CN110863058B

CN110863058B - 用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的rpa引物及其应用

Info

Publication number: CN110863058B
Application number: CN201911236650.5A
Authority: CN
Inventors: 高波; 马娟; 李秀花; 王容燕; 陈书龙
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN110863058A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的RPA引物组，所述的RPA引物组包括由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的引物，以及由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的探针。还公开了含有上述引物组的检测试剂盒，以及利用上述引物组鉴定马铃薯腐烂茎线虫的恒温荧光扩增检测方法。本发明提供的RPA引物组及其检测方法对马铃薯腐烂茎线虫的检测具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、反应温度低、操作简单、成本低等优点，能满足口岸检疫和现场实时检测的需要。

Description

用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的RPA引物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的RPA引物；还涉及该RPA引物的应用。

背景技术

马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor；别名：马铃薯茎线虫、马铃薯腐烂线虫、腐烂茎线虫或甘薯茎线虫等)是重要的迁移性植物内寄生线虫，该线虫主要为害植物地下部，尤其是块根、块茎和球茎等。该线虫不仅对马铃薯为害非常严重，而且对甘薯也造成严重为害，甚至是毁灭性的为害，如我国多个省市的该线虫甘薯发病田块一般可造成减产10％～30％，重则达50％～60％，甚至绝产无收，因而对甘薯的为害更为严重；此外，该线虫的寄主还包括胡萝卜、人参、小麦、玉米、花生等90多种植物，其为害范围广。马铃薯腐烂茎线虫也因此成为重要的检疫性线虫。对马铃薯腐烂茎线虫进行准确、快速的鉴定是对其进行有效防治和口岸检疫的基础。

传统的马铃薯腐烂茎线虫鉴定主要依靠形态学的方法，但由于线虫的有效鉴别特征不多，且许多表型特征不稳定，使得此方法的鉴定过程繁琐，且鉴定结果常常会有一定的主观性，难以获得可靠的鉴定结果。随着分子生物学的发展，利用分子手段来鉴定线虫已获得广泛的应用。其中基于PCR扩增技术开发的鉴定方法较为常见，一般利用线虫的核糖体DNA的基因间隔区序列(rDNA-ITS)，或者28S核糖体DNA的D2D3区序列(28S rDNA-D2D3)进行线虫种类鉴定。基于以上两基因序列已将马铃薯腐烂茎线虫鉴定分为A～G型7个群体，并设计开发了一系列PCR特异性检测引物(宛非等，植物病理学报，2008，38(3)：263-270；于海英等，植物病理学报，2009，39(3)254-261；CN1763193A；CN103740857A)。虽然PCR扩增技术具有灵敏度高、特异性强、准确高效等诸多优点，但是该技术对于仪器设备、实验环境以及操作人员的素质要求较高，另外还具有成本高，耗时长，无法实现现场检测等弊端，使其应用受到很大限制。

近年来，恒温扩增技术的开发利用弥补了PCR技术存在的弊端，在马铃薯腐烂茎线虫检测上应用的主要是环介导等温扩增技术(LAMP)，如专利CN102260746A和CN107988383A以及Ding Shanwen等(Eur J Plant Pathol(2019)153(4)：1165-1175)等，均为基于LAMP技术开发的马铃薯腐烂茎线虫的恒温扩增检测技术，可在65℃恒温50min完成检测，该技术具有对仪器设备要求较低、灵敏度高、操作简便、检测速度快等优点；但是，其反应体系需要6条引物，存在引物设计复杂，引物合成比较麻烦，且易出现假阳性等缺点，使其应用受到一定限制。因此，为满足口岸检疫和现场实时快速检测的需要，亟待开发一种准确、快速、操作简单且对仪器设备要求低的马铃薯腐烂茎线虫检测方法。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种新型的恒温扩增技术，该技术只需一对30bp～35bp的引物，在25～42℃的恒温下扩增反应5～20min，即可完成检测。其具有特异性强、灵敏度高、检测速度快、操作简便等优点，可以满足口岸检疫和现场实时检测等快速检测的要求。目前，RPA技术已广泛应用于病原物和转基因作物的快速检测等领域。该方法也已用于对根结线虫的检测(CN109486960A；CN108559783A)。但是，尚未发现该方法用于马铃薯腐烂茎线虫检测的报道。

发明内容

针对现有PCR技术以及LAMP恒温扩增技术存在的缺陷，本发明目的在于提供利用RPA方法实现对马铃薯腐烂茎线虫实时快速检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供一种用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的RPA引物组，所述的引物组由DtITS-F4和DtITS-R1组成；其中所述的DtITS-F4由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；所述的DtITS-R1由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；其具体序列如下：

DtITS-F4：5′-GAAACGGTACGTGGTTTTCGTAATCGCGAGAG-3′(SEQ ID No.1)，

DtITS-R1：5′-CAAGAGGCTGCACAAGAAACACGCGCTAGGCC-3′(SEQ ID No.2)。

本发明还提供了上述RPA引物组在鉴定马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

本发明还提供了上述用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的RPA引物组，还包括探针DtITS-Ps2，所述的DtITS-Ps2由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。DtITS-Ps2序列如下：

5′-TTATCCTTTGGCACGTCTGATTCAGGGTCG-FAMdT-A-THF-A-BHQ1dT-ACAAAACCCCAAGCT-C3 Spacer-3′(SEQ ID No.3)；

其中，FAM-dT为携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸；THF为四氢呋喃；BHQ1-dT为携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸；C3-Spacer在3′末端引入间臂用于阻止链的延伸。

本发明还提供了一种马铃薯腐烂茎线虫的检测试剂盒；所述的试剂盒包含上述RPA引物组；所述的引物组包括引物DtITS-F4和DtITS-R1，以及探针DtITS-Ps2；其中所述的DtITS-F4由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；所述的DtITS-R1由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；所述的DtITS-Ps2由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成；

DtITS-F4：5′-GAAACGGTACGTGGTTTTCGTAATCGCGAGAG-3′(SEQ ID No.1)，

DtITS-R1：5′-CAAGAGGCTGCACAAGAAACACGCGCTAGGCC-3′(SEQ ID No.2)。

DtITS-Ps2：

5′-TTATCCTTTGGCACGTCTGATTCAGGGTCG-FAMdT-A-THF-A-BHQ1dT-ACAAAACCCCAAGCT-C3 Spacer-3′(SEQ ID No.3)。

进一步地，上述检测试剂盒；还包括再水化缓冲液(Rehydration Buffer)、280mM醋酸镁(Magnesium acetate)、RPA冻干酶粉和ddH₂O。

所述RPA冻干酶粉是RPA扩增反应所需要的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物，以RPA冻干酶粉状态存在于RPA反应管中。

进一步地，所述检测试剂盒包括：RPA冻干酶粉(50μL体系用量)，再水化缓冲液29.5μL，上游引物DtITS-F4(10μM)2.1μL，下游引物DtITS-R1(10μM)2.1μL，探针DtITS-Ps2(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL。

本发明还提供上述检测试剂盒在鉴定马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

本发明还提供了一种利用上述RPA引物组或检测试剂盒对马铃薯腐烂茎线虫进行实时荧光RPA检测的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品线虫DNA；

(2)配制RPA反应体系：在含有RPA冻干酶粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，上游引物DtITS-F4(10μM)2.1μL，下游引物DtITS-R1(10μM)2.1μL，探针DtITS-Ps2(10μM)0.6μL，待测样品DNA 2μL，ddH₂O 11.2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL；充分混合均匀；

(3)RPA扩增及结果的判读：将步骤(2)的反应管置于恒温荧光核酸扩增仪中，在39℃反应20min，且每20s收集一次荧光信号，采集荧光数据，并在反应第4min时取出反应管并混匀反应液，然后再放回恒温荧光核酸扩增仪继续反应；绘制时间-荧光信号图，构建扩增曲线；如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。

本发明的有益效果在于：(1)特异性强。本发明RPA引物仅在马铃薯腐烂茎线虫DNA为模板时能得到扩增产物，在其他线虫中不能扩增出产物，因此，其对马铃薯腐烂茎线虫是特异性的，尤其本发明中使用了探针，其检测的特异性更强；而普通PCR和LAMP均没有使用探针，特异性相对差一些。因此，用本发明RPA引物对马铃薯腐烂茎线虫鉴定的结果准确、可靠。(2)灵敏度高。本发明RPA引物灵敏度高，仅需1/125头线虫的DNA量即可进行检测，因而灵敏度高。(3)检测速度快。用本发明方法检测马铃薯腐烂茎线虫只需20min，而用PCR和LAMP技术则至少需要50min，甚至更久。(4)反应温度低。用本发明方法检测在37～42℃恒温下即可实现，而PCR和LAMP技术则需要60～94℃，还需要不停地变温，且需要有专业的仪器配合才可以完成检测。(5)操作简便。本发明方法仅需将几个组分混匀，并置于相应设备即可完成实时检测。另外，所使用的RPA冻干酶粉及其它组分均可以在常温下长时间保存，便于携带至现场进行检测。(6)检测成本低。本发明中所用到的仪器设备价格在3～5万元，而PCR或qPCR所用到的设备则需要几十万甚至更贵。

附图说明

图1.以DtITS-Ps2为探针，以DtITS-R1为下游引物筛选最佳上游引物的RPA扩增曲线图；其中对应的上游引物分别为：1为DtITS-F1，2为DtITS-F2，3为DtITS-F3，4为DtITS-F4，5为DtITS-F5。

图2.以DtITS-Ps2为探针，以DtITS-F4为上游引物筛选最佳下游引物的RPA扩增曲线图；其中对应的下游引物分别为：1为DtITS-R1，2为DtITS-R2，3为DtITS-R3，4为DtITS-R4，5为DtITS-R5。

图3.马铃薯腐烂茎线虫RPA引物的特异性检测扩增曲线图；其中1为马铃薯腐烂茎线虫A种群(Ditylenchus destructor)，2为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)，3为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)，4为落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)，5为夜蛾斯氏线虫(Steinernema feltiae)，6为嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditisbacteriophora)，7为空白对照。

图4.本发明RPA引物组对马铃薯腐烂茎线虫B和C种群的适用性检测扩增曲线图；其中1为马铃薯腐烂茎线虫B种群，2为马铃薯腐烂茎线虫C种群，3为空白对照。

图5.本发明RPA引物组的灵敏度检测曲线图；其中1～7分别为将提取的单条线虫gDNA浓度稀释至原浓度的1/5，1/5²，1/5³，1/5⁴，1/5⁵，1/5⁶，1/5⁷，8为空白对照。

图6.利用本发明RPA引物检测土壤线虫中马铃薯腐烂茎线虫的RPA曲线图；其中1为马铃薯腐烂茎线虫，2为茎线虫属未鉴定种A，3为北方根结线虫，4为拟短体线虫，5为短茅属线虫，6为禾谷孢囊线虫，7为茎线虫属未鉴定种B，8为茎线虫属未鉴定种C，9为空白对照。

图7.甘薯茎组织中马铃薯腐烂茎线虫的RPA检测曲线图；其中1、2和3为接种并发病的甘薯茎组织，4、5和6为已接种但尚未发病的甘薯茎组织，7为未接种的健康甘薯茎组织，8为空白对照。

具体实施方式

实施例1、马铃薯腐烂茎线虫RPA引物及探针的设计和筛选

(1)RPA引物和荧光探针的设计

基于马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)rDNA-ITS序列保守区，按照RPA引物设计原则设计5条上游引物和5条下游引物，以及一条探针，具体序列信息见表1。

表1.RPA引物及探针序列设计列表

其中：FAM-dT为携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF为四氢呋喃，BHQ1-dT为携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，C3-Spacer为在3′末端引入间臂，用于阻止链的延伸。

(2)马铃薯腐烂茎线虫DNA的提取

单条线虫DNA提取：按照发明专利CN109750034A所述方法提取。

大量线虫DNA提取：使用通用基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)进行提取，并按照说明书进行操作。

(3)RPA引物的筛选

以步骤(2)提取的线虫DNA为模板，以表1中DtITS-Ps2为探针，各条上、下游引物以交叉配对法进行筛选，并按照

exo试剂盒的说明书进行操作，在含有RPA冻干粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液(Rehydration Buffer)29.5μL，上游引物(10μM)2.1μL，下游引物(10μM)2.1μL，探针(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，最后加入醋酸镁(Magnesium acetate,280mM)2.5μL；充分混合均匀。

将已加入各种组分的RPA反应管置于恒温荧光核酸扩增仪(T8-ISO,Axxin)中，在39℃反应20min，每20s收集一次荧光信号，并在反应第4min时取出反应管并混匀反应液后再放回恒温荧光核酸扩增仪以促进反应。通过仪器软件分析不同时间节点收集的荧光信号强度来构建扩增曲线，并根据曲线类型进行结果判断，如果出现扩增曲线，判断待测样品为阳性；如果没有出现扩增曲线，判断待测样品为阴性。

结果(见图1)以DtITS-R1为下游引物筛选获得最佳上游引物为DtITS-F4，再以DtITS-F4为上游引物筛选获得最佳下游引物为DtITS-R1(见图2)，由此初步得到最佳引物组合为DtITS-F4/DtITS-R1。即所得引物组为：

DtITS-F4：5’-GAAACGGTACGTGGTTTTCGTAATCGCGAGAG-3’(SEQ ID No.1)，

DtITS-R1：5’-CAAGAGGCTGCACAAGAAACACGCGCTAGGCC-3’(SEQ ID No.2)。

DtITS-Ps2：

5’-TTATCCTTTGGCACGTCTGATTCAGGGTCG-FAMdT-A-THF-A-BHQ1dT-ACAAAACCCCAAGCT-C3 Spacer-3’(SEQ ID No.3)。

实施例2本发明RPA引物对马铃薯腐烂茎线虫的特异性检测试验

(1)待测线虫：马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)(包括A、B和C三种群体)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、夜蛾斯氏线虫(Steinernema feltiae)、嗜菌异小杆线虫(Heterorhabditisbacteriophora)，上述线虫均保存于河北省农林科学院植物保护研究所。

(2)DNA制备：以实施例1步骤(2)所述方法分别提取步骤(1)所述线虫的单条线虫基因组DNA。

(3)RPA反应体系：按照

exo试剂盒的说明书进行操作，在含有RPA冻干粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，上游引物DtITS-F4(10μM)2.1μL，下游引物DtITS-R1(10μM)2.1μL，探针DtITS-Ps2(10μM)0.6μL，DNA模板2μL，ddH₂O 11.2μL，醋酸镁(280mM)2.5μL；充分混合均匀。

(4)RPA反应条件：将步骤(3)已加入各种组分的RPA反应管置于恒温荧光核酸扩增仪(T8-ISO,Axxin)中，在39℃反应20min，每20s收集一次荧光信号，并在反应第4min时取出反应管并混匀反应液后再放回恒温荧光核酸扩增仪以促进反应。通过仪器软件分析不同时间节点收集的荧光信号强度来构建扩增曲线，并根据曲线情况对结果进行判断，如果出现扩增曲线，待测样品为阳性，即待测线虫为马铃薯腐烂茎线虫；如果没有出现扩增曲线，那么就为阴性，即待测线虫不是马铃薯腐烂茎线虫。

结果((见图3和图4))只有马铃薯腐烂茎线虫A、B和C的3个群体有扩增曲线出现，说明获得了扩增产物；而其它南方根结线虫，禾谷孢囊线虫，落选短体线虫，夜蛾斯氏线虫，嗜菌异小杆线虫等5种线虫和空白对照CK(水)都没有扩增曲线，说明没有得到扩增产物；上述结果说明本发明引物DtITS-F4/DtITS-R1和探针DtITS-Ps2引物组对马铃薯腐烂茎线虫具有很好的特异性。

实施例3本发明RPA引物组的灵敏度试验

按照如下方法进行：

(1)DNA制备：以实施例1步骤(2)所述方法提取马铃薯腐烂茎线虫的单条线虫基因组DNA，体系总10μL，即起始浓度为0.1头/μL，以5倍的梯度稀释法进行稀释，分别稀释为原浓度的：1/5，1/5²，1/5³，1/5⁴，1/5⁵，1/5⁶，1/5⁷。

(2)RPA反应体系：参见实施例2步骤(4)，模板相应加入2μL各梯度浓度的基因组DNA。

(3)RPA反应条件：参见实施例2步骤(4)。

结果(见图5)在0.1×1/5头/μL和0.1×1/5²头/μL浓度下出现扩增曲线，说明本检测体系的检测底限为0.1×1/5²头/μL×2μL＝1/5³头，即1/125头线虫的DNA即可检测出马铃薯腐烂茎线虫，说明本发明RPA引物组合及检测方法灵敏度高。

实施例4、利用本发明引物组鉴定田间土壤线虫中马铃薯腐烂茎线虫试验按照如下方法进行：

(1)土壤线虫的分离及DNA制备：利用浅盘分离法将土壤中的所有种类线虫分离出来，从中挑取了7种线虫各一头，并按照实施例1步骤(2)所述方法提取单条线虫的基因组DNA。

(2)RPA反应体系和反应条件：反应体系和反应条件参照实施例2步骤(4)，模板相应加入步骤(1)中所提取的7种土壤线虫的DNA，以马铃薯腐烂茎线虫DNA为阳性对照，水为空白对照。

(3)所分离7种线虫种类的PCR鉴定：基于PCR法鉴定，利用线虫通用引物TW81/AB28S来扩增各线虫rDNA-ITS区序列，PCR体系：2×Es TaqMasterMix(康为世纪)15μl；正反向引物各1μl；单线虫gDNA 1μl；用ddH₂O补足至30μl。PCR反应程序：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30个循环；72℃继续延伸10min。反应产物取5μl用1％琼脂糖凝胶进行电泳，查看结果，并将剩余反应产物送交测序。最终获得各种类线虫的rDNA-ITS区序列，并将序列提交NCBI进行Blast比对分析。对比结果可知从土壤线虫中分离获得分别是茎线虫属未鉴定种A、北方根结线虫、拟短体线虫、短茅属线虫、禾谷孢囊线虫、茎线虫属未鉴定种B、茎线虫属未鉴定种C，PCR鉴定结果表明所分离的7种线虫中没有马铃薯腐烂茎线虫。

本试验RPA检测结果(见图6)显示只有阳性对照马铃薯腐烂茎线虫的出现扩增曲线，显示获得了扩增产物，而其它7种线虫均未出现扩增曲线，即待测的7种线虫中没有马铃薯腐烂茎线虫，与用PCR技术鉴定结果一致。说明本发明RPA引物组对马铃薯腐烂茎线虫的检测特异性强，准确度高。

实施例5利用本发明方法对甘薯茎组织中马铃薯腐烂茎线虫的鉴定试验按照如下方法进行：

(1)甘薯茎组织的采集：分别采集已用马铃薯腐烂茎线虫接种并已发病的甘薯苗3株，已接种但还未发病的甘薯苗3株，和未接种的健康甘薯苗1株。

(2)甘薯茎组织DNA的提取：利用通用基因组DNA提取试剂盒(TaKaRaMiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0，购自大连宝生物)提取基因组DNA，并按照说明书进行操作。

(3)RPA反应体系和反应条件：按照实施例2中步骤(4)所述进行。

RPA反应结果(见图7)显示，已发病的3株甘薯苗和接种但尚未发病的3株甘薯苗的RPA扩增获得扩增曲线，即获得了扩增产物，但前者要明显早于后者；健康甘薯苗的RPA扩增未获得扩增曲线，即没有产生扩增产物。说明已发病的甘薯茎组织中线虫数量比接种但尚未发病的甘薯茎组织中的线虫数量要多，所以前者的扩增曲线起峰较早。也说明本发明的RPA引物探针组合可以在一定程度上反映线虫数量的多少。即说明用本发明RPA引物组不仅可以特异性地定性检测马铃薯腐烂茎线虫，还可以检测其数量。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其限制，本领域技术人员依据本发明可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在本发明的权利要求保护范之内。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的RPA引物及其应用

<130> 2019S1651IHCY

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223> 正向引物

<400> 1

gaaacggtac gtggttttcg taatcgcgag ag 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223> 反向引物

<400> 2

caagaggctg cacaagaaac acgcgctagg cc 32

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(35)

<223> n=FAMdT；THF；BHQ1dT

<400> 3

ttatcctttg gcacgtctga ttcagggtcg nananacaaa accccaagct 50

Claims

1.一种用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的RPA引物组，其特征在于，所述的引物组由DtITS-F4、DtITS-R1和探针DtITS-Ps2组成；其中所述的DtITS-F4由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；所述的DtITS-R1由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；所述的DtITS-Ps2序列如下：

5’-TTATCCTTTGGCACGTCTGATTCAGGGTCG-FAMdT-A-THF-A-BHQ1dT-

ACAAAACCCCAAGCT-C3 Spacer-3’；

其中，FAMdT为携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸；THF为四氢呋喃；BHQ1dT为携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸；C3Spacer在3’末端引入间臂用于阻止链的延伸。

2.权利要求1所述的RPA引物组在鉴定马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

3.一种马铃薯腐烂茎线虫的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的RPA引物组。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括再水化缓冲液、280mM醋酸镁、RPA冻干酶粉和ddH₂O；所述RPA冻干酶粉是RPA扩增反应所需要的重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的混合物，以RPA冻干酶粉状态存在于RPA反应管中。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：50μL体系中RPA冻干酶粉用量，再水化缓冲液 29.5μL，10μM上游引物DtITS-F4 2.1μL，10μM下游引物DtITS-R1 2.1μL，10μM探针DtITS-Ps2 0.6μL，ddH₂O 11.2μL，280mM醋酸镁 2.5μL。

6.权利要求3-5任一所述的检测试剂盒在鉴定马铃薯腐烂茎线虫上的应用。

7.一种利用权利要求1所述的RPA引物组或权利要求3-5任一所述的试剂盒对马铃薯腐烂茎线虫进行实时荧光RPA检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品线虫DNA；

（2）配制RPA反应体系：在含有RPA冻干酶粉的反应管中依次加入如下组分：再水化缓冲液29.5μL，10μM上游引物DtITS-F4 2.1μL，10μM下游引物DtITS-R1 2.1μL，10μM探针DtITS-Ps2 0.6 μL，待测样品DNA 2μL，ddH₂O 11.2μL，280mM醋酸镁2.5μL；充分混合均匀；

（3）RPA扩增及结果的判读：将步骤（2）的反应管置于恒温荧光核酸扩增仪中，在39℃反应20 min，且每20 s收集一次荧光信号，采集荧光数据，并在反应第4 min时取出反应管并混匀反应液，然后再放回恒温荧光核酸扩增仪继续反应；绘制时间-荧光信号图，构建扩增曲线；如果获得扩增曲线，则判定为阳性，反之，无扩增曲线则判定为阴性。