根组织样品提取的总DNA进行单管多重荧光PCR定性检测，每样品设三个平行反应,并设置阴性对照与空白对照。
田间样品症状观察结果：1号样品采自发病广粉一号粉蕉，症见维管束变黑，叶片变黄凋萎；2号样品采自重症发病巴西蕉,症见维管束变黑，叶片变黄；3号样品采自发病初期巴西蕉，症见维管束变黑，叶片变黄；4号样品采自未发病广粉一号粉蕉，无症；5-8号样品采自无症巴西蕉。
对大田中所采代表性香蕉样品进行TaqMan探针法单管双重实时荧光PCR检测，结果显示（如图4所示）：1号样品检测为FOC1和FOC4复合侵染，2号样品检测为FOC4侵染，3号样品检测为FOC4侵染，4号样品检测为FOC1侵染，5－8号样品未检出。因此，采用单管双重荧光PCR方法，可以在一个反应体系内同时检出两个小种，也可以分别检出两个小种；同时，该方法还能够检测到无症处于发病早期香蕉根组织中的病原菌，具有比普通PCR更高的灵敏度。
本方案中的探针的荧光标记可以用同类标记物替代，如Cy5可以用5'-Biotin、5'-Cy3、5'-Digoxin、5'-FAM、5'-HEX、5'-JOE、5'-ROX、5'-TAMRA、5'-Amino、5'-Phosphorylation、5'-ROX、5'-SHC6、5'-SIMA(HEX)、5'-TET等5'荧光标记物替代；BHQ3可以用3'-JOE、3'-BHQ1、3'-BHQ2、3'-ROX、3'-TAMRA、3'-Biotin、3'-BiotinTEG、3'Dabcyl、3'Dabsyl、3'-TET、3'-Digoxin、3'-Amino、3'-diThiol、3'-Eclipse、3'-FAM、3'-HEX、3'-Phosphorylation、3'-SHC6、3'-SHC3等3'荧光标记物替代。替代后可以达到同样的检测效果。
本发明创新点在于：
(1)用实时荧光PCR方法成功定性检测了香蕉枯萎病菌（尖镰孢属古巴专化型的1号生理小种）；
(2)用实时荧光PCR方法成功定量检测了香蕉枯萎病菌（尖镰孢属古巴专化型的1号生理小种）。
(3)本套引物和探针能够配合其它生理小种TaqMan荧光检测引物进行双重或多重荧光PCR定量检测尖镰孢属古巴专化型的菌含量（拷贝数）。
Claims (4)
1.一种检测尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种(Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace1)的TaqMan引物和探针，其中，所述的引物序列为：上游引物Foc1-0422F15’-AGGTGAGAAATCTGTTGAGTCTCGAT-3’，下游引物Foc1-0422R15’-AACTCCTTCACCAGCCTTTCG-3’，探针为5’荧光标记，3’淬灭剂标记的DNA序列，所述的序列为：Foc1-0422P15’-荧光剂-AGCATGGCAGGTCGT-淬灭剂-3’。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其中所述的荧光剂选自Cy3、Cy5、FAM、HEX、JOE、ROX、TAMRA、ROX、SHC6、SIMA(HEX)、TET。
3.根据权利要求1所述的引物和探针，其中所述的淬灭剂选自JOE、BHQ1、BHQ2、ROX、BHQ3、TAMRA、Biotin、Dabcyl、Dabsyl、TET、Digoxin、Amino、diThiol、Eclipse、FAM、HEX、Phosphorylation、SHC6、SHC3。
4.如权利要求1所述的引物和探针，其中所述的探针为Foc1-0422P15’FAM-ATAATCGAACAGTTTGCG-BHQ33’。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20160224 Termination date: 20170109 |