CN114774410A - 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物，包括RPA上游引物、RPA下游引物、crRNA1引物和Univ引物，依次如SEQIDNO:1‑4所示；还提供了试剂盒，包括基于RPA‑CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物、Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、Cas12/13专用核酸检测试纸条；还提供了检测方法：用RPA上、下游引物建立RPA反应体系的建立，得到RPA反应产物，合成指导RNA的DNA模板，合成指导RNA，用RPA反应产物和指导RNA建立CRISPR/Cas12a反应体系，得到RPA‑CRISPR/Cas12a反应产物，用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测。本发明方法具有易于操作、快速灵敏、鉴定结果准确的特点。

Description

一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂 盒及检测方法
技术领域
本发明属于大丽轮枝菌检测技术领域，具体涉及一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂盒及检测方法。
背景技术
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)作为轮枝菌属中最具破坏性的菌种，可引起农业上重要的黄萎病，该病原菌寄主范围极广，可侵染660多种植物，涉及十字花科、蔷薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，对世界范围内的主要经济作物包括番茄、棉花、草莓、辣椒、生菜、向日葵等造成巨大产量损失。在中国，每年大约有250万公顷的棉花遭受该病原菌的侵染，对棉花产量造成重要影响。植物黄萎病隶属于植物维管束病害且为典型的土传病害，其病原菌的菌丝体可在维管束组织中定殖，阻塞导管水分运输，导致一系列发病症状，如植株矮小、生长发育不良、叶片萎蔫发黄、维管束变褐等。为应对不良环境条件，大丽轮枝菌在土壤中可产生黑褐色的休眠结构“微菌核”，该结构能够在土壤中存活长达10年。微菌核具有储藏养分和抵抗不良环境的能力，在遇到合适寄主或在适宜环境下会萌发产生菌丝起始侵染。当前研究表明每克土壤中含有1个微菌核即可造成作物产量损失。黄萎病属于单循环病害，大丽轮枝菌随寄主植物组织的坏死而产生大量微菌核散布在土壤中，这些微菌核可侵染下一季寄主植物造成积年流行病害。大丽轮枝菌在世界范围内均有分布，可通过几种不同的方式进行局部或远距离传播。病原体可随灌溉水或病菌土的转运造成短距离的传播；受病菌污染的种子或者组织材料可随种苗的调运而远距离传播。由于大丽轮枝菌造成的黄萎病已经是一个全球性的重要的病害，因此快速、灵敏的病原菌检测技术有助于该病害的综合防控。
目前，比较常用的鉴定方法包括两种，即以发病症状、病原菌形态学为基础的传统鉴定方法和基于目标基因的分子鉴定方法。传统的发病症状识别法需要从业人员具有过硬的病害识别、病原菌鉴别特殊识别能力和丰富的病害识别经验；而分子鉴定法所需的仪器价格昂贵，对操作人员的技术要求较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂盒及检测方法，该方法具有易于操作、快速灵敏、鉴定结果准确等特点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物，所述引物包括RPA上游引物、RPA下游引物、crRNA1引物和Univ引物；所述RPA上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述RPA下游引物的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；所述crRNA1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述Univ引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述大丽轮枝菌的的拉丁文为Verticillium dahliae。
本发明还提供了上述的基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物构建的用于鉴定大丽轮枝菌的试剂盒，所述试剂盒包括基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物、Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、Cas12/13专用核酸检测试纸条。
本实施例基于RPA-CRISPR/Cas12a的技术原理，选取大丽轮枝菌Gpd基因(GenbankNo.GU814082.1)为靶标序列并设计一对RPA引物(SEQ ID NO:1～2)，使用SEQ ID NO:3～4合成DNA模板，利用T7聚合酶体外转录合成指导RNA。其流程为首先利用一对RPA引物对靶标DNA进行快速扩增，该过程通常需要10～20分钟；随后以RPA反应为底物，利用Cas12a蛋白、体外合成指导RNA和FB探针进行裂解实验；将裂解后的反应液滴加到试纸条上，2～3分钟后观察试纸条颜色的变化。如果在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应。
本发明还提供了上述的基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物检测大丽轮枝菌的方法，该方法为：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、用RPA上游引物和RPA下游引物对S1中提取的待测样品的基因组DNA在温度为37℃条件下进行靶标DNA扩增反应10min～20min，得到RPA反应产物；
所述靶标DNA扩增反应的体系为：待测样品的基因组DNA 5μL、10μM的RPA上游引物2μL、10μM的RPA下游引物2μL、RPA反应酶(酶组分为重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶)3μL、RAPID缓冲液25μL、无酶水补足至50μL；
S3、用crRNA1引物和Univ引物对dNTP进行PCR扩增，得到指导RNA的DNA模板；
所述PCR扩增的体系为：10×Pfu Buffer 5μL、dNTP混合物4μL、crRNA1引物2μL、Univ引物2μL、4000U/mL的Pfu DNA聚合酶0.25μL、无酶水补足至50μL；所述dNTP混合物为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物，所述dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度均为2.5mM；
所述PCR扩增的反正程序为：94℃1min；94℃30s，56℃25s，72℃35s，30个循环；72℃1min；16℃保存；
S4、将S3中得到的指导RNA的DNA模板在温度为37℃的条件下反应1h～2h，进行体外转录，合成指导RNA；
所述体外转录合成的反应体系为：指导RNA的DNA模板5μL、RNA酶抑制剂1μL、10×Transcription Buffer 2μL、1000U/mL的T7 RNA聚合酶2μL、NTP混合物4μL、无酶水补足至20μL；所述NTP混合物为ATP、GTP、CTP和TTP的混合物；
S5、使用RPA反应产物和S4中得到的指导RNA建立RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，在温度为37℃的条件下反应15min～60min，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
所述RPA-CRISPR/Cas12a检测体系为：10×NEB CutSmart Buffer 6μL、1μM的Cas12a 6μL、300nM的指导RNA 18μL、无酶水26μL、1μM的FB探针2μL、RPA反应产物2μL；
所述FB探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述FB探针进行5’-异硫氰酸荧光素FITC和3’-生物素biotin的修饰；
即FB探针：5’FAM-TTATTAAT-3’Bio；
S6、将S5中得到的RPA-CRISPR/Cas12a反应产物用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测，2分钟～3分钟后观察所述Cas12/13专用核酸检测试纸条检测的测试线的颜色变化；当测试线(T)和质控线(C)颜色变深，则为阳性反应；当只有质控线(C)变色，测试线(T)处无颜色变化，则为阴性反应。
所述Cas12/13专用检测试纸条市购，购于乐尚生物科技有限公司。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、特异性强。可实现大丽轮枝菌Verticillium dahliae的精准、快速鉴定。
2、灵敏度高。本发明对大丽轮枝菌的检测灵敏度极高，每个反应可检测低至10个基因组拷贝数。
3、结果准确。本发明通过RPA引物扩增和Cas12a-指导RNA的靶向裂解，两步均具有检测特异性，确保检测结果的准确性和可靠性。
4、实用性好。本发明通过一次合成体外指导RNA，即可长期使用，且整个检测技术方法只需要在恒温(37℃)条件下进行短时间反应，不需要贵重仪器设备，结果可直接通过试纸条反应来判断，整个检测流程<1小时，能快速准确地检测出病原菌，可用于大丽轮枝菌的田间鉴定，也可用于进出口岸对种子及土壤的检测。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明的大丽轮枝菌的RPA-CRISPR/Cas12a的特异性测试图。
图2是本发明的大丽轮枝菌的RPA-CRISPR/Cas12a的灵敏性测试图。
图3是本发明的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法在检测带菌土壤测试图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物，所述引物包括RPA上游引物、RPA下游引物、crRNA1引物和Univ引物；所述RPA上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述RPA下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述crRNA1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述Univ引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述大丽轮枝菌的的拉丁文为Verticillium dahliae；
其中RPA上游引物、RPA下游引物是通过比较大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其它近缘轮枝菌种的Gpd基因序列，在大丽轮枝菌的特异性区域，设计了两条大丽轮枝菌特异性的RPA引物SEQ ID NO:1～2，并进行序列合成的。
根据RPA扩增的特异性区间和CRISPR/Cas12a指导RNA的PAM模式(TTTN)，筛选～20nt靶标位点，并设计指导RNA引物(crRNA1引物和Univ引物)SEQ ID NO:3～4。
本实施例还提供了上述的基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物构建的用于鉴定大丽轮枝菌的试剂盒，所述试剂盒包括基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物、Cas12蛋白(市购，购于NEB公司)、T7转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、Cas12/13专用核酸检测试纸条。
本实施例基于RPA-CRISPR/Cas12a的技术原理，选取大丽轮枝菌Gpd基因(GenbankNo.GU814082.1)为靶标序列并设计一对RPA引物(SEQ ID NO:1～2)，使用SEQ ID NO:3～4合成DNA模板，利用T7聚合酶体外转录合成指导RNA。其流程为首先利用一对RPA引物对靶标DNA进行快速扩增，该过程通常需要10～20分钟；随后以RPA反应为底物，利用Cas12a蛋白、体外合成指导RNA和FB探针进行裂解实验；将裂解后的反应液滴加到试纸条上，2～3分钟后观察试纸条颜色的变化。如果在试纸条的测试条带上出现颜色变化，即为阳性反应。
本实施例还提供了上述的基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物检测大丽轮枝菌的方法，该方法为：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
取适量的待测样品放入2mL离心管中，并加入600μL的DNA裂解液(0.1M Tris-HCl，50mM EDTA,0.5M NaCl,5mM SDS,pH 7.0)，加入两颗直径大小为5mm的小钢珠，40Hz震荡30秒，15000rpm离心5分钟，取上清并使用无水乙醇沉淀，12000rpm离心10分钟，移除上清液，加入100μL无酶水，得到基因组DNA的提取物；
S2、RPA反应体系的建立：用RPA上游引物和RPA下游引物对S1中提取的待测样品的基因组DNA在温度为37℃条件下进行靶标DNA扩增反应10min，得到RPA反应产物；
所述靶标DNA扩增反应时间可以为10min～20min；
所述靶标DNA扩增反应的体系为：待测样品的基因组DNA 5μL、10μM的RPA上游引物2μL、10μM的RPA下游引物2μL、RPA反应酶(酶组分为重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶)3μL、RAPID缓冲液25μL、无酶水补足至50μL；
S3、crRNA(指导RNA)的DNA模板合成：用crRNA1引物和Univ引物对dNTP进行PCR扩增，得到指导RNA的DNA模板；
所述PCR扩增的体系为：10×Pfu Buffer 5μL、dNTP混合物4μL、crRNA1引物2μL、Univ引物2μL、4000U/mL的Pfu DNA聚合酶0.25μL、无酶水补足至50μL；所述dNTP混合物为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物，所述dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度均为2.5mM；
所述PCR扩增的反正程序为：94℃预变性1min；94℃变性30s，56℃退火25s，72℃延伸35s，30个循环；72℃延伸1min；16℃保存；
S4、crRNA的体外合成：将S3中得到的指导RNA的DNA模板在温度为37℃的条件下反应1h，进行体外转录，合成指导RNA；
体外转录的反应时间可以为1h～2h；
所述体外转录合成的反应体系为：指导RNA的DNA模板5μL、RNA酶抑制剂1μL、10×Transcription Buffer 2μL、1000U/mL的T7 RNA聚合酶2μL、NTP混合物4μL、无酶水补足至20μL；所述NTP混合物为ATP、GTP、CTP和TTP的混合物；
S5、CRISPR/Cas12a反应体系的建立：使用RPA反应产物和S4中得到的指导RNA建立RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，在温度为37℃的条件下反应15min，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
反应时间可以为15min～60min；
所述RPA-CRISPR/Cas12a检测体系为：10×NEB CutSmart Buffer 6μL、1μM的Cas12a 6μL、300nM的指导RNA 18μL、无酶水26μL、1μM的FB探针2μL、RPA反应产物2μL；
所述FB探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述FB探针进行5’-异硫氰酸荧光素FITC和3’-生物素biotin的修饰；
即FB探针：5’FAM-TTATTAAT-3’Bio；
S6、检测结果的分析与判断：将S5中得到的RPA-CRISPR/Cas12a反应产物用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测，2分钟～3分钟后观察所述Cas12/13专用核酸检测试纸条检测的测试线的颜色变化；当测试线(T)和质控线(C)颜色变深，则为阳性反应；当只有质控线(C)变色，测试线(T)处无颜色变化，则为阴性反应。
所述Cas12/13专用检测试纸条市购，购于乐尚生物科技有限公司。
(1)大丽轮枝菌的RPA-CRISPR/Cas12a的特异性测试
按照本实施例的RPA-CRISPR/Cas12a的检测方法，依次对4个近缘轮枝菌属的不同种(V.nigrescens、V.nubilum、V.alfalfa和V.tricorpus)、枯萎病菌(F.oxysporum)和大丽轮枝菌(V.dahliae)进行检测，同时以清水为阴性对照；V.dahliae即为Verticilliumdahliae；
测试结果：如图1所示，只有大丽轮枝菌的样品出现阳性反应，其它近缘种、枯萎病菌和清水对照均为阴性反应。该结果说明本发明提供的引物及其方法对大丽轮枝菌具有很高的特异性，能很好地将其与近缘菌种区分。图1中N代表为阴性反应；P代表为阳性反应；C代表检测反应的控制线；T代表检测反应的测试线；Water代表清水对照；V.nigrescens、V.nubilum、V.alfalfa和V.tricorpus为近缘轮枝菌属的不同种；F.oxysporum为枯萎病菌；V.dahliae为大丽轮枝菌；
(2)大丽轮枝菌的RPA-CRISPR/Cas12a的灵敏性测试
按照本实施例的RPA-CRISPR/Cas12a的检测方法，将待测大丽轮枝菌的基因组拷贝数依次稀释到1、10、100、1000、10000和100000个每微升，分别以其为模板进行RPA-CRISPR/Cas12a反应，每个反应中加入1μL DNA模板。
测试结果：如图2所示，样品101-105反应结果都为阳性，样品100反应为阴性，则说明本发明对大丽轮枝菌基因组的极限检测拷贝数低至10个拷贝，灵敏度极高。
图2中N代表为阴性反应；P代表为阳性反应；C代表检测反应的控制线；T代表检测反应的测试线；纵坐标100-105代表每个反应中检测的基因组拷贝数；横坐标代表了矫正后的测试线信号强弱。
(3)RPA-CRISPR/Cas12a技术在检测带菌土壤的应用
将4份带有大丽轮枝菌的土壤分别作为待测样品，且以健康土壤为对照，利用本发明对带菌土壤进行检测。
测试结果：如图3所示，4个待测样品的检测均显示阳性反应，在试纸条的测试条带处出现颜色变化，而健康土壤样品显示阴性反应。本示例显示本发明对大丽轮枝菌具有较好的检测效果，可在复杂样品中快速、准确地检测病原菌，具有较好的应用前景。
图3中N代表为阴性反应；P代表为阳性反应；C代表检测反应的控制线；T代表检测反应的测试线；1-4号为带菌(大丽轮枝菌)土壤，5号为健康土壤。
本实施例的检测方法特异性强。本发明通过比对大丽轮枝菌和几个近缘轮枝菌的Gpd基因序列，获得大丽轮枝菌的特异性区间以及特异性靶标位置，可实现大丽轮枝菌的精准、快速鉴定。
本实施例的检测方法灵敏度高。本发明对大丽轮枝菌的检测灵敏度极高，每个反应可检测低至10个基因组拷贝数。
本实施例的检测方法结果准确。本实施例通过RPA引物扩增和Cas12a-指导RNA的靶向裂解，两步均具有检测特异性，确保检测结果的准确性和可靠性。
本实施例的检测方法实用性好。本发明通过一次合成体外指导RNA，即可长期使用，且整个检测技术方法只需要在恒温(37℃)条件下进行短时间反应，不需要贵重仪器设备，结果可直接通过试纸条反应来判断，整个检测流程<1小时，能快速准确地检测出病原菌，可用于大丽轮枝菌的田间鉴定，也可用于进出口岸对种子及土壤的检测。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 西北农林科技大学 西安黄氏生物工程有限公司
<120> 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物和试剂盒及检测方法
<130> 2022.4.20
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
cttcattgag accaagtacg ctgtaagtaa cc 32
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
cagttgtcgt gaaggggtca tcttgactgc 30
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 3
gaaccccagc acatgataga atctacactt agtagaaatt a 41
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 4
taatacgact cactataggt aatttctact aagtgtagat 40
<210> 5
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 5
ttattaat 8

Claims (3)

1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物，其特征在于，所述引物包括RPA上游引物、RPA下游引物、crRNA1引物和Univ引物；所述RPA上游引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示；所述RPA下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述crRNA1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述Univ引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述大丽轮枝菌的的拉丁文为Verticillium dahliae。
2.一种如权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物构建的用于鉴定大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物、Cas12蛋白、T7转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、Cas12/13专用核酸检测试纸条。
3.一种如权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a检测大丽轮枝菌的引物检测大丽轮枝菌的方法，其特征在于，该方法为：
S1、提取待测样品的基因组DNA；
S2、用RPA上游引物和RPA下游引物对S1中提取的待测样品的基因组DNA在温度为37℃条件下进行靶标DNA扩增反应10min～20min，得到RPA反应产物；
所述靶标DNA扩增反应的体系为：待测样品的基因组DNA 5μL、10μM的RPA上游引物2μL、10μM的RPA下游引物2μL、反应酶3μL、RAPID缓冲液25μL、无酶水补足至50μL；
S3、用crRNA1引物和Univ引物对dNTP进行PCR扩增，得到指导RNA的DNA模板；
所述PCR扩增的体系为：10×Pfu Buffer 5μL、dNTP混合物4μL、crRNA1引物2μL、Univ引物2μL、4000U/mL的Pfu DNA聚合酶0.25μL、无酶水补足至50μL；所述dNTP混合物为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物，所述dATP、dGTP、dCTP和dTTP的浓度均为2.5mM；
所述PCR扩增的反正程序为：94℃1min；94℃30s，56℃25s，72℃35s，30个循环；72℃1min；16℃保存；
S4、将S3中得到的指导RNA的DNA模板在温度为37℃的条件下反应1h～2h，进行体外转录，合成指导RNA；
所述体外转录合成的反应体系为：指导RNA的DNA模板5μL、RNA酶抑制剂1μL、10×Transcription Buffer 2μL、1000U/mL的T7 RNA聚合酶2μL、NTP混合物4μL、无酶水补足至20μL；所述NTP混合物为ATP、GTP、CTP和TTP的混合物；
S5、使用RPA反应产物和S4中得到的指导RNA建立RPA-CRISPR/Cas12a检测体系，在温度为37℃的条件下反应15min～60min，得到RPA-CRISPR/Cas12a反应产物；
所述RPA-CRISPR/Cas12a检测体系为：10×NEB CutSmart Buffer 6μL、1μM的Cas12a 6μL、300nM的指导RNA 18μL、无酶水26μL、1μM的FB探针2μL、RPA反应产物2μL；
所述FB探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述FB探针进行5’-异硫氰酸荧光素FITC和3’-生物素biotin的修饰；
S6、将S5中得到的RPA-CRISPR/Cas12a反应产物用Cas12/13专用核酸检测试纸条检测，2分钟～3分钟后观察所述Cas12/13专用核酸检测试纸条检测的测试线的颜色变化；当测试线和质控线颜色变深，则为阳性反应；当只有质控线变色，测试线处无颜色变化，则为阴性反应。
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