CN114480700B - 一种检测鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的pcr引物、方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测鉴定香蕉枯萎病菌1号(Foc1)和4号生理小种(Foc4)的PCR引物、方法及其应用。所述PCR引物包括上游引物和下游引物，其序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。本发明的PCR引物可特异性扩增出Foc1和Foc4的不同基因片段，可直接通过扩增长度去判断该病菌是何种生理小种，该引物扩增检测的准确性高、灵敏度高、特异性强、重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定Foc的生理小种情况，可用于大量样品的检测。

Description

一种检测鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的PCR引物、方 法及应用

技术领域

本发明涉及植物病原检测技术领域，更具体地，涉及一种检测鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的PCR引物、方法及其应用。

背景技术

香蕉枯萎病(Fusarium wilt)，又称巴拿马病或黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense，Foc)引起的一种土传维管束病害。香蕉枯萎病的潜伏期较长，而且不同的香蕉品系对香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的抗性不同，因此探索快速、准确且全面检测1号和4号生理小种的香蕉枯萎病菌检测技术，对于防止病害的传播蔓延、及早采取防治对策具有重要的理论意义和应用价值。

尖孢镰刀菌古巴专化型是一种死体营养型病原菌，属于半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目镰刀菌属Fusarium。根据Foc对不同香蕉品种类型的致病力的差异，可将其分为3个生理小种，即1号(Foc1)、2号(Foc2)和4号(Foc4)生理小种。其中，Foc1分布广泛，主要能侵染香蕉的栽培种‘大蜜哈’(Gros michel，AAA)、‘粉蕉’(Fenjiao，ABB)、‘龙牙蕉’(Musa，AAB)和‘矮香蕉’(Dwarf cavendish，AAA)，并曾经导致‘大蜜哈’的绝产；Foc2只侵染三倍体杂种‘棱香蕉’(Bluggoe，ABB)，不侵染‘大蜜哈’，主要分布在中美洲；Foc4则几乎能侵染所有的香蕉品种，危害性最大。据不完全统计，Foc4在世界各香蕉主产区均已发现，包括澳大利亚、中国、印度尼西亚、菲律宾、美洲等国家和地区；并在世界范围内逐渐由发病区向非病区扩展，已成为世界香蕉产业发展的一个重要障碍。

Foc1和Foc4主要采用寄主范围不同进行区分，Foc1能感染粉蕉，而Foc4可以感染粉蕉及巴西蕉。但近年来，研究表明通过将Foc1人为接种巴西蕉，该病菌虽然没有造成发病，但也能在植物体内存活；而在粉蕉上分离到的病原菌可能是Foc1也可能是Foc4。目前香蕉枯萎病的检测技术主要是针对Foc4的，也有人设计两对引物进行生理小种的双重PCR检测区分(李敏慧,余雄涛,王鸿飞,等.香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定[J].中国农业科学,2012,45(19):3971-3979.)。然而，双重或多重PCR检测方法，即在同一PCR反应中添加两对或多对引物，从而同时检测不同靶标序列，但两对或多对引物之间很容易相互干扰，而出现杂带或引物二聚体，影响结果的判断。因此，寻找可以检测不同生理小种的单对引物，一方面可以快速区分Foc1和Foc4，也可以很大程度上弥补了多重PCR检测的弊端。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种快速检测与鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的普通PCR引物。

本发明的第二个目的在于提供所述PCR引物在快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种快速检测与鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的方法。

本发明的第四个目的在于提供所述PCR引物在制备快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种的产品中的应用。

本发明的第五个目的在于提供一种用于快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种的试剂盒。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种快速检测与鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的PCR引物，包括上游引物unique-F和下游引物unique-R，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示：

unique-F：5’-TGCTGCTCAATCATCAGAC-3’(SEQ ID NO.1)

unique-R：5’-CATGCCCTTCATCATCAGG-3’(SEQ ID NO.2)。

本发明通过对香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种不同菌株的全基因组序列进行分析分别获得稳定遗传的保守序列，寻找到了两小种间仅基因长度有明显差异但基因高度相似的序列，并以此为靶序列进行大量的引物设计和筛选，最终筛选得到一对特异引物unique-F/unique-R。利用该特异引物unique-F/unique-R可特异性扩增出Foc1和Foc4的不同基因片段，可直接通过扩增长度去判断该病菌是何种生理小种，该引物扩增检测的准确性高、灵敏度高、特异性强、重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定Foc的生理小种情况，可用于大量样品的检测。

本发明还提供所述PCR引物在快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种中的应用。

本发明还提供一种快速检测与鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的方法，包括如下步骤：

S1.提取待测样品基因组DNA；

S2.以步骤S1所述基因组DNA为模板，利用上述PCR引物unique-F/unique-R进行PCR扩增反应；

S3.将步骤S2的PCR扩增产物进行电泳检测，若扩增得到一条带，则表明待测样品为香蕉枯萎病菌1号生理小种或含有香蕉枯萎病菌1号生理小种；若扩增得到两条带，则表明待测样品为香蕉枯萎病菌4号生理小种或含有香蕉枯萎病菌4号生理小种。

优选地，所述待测样本包括但不限于已经分离的病原菌或疑似发病香蕉植株等。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应体系为：2×Taq Master Mix 7.5μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O补充至15μL。

优选地，步骤S3所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；35个循环的95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min；72℃延伸10min。

本发明还提供所述PCR引物在制备快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种的产品中的应用。

优选地，所述产品包括但不限于试剂、试剂盒等。

本发明还提供一种用于快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种的试剂盒，所述试剂盒包含上述PCR引物unique-F/unique-R。

优选地，还包含PCR扩增所需试剂。

优选地，还包含待测样品基因组DNA提取所需试剂。

进一步优选地，所述采用所述试剂盒进行PCR扩增反应的体系为：2×Taq MasterMix 7.5μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O补充至15μL。

进一步优选地，所述采用所述试剂盒进行PCR扩增反应的程序为：95℃预变性3min；35个循环的95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min；72℃延伸10min。

本发明还提供上述任一所述剂盒在快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了可快速检测鉴定香蕉枯萎病菌Foc1和Foc4的PCR引物，所述PCR引物可特异性扩增出Foc1和Foc4的不同基因片段，可直接通过扩增长度去判断该病菌是何种生理小种，快速区分Foc1和Foc4；该引物扩增检测的准确性比现有已知的小种特异引物高、灵敏度高(可达4.82×10^-3～4.92×10^-3ng/μL)、特异性强、重复性好，可以准确、快速、高效地进行鉴定Foc的生理小种情况，可用于大量样品的检测。

附图说明

图1为筛选设计得到引物检测效果比较；其中，1-6为unique-F/unique-R引物扩增结果；7-12为other-F1/other-R1引物扩增结果；13-18为other-F2/other-R2引物扩增结果；其中1-3、7-9、13-15为4号生理小种不同菌株DNA；4-6、10-12、16-18为1号生理小种不同菌株DNA。

图2为Foc1普通PCR扩增结果。

图3为Foc4普通PCR扩增结果。

图4为Foc1普通PCR的灵敏度试验；其中1的DNA浓度为4.82×10¹ng/μL；2为4.82×10⁰ng/μL；3为4.82×10^-1ng/μL；4为4.82×10^-2ng/μL；5为4.82×10^-3ng/μL；6为4.82×10^{- 4}ng/μL；7为4.82×10^-5ng/μL。

图5为Foc4普通PCR的灵敏度试验；其中1的DNA浓度为4.92×10¹ng/μL；2为4.92×10⁰ng/μL；3为4.92×10^-1ng/μL；4为4.92×10^-2ng/μL；5为4.92×10^-3ng/μL；6为4.92×10^{- 4}ng/μL；7为4.92×10^-5ng/μL；8为4.92×10^-6ng/μL。

图6为不同Foc菌株的DNA进行PCR扩增重复性试验；其中A为本发明中unique-F/unique-R引物扩增结果；B为已知发表的4号生理小种特异引物(W2987F/W2987R)扩增结果；C为已知发表的1号生理小种特异引物(W1805F/W1805R)扩增结果；其中1-5为4号生理小种不同菌株DNA；6-11为1号生理小种不同菌株DNA。

图7为单对引物普通PCR特异性试验；其中1-2为提取的已接种4号生理小种的巴西蕉DNA；3为香蕉炭疽菌DNA；4为香蕉镰刀菌DNA；5为阳性对照1号生理小种DNA；6为阳性对照4号生理小种DNA；7-8为健康巴西蕉DNA。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

供试菌株来源：香蕉枯萎病菌1号生理小种和4号生理小种均为仲恺农业工程学院植物病理重点实验室经过鉴定与致病性测试保存菌株。

实施例1快速区分Foc1和Foc4的PCR引物的设计与筛选

根据实验室典型的、毒力较强的香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种两个菌株的全基因组序列进行比对，筛选得到两个菌株序列差异identity范围在60-80％，目的是初步缩小筛选范围得到两小种间相似但有一定差异的基因。根据上述初步得到的基因，分别与实验室其它Foc1、Foc4菌株再次比对筛选identity＞90％的基因，寻找两小种的保守基因，目的是确保筛选得到的基因在Foc1、Foc4的遗传分化中保持一定的稳定性，可以广泛应用于多种Foc菌株。统计两个菌株比对结果identity范围在60-80％的基因中，两菌株比对上的基因都为保守的基因，以这些基因作为优选。以上述为基础，设计并合成引物进行PCR扩增验证，设计得到如下三对引物：

unique-F：5’-TGCTGCTCAATCATCAGAC-3’；

unique-R：5’-CATGCCCTTCATCATCAGG-3’；

other-F1：5’-TGCCCATGGTCTGGCTGCTTTA-3’；

other-R1：5’-CCTGGGAAGAAAGGTGCTTC-3’；

other-F2：5’-AAGTCCTCTTCGAGAAAG-3’；

other-R2：5’-ACAAAAGTAGCATACTCCCCATG-3’；

其扩增检测结果如图1所示，unique-F/unique-R能在Foc1和Foc4中分别扩增出不同的条带，而引物other-F1/other-R1针对Foc1和Foc4中扩增的条带大小相似，无法有效区分Foc1和Foc4，而引物other-F2/other-R2则甚至无法有效扩增出Foc1和Foc4；初步表明PCR引物unique-F/unique-R可有效区分Foc1和Foc4。

因此经过多轮实验筛选后，获得稳定且特异的1对引物unique-F/unique-R，其序列信息如下所示：

unique-F：5’-TGCTGCTCAATCATCAGAC-3’(SEQ ID NO.1)

unique-R：5’-CATGCCCTTCATCATCAGG-3’(SEQ ID NO.2)。

所述引物unique-F/unique-R扩增的靶序列如下所示：

1号生理小种扩增片段(1个条带，643bp)：

TGCTGCTCAATCATCAGACGCAATTCCTGAGCCCAAGTCGTCGCCTGCTGCCAAGGTGGTGCAACCAAAGAAGCCCGCTCGTTTTGCGCTTGGTGGCTCTTGTTCGTCTAGTGAACAGGACCAGAGCCTCAGCAACAGCAAGCCCATCATTCCCATCATCAAGAAGCCCGTGTTCCAGATCGGCGGCTCCTCTGAAGAGGACGGCTCACTCAAGAGCGCCATGGCTTCATCACGGCCTGGCTCGCTCCTCTCTGCACGCAAGAAGCAGGCCTCGTTCAGCAACAATGTCATGACACGAACGATTGATGATGAGGCAGCTGTCGACTCAGATACCGACGACTACATCGACGAGAGCGCCATCGATGACGATGACGACTCTTCGGACTGGGAGGACTCGATGGAAGAGAGCGGCAAATCCAGCATGGACGACAAGTTCTTCCAGCGAGTGGATTCCAAGCCCAATTTGACCTCGCGACGATCGCTCATTACCCTCATGCTTGCCCAGAACGATCGCGCACGCACTCTTGGTAACCACGCTTCCCAATCGACTTCAGCCATTCCACGATCTCGTATGGCCCACGGCCCGTCACTGGGTGCCTCGCCTAATGACTCTGACGAGGCTCCCCTGATGATGAAGGGCATG

4号生理小种扩增片段(2个条带，分别为643bp，和433bp)：

TGCTGCTCAATCATCAGACGCAATTCCTGAGCCCAAGTCGTCGCCTGCTGCCAAGGTGGTGCAACCAAAGAAGCCCGCTCGTTTTGCGCTTGGTGGCTCTTGTTCGTCTAGTGAACAGGACCAGAGCCTCAGCAACAGCAAGCCCATCATTCCCATCATCAAGAAGCCCGTGTTCCAGATCGGCGGCTCCTCTGAAGAGGACGGCTCACTCAAGAGCGCCATGGCTTCATCACGGCCTGGCTCGCTCCTCTCTGCACGCAAGAAGCAGGCCTCGTTCAGCAACAATGTCATGACACGAACGATTGATGATGAGGCAGCTGTCGACTCAGATACCGACGACTACATCGACGAGAGCGCCATCGATGACGATGACGACTCTTCGGACTGGGAGGACTCGATGGAAGAGAGCGGCAAATCCAGCATGGACGACAAGTTCTTCCAGCGAGTGGATTCCAAGCCCAATTTGACCTCGCGACGATCGCTCATTACCCTCATGCTTGCCCAGAACGATCGCGCACGCACTCTTGGTAACCACGCTTCCCAATCGACTTCAGCCATTCCACGATCTCGTATGGCCCACGGCCCGTCACTGGGTGCCTCGCCTAATGACTCTGACGAGGCTCCCCTGATGATGAAGGGCATG

TGCTGCTCAATCATCAGACGCGATTCCTGAGCCTGAGTCATCGCCTGTGTCTAATGAACAGGGCCAGAGCCTCAGCAACAGCAAACTCAAAATAGAGGATGAGGCTCTTTTAGACTCGGATACCGACGACTACATCGACGAGGGCGCCATTGATGATGATGACGACTCTTCGGATTGGGAGGACGCGACGGAGGAGAGCGGCAAATCCAGCATGGACGATAAGTTCTTCCAGCGAGTGGATTCTAAGCCCAACTTGACCTCACGACGATCGCTCATTACCCTCATGCTTGCCCAGAATGATCGCGCACGCACTCTTGGTAACCACGCTTCTCAATCGACTTCAGCCATTCCACGATCTTGTATGGCCCACGTCCCATCATTGGGTGCCTCGCCTAATGATTCTGACGAGGCTCCCCTGATGATGAAGGGCATG

实施例2PCR引物检测Foc1和Foc4样本

1、DNA抽提：以改良的CTAB法分别抽提Foc1和Foc4的DNA；抽提所得DNA均用紫外分光光度计检测其纯度及浓度，以OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为1.8～2.0时最佳。

2、使用实施例1设计筛选得到的引物unique-F/unique-R进行扩增；

扩增反应体系为：2×Taq Master Mix 7.5μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O补充至15μL。

PCR反应过程为：95℃预变性3min；35个循环的95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min；72℃延伸10min。

3、扩增产物的鉴定：取步骤2的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR产物的扩增条带大小。结果如图2、3所示，在Foc1中检测出大约650bp的扩增条带，在Foc4中检测出两条大约650bp和450bp的扩增条带。

进一步地，回收阳性条带后将样品送至基因测序公司进行产物基因测序，根据测序反馈结果与实施例1中的靶序列进行比较。

实施例3 Foc1和Foc4 PCR引物的灵敏度检测

将实施例2提取得到的Foc1和Foc4的DNA，分别用ddH₂O将DNA模板按照10⁰，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5稀释浓度进行稀释，按照实施例2步骤2和3进行PCR扩增和检测，进行灵敏度检测。

电泳结果分别如图4、5所示，所述PCR引物unique-F/unique-R针对Foc1进行检测时，在10^-3的模板稀释度上仍然呈阳性反应，表明其敏感性较高，针对Foc1的最低检测模板浓度为4.82×10^-3ng/μL ng/μL(图4)；所述引物unique-F/unique-R针对Foc4进行检测时，在10^-3的模板稀释度上仍然呈阳性反应，表明其敏感性较高，针对Foc4的最低检测模板浓度为4.92×10^-3ng/μL(图5)，表明本发明PCR引物unique-F/unique-R针对Foc1和Foc4均具有较低的检测灵敏度。

实施例4 Foc1和Foc4 PCR引物的重复性检测

采用不同Foc菌株(仲恺农业工程学院植物病理重点实验室经过鉴定与致病性测试保存菌株)的DNA，按照实施例2步骤2和3进行PCR引物的重复性试验，同时选取已知发表的4号生理小种特异引物(W2987F/W2987R，李敏慧,余雄涛,王鸿飞,等.香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定[J].中国农业科学,2012,45(19):3971-3979.)及1号生理小种特异引物(W1805F/W1805R，李敏慧,余雄涛,王鸿飞,等.香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定[J].中国农业科学,2012,45(19):3971-3979.)进行重复性比较。结果如图6所示，PCR引物unique-F/unique-R针对不同来源的Foc菌株菌株，均可以扩增出目的条带，重复性好，而现有已知发表的4号生理小种特异引物W2987F/W2987R及1号生理小种特异引物W1805F/W1805R无法适用于不同来源的Foc菌株，重复性较差，且存在假阳性，表明本发明PCR引物unique-F/unique-R具有更好的重复检测性。

实施例5 Foc1和Foc4 PCR引物的特异性检测

采用已接种4号生理小种的巴西蕉、香蕉炭疽菌、香蕉镰刀菌、及健康巴西蕉的DNA，按照实施例2步骤2和3进行PCR引物的特异性试验。结果如图7所示，PCR引物unique-F/unique-R仅能在已接种4号生理小种的巴西蕉DNA、阳性对照1号生理小种DNA及阳性对照4号生理小种DNA中扩增出相应的特异性条带，而对于其它样本无法进行有效扩增。表明本发明PCR引物unique-F/unique-R具有良好的检测特异性。

序列表

<110> 仲恺农业工程学院

<120> 一种检测鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的PCR引物、方法及应用

<141> 2021-12-27

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctgctcaa tcatcagac 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catgcccttc atcatcagg 19

Claims (10)

1.一种快速检测与鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的PCR引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNO.2所示。

2.权利要求1所述PCR引物在快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种中的应用。

3.一种快速检测与鉴定香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品基因组DNA；

S2.以步骤S1所述基因组DNA为模板，利用权利要求1所述PCR引物进行PCR扩增反应；

S3.将步骤S2的PCR扩增产物进行电泳检测，若扩增得到一条带，条带大小为643bp，则表明待测样品含有香蕉枯萎病菌1号生理小种；若扩增得到两条带，条带大小分别为643bp和433bp，则表明待测样品含有香蕉枯萎病菌4号生理小种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应体系为：2×TaqMaster Mix 7.5μL，10μM上下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O补充至15μL。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S3所述PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min；35个循环的95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min；72℃延伸10 min。

6.权利要求1所述PCR引物在制备快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种的产品中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述产品为试剂盒。

8.一种用于快速检测与鉴定香蕉枯萎病1号和4号生理小种的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述PCR引物。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包含PCR扩增所需试剂。

10.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，还包含待测样品基因组DNA提取所需试剂。