CN110669862B - 与花生冠腐病抗性相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与花生冠腐病抗性相关的分子标记及其应用。该标记是基于花生抗病基因(NBS‑LRR类基因)开发的共显性标记，用于扩增该标记的引物如SEQ ID NO：1‑2所示。具体应用时，以待测花生基因组DNA为模板，利用上述引物对其进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增产物具有两条特征条带，判定待测花生抗冠腐病；若扩增产物仅有一条特征条带，则判定待测花生不抗冠腐病。本方法极大地提高了育种过程中对抗冠腐病花生品种的选择效率，对于高抗冠腐病花生品种的培育效果显著。

Description

与花生冠腐病抗性相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子遗传育种领域，具体地说，涉及一种与花生冠腐病抗性相关的分子标记及其应用。

背景技术

花生(Arachis hypogaea)是我国重要的经济和油料作物，既可以当油料使用，也可以作为蛋白加工被食用；还可以出口创汇。近年来受中美大豆贸易战的冲击及花生产业化的进程加快，庞大的油籽加工行业对花生的需求量越来越大，因而，对花生产量和抗病性方面也有了更高要求。花生病害不仅对花生的品质有影响，也一直是产量增加的主要限制因素。近年来农业结构调整，作物复种不断增加，重茬现象越来越重，花生冠腐病越来越严重，已经逐渐突显为花生生产上的主要病害。花生冠腐病是一种土传病害，利用药剂拌种及生物防治等手段防治难度大。因此，选育和应用抗病品种是最为经济有效的防治方式。

传统的育种方式不仅育种周期长，加上现有的抗性鉴定与筛选技术主要依靠田间观察，受环境影响较大，选择效率低，而且很难将一些重要的抗性基因聚合到综合性状都很优良的花生品种中，使得高产抗病品种更新速度缓慢。而且，对于花生冠腐病这种土传病害的鉴定，会导致不抗冠腐病材料的丢失。建立花生冠腐病抗性分子标记及其辅助选择技术，是克服现有育种技术缺陷的关键。分子标记技术可以实现在杂交早期世代进行选择，同时排除环境及花生种仁发育状态等因素对田间鉴定结果的干扰，减少田间工作量，降低育种成本，从而提高对花生抗病植株选择的准确性，缩短育种年限、加快育种进程。

目前，有关花生抗病标记的报道主要针对黄曲霉所致植物病害、青枯病等，且主要是一些QTL位点、SSR标记和AFLP标记，这些标记受遗传背景影响较大且操作复杂，实际利用程度不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种与花生冠腐病抗性相关的分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与花生冠腐病抗性相关的分子标记，所述分子标记是由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物扩增得到大小分别为172bp和354bp的DNA序列。

第二方面，本发明提供所述分子标记的特异性PCR引物，包括SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物。

第三方面，本发明提供含有SEQ ID NO：1-2所示引物的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供所述分子标记、SEQ ID NO：1-2所示引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在抗冠腐病花生品种的鉴定及(早期)选育中的应用。

所述应用包括如下步骤：

(1)提取待测花生的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物进行PCR扩增；

(3)分析扩增产物。

优选地，PCR反应体系为：含25mM Mg²⁺的10×反应缓冲液1.0μl，2.5mM dNTPs0.8μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl，10μM上、下游引物各0.2μl，DNA50ng，ddH₂O补齐至总体积10μl。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；第1个循环是95℃变性50s，50℃退火40s，72℃延伸30s，然后退火温度每个循环降0.3℃，共38个循环(包含第1个循环)；最后72℃延伸8min。

步骤(3)包括：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测(1.5％琼脂糖凝胶)，若扩增得到大小分别为172bp和354bp的两条特征条带，则待测花生为抗冠腐病花生材料，若扩增仅得到大小为172bp的一条特征条带，则待测花生为不抗冠腐病花生材料。

本发明中，所述冠腐病由黑曲霉(Aspergillus niger)所致。

第五方面，本发明提供所述分子标记、SEQ ID NO：1-2所示引物或含有所述引物的检测试剂或试剂盒在花生分子标记辅助育种中的应用。

本发明利用NBS-LRR类基因家族的保守序列搜索花生基因组，获得多个NBS-LRR类基因，从而利用该基因序列设计引物对冠腐病极端高感和高抗的材料进行筛选，筛选出分别在高感和高抗冠腐病带型不一致的标记，然后再进行验证。最后获得以NBS-LRR类基因序列(SEQ ID NO：3)为模板设计的引物(SEQ ID NO：1-2)具有显著差异，NBS-LRR类基因家族是植物中最大的一个抗病基因家族，通过这种方法开发分子标记具有很强的针对性和目标性，减少因无目标针对性地开发标记。此外，基于该家族功能基因的特定序列开发的标记与目标基因共分离，不仅可以进行早代选择和预测，缩短育种年限，且大大提高了选择的准确性。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供的分子标记稳定可靠、准确性高。该标记是基于NBS-LRR类抗病家族基因序列开发的，准确性高；该标记也是对基因组DNA进行PCR扩增，该技术成熟稳定，可靠性强。

(二)快速简便、效率高。利用本方法，只需提取待测花生品种的总DNA进行PCR扩增，扩增产物直接进行琼脂糖凝胶电泳检测即可，操作简单方便，耗费时间少，且对该品种没有任何影响。此外，该标记为共显性标记，可准确进行分型，大大提高了筛选效率。

(三)应用前景良好。该标记可以在育种过程对高抗冠腐病这一性状进行早代的检测，通过对育种材料的筛选，淘汰只有一条目标条带的亲本或中间育种材料，大大降低了育种的工作量，显著提高了育种过程中选择高抗冠腐病花生品种的效率，对于花生抗病品种的培育具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中琼脂糖凝胶电泳结果示意图；其中，M：DNA Marker；1-12：皖花4号、合花5号、Z432、Z565、Z634、Z210、Z215、Z233、Z283、Z432、Z565、Z634；13-24：皖花7号、皖花10号、合花2号、合花3号、Z199、Z221、Z249、Z612、Z294、Z316、Z415、Z571。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1与花生冠腐病抗性相关的分子标记的开发及获得

在NCBI网站上搜索花生NBS-LRR类家族基因的序列，以搜索到的多个基因序列为模板，利用Primer 5.0软件在已公布的该家族基因的外显子、内含子以及启动子等特定序列处设计引物，共设计了200对引物，分别对极端高抗和高感冠腐病的品种同时进行琼脂糖凝胶电泳和聚丙酰胺凝胶电泳筛选，最终以目标基因(SEQ ID NO：3)的gDNA序列为模板设计引物筛选出具有显著差异的特异性标记(高抗的花生材料是一种类型；高感的花生材料是另一种类型)，该标记位于目标基因的外显子上，上游引物位于目标基因的1443bp-1461bp处，下游引物位于目标基因的1779bp-1797bp处，用于扩增该标记的特异性引物如下(SEQ ID NO：1-2)：

上游引物F：5’-GAAGCTGCCTAATGTAAT-3’；

下游引物R：5’-GAAGAAGGAGGAGAAAGA-3’。

实施例2与花生冠腐病抗性相关的分子标记的应用

1、待测花生基因组DNA的提取

(1)取2g待测花生品种新鲜的幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后置于2ml灭菌离心管中。

(2)每个离心管中加入1.2ml DNA提取缓冲液(200mMTris-Cl，pH8.0，250mM NaCl，25mM EDTA，pH8.0，0.5％SDS，2％β-巯基乙醇混合均匀。β-巯基乙醇临用前新鲜加入)。

(3)55℃水浴45min，期间间歇振荡。

(4)室温下12000rpm离心10min。

(5)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，加入预冷的等体积Tris饱和酚/氯仿异/戊醇(体积比为25∶24∶1)，于冰上颠倒混匀15min，期间间歇振荡。

(6)室温下12000rpm离心10min。

(7)转移上清液至新的2ml灭菌离心管中，重复步骤(5)、(6)，以充分除去蛋白。

(8)转移上清液至新的1.5ml灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混合混匀后冰上静置20min左右。

(9)出现白色絮状DNA沉淀，4℃ 10000rpm离心10min。

(10)弃上清，加入预冷的70％乙醇漂洗2遍，然后用无水乙醇漂洗1遍，室温晾干，加入100μl含2μl 10mg/ml RNase酶的1×TE缓冲液(或双蒸水)过夜溶解，10倍稀释备用。

(11)用1％琼脂糖检测提取的花生基因组DNA的质量及浓度。

2、PCR扩增目标产物

以上述提取的待测花生品种基因组DNA为模板，利用引物SEQ ID NO：1-2对该模板进行PCR扩增，其中10μl PCR反应体系的组成为：10×反应缓冲液(25mM Mg²⁺)1.0μl，2.5mMdNTPs 0.8μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl，10μM上、下游引物各0.2μl，DNA50ng，ddH₂O补齐至总体积10μl。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；第1个循环是95℃变性50s，50℃退火40s，72℃延伸30s，然后退火温度每个循环降0.3℃，共38个循环(包含第1个循环)；最后72℃延伸8min。PCR产物4℃保存备用。

3、PCR扩增产物的检测

PCR结束后，向扩增产物中加入2μl的电泳指示剂(6×DNA加样缓冲液)，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，若检测结果出现两条目标条带，则上述待测花生品种为抗冠腐病品种，若只有一条目标条带，则上述待测花生为不抗冠腐病品种，结果见表及图1。从图1可见，扩增的条带分为两类，一类是两个条带的(“A”带型)，而另一类是仅有一个条带的(“B”带型)。

表1不同花生品种的基因型分析

品种名称	冠腐病抗性	带型	品种名称	冠腐病抗性	带型
						皖花4号	抗	A	皖花7号	感	B
合花5号	抗	A	皖花10号	感	B
						Z432	抗	A	合花2号	感	B
Z565	抗	A	合花3号	感	B
						Z634	抗	A	Z199	感	B
Z210	抗	A	Z221	感	B
						Z215	抗	A	Z249	感	B
Z233	抗	A	Z612	感	B
						Z283	抗	A	Z294	感	B
Z432	抗	A	Z316	感	B
						Z565	抗	A	Z415	感	B
Z634	抗	A	Z571	感	B

实施例3花生冠腐病分子标记的育种应用

1、杂交F2代的获得

选用冠腐病抗性差、其他综合性状优良的花生材料Z249作为母本，其他性状较一般、冠腐病抗性强的花生材料Z210作为父本，杂交后获得F1代，F1继续自交获得F2代植株和籽粒。

2、冠腐病标记对F2代后代植株的抗性筛选

选取所有表现好的F2植株(400株)的幼嫩叶片，提取基因组DNA，然后用该标记进行PCR扩增，并对扩增产物进行电泳琼脂糖凝胶电泳检测(具体操作同实施例2)，将所有检测结果是一条带的F2代植株和检测结果为两条带的F2代植株分别标记和收单株，其中A带型40株，B带型360株(待淘汰)。

3、F3代冠腐病抗性的鉴定

将400株单株按400株行种植于发病的自然病圃，其中A带型(40行)冠腐病发病率仅为6.3％，而B带型(360行)冠腐病发病率高达80.6％。

上述实验结果表明，用该分子标记筛选的具有两条带(A带型)的花生品系冠腐病抗性显著高于仅有一条带(B带型)的花生品系，准确率高达80.6％。因此，在早代(F2代)就可以淘汰所有一条带(B带型)的花生品系，大大降低了育种工作量。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 【安徽省农业科学院作物研究所】

<120> 与花生冠腐病抗性相关的分子标记及其应用

<130> PI201910610

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaagctgcct aatgtaat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagaaggag gagaaaga 18

<210> 3

<211> 4651

<212> DNA

<213> 花生(Arachis hypogaea)

<400> 3

atgactggtg cagttgttgg tgaagctttc ctttctggct tcattaacgt tgtctttcaa 60

aggttgctca caacggatac ggtcaaccag gtcttgggca agaagcttgg ctctggcttg 120

gttgagaggc tgaaaatttc tctgcatgct gctgaagctg tgcttgatga tgctgagtac 180

aagcaactgg gcgacgatcg tgtgagggat tggctcaact gtctcagaga ggctgtttat 240

gacgctgatg acttgctgga cgctgtactc accaaagccg ccattcaaaa ggaggtacgt 300

tcttggttgc ctagtttctt cctcaaccga cataggaaga tggtagataa catggaggag 360

gtggttgaaa gaatagaatt tcttgtaagt caaaaagata tccttggtct tcaaaggagt 420

accaacgatt tgaagaccaa ggataataac ttgtcatcat catcgtcatc atggcgagaa 480

accacatgtc tgatggaagg gaagatatat ggcagggagg atgatcaaca agctttaatc 540

aaaataatac atgacaggag tgaatctcag ttatctgtga ttccgattgt tggcatgggc 600

ggggttggta aaacaacctt agccaaatgg gcgtacagtg tcgcggaagg gtttgatctg 660

aaagcatggg tctgcatctc tgaaacattt gatgttgctg atattacaaa gaaaaccatt 720

gaggagatta ctaaaaattc ttgtagcctt gggagtttaa atttgcttca aaatgaattg 780

cagaaaatct tgtcgggaaa gaagttcttt attgttctag acgatgtctg gagcgatgat 840

gccgataagt ggaagcaatt tataactcct tttcactgtg gggtaaaggg tagtacaatt 900

cttattacta ctgtggcagc caatgcatgt tttccggagt caaatgggaa cccaatacta 960

gaggaaatcg gtagaaagat tgtcaagaag tgtaaagggt tgccattagc tgttgaaaca 1020

cttgggcgct tgttgcaagg agaggatgat gctgaagaat ggaatgctgt tttaaggagt 1080

gacatctggg aatttcccat gaaagatagt aaaattattc cagcattgtt aataagctac 1140

ttccagctac ctccttactt gaagcgttgt ttcgtttatt gttccttgtt tcccaaagat 1200

catgagtttg agaaaaatga actagttttg ctgtggatgg ctgaagatct tttaaggcta 1260

ccaaagagag gagagagttt agaagaggtt ggttctcagt gttttgaaga attagcttcg 1320

aggttatttt ttaaacaaga atggtgtttt cataagatgc atgatctctt gcatgacttg 1380

gcaatattcc ttgctggaga cttctatggt agaatagaag agcttggtga acaagaaaag 1440

aagaagctgc ctaatgtaat taacttcata tttgattcaa taattaactt catattatgc 1500

atcacatgct tttattatat acgaaaaata taacacaaaa agggataaat aaaaagttta 1560

tgtaaagatt ggcctctcta tattcaaatt tttaaatttg tcattatata taatatttac 1620

aattacatat ttattatatc taaaacaatg atgttagtat aaaatatatg tcgaaatata 1680

aaatacatat ttattatatc taaaacgcga tgcaaggtct acgttcttct tcttcttcct 1740

cttcctcttc ttcttctttt ctttagtttc ttgctttctc tttctcctcc ttcttcttct 1800

tgctgcacgt tcttcttcct cttcctcttc ttcttctttt ctttcgtttc ttgttttctc 1860

tttctcgttc ttcttcctct tgcacgttct tcttcctctt cttcttcctc ttcttcttct 1920

tttctttcgt ttcttgcctt ctctttctcc ttcttcttct tcttgttgca cgttgttctt 1980

cctcttcctc ctcttcttct tcttcattta catgcttttc tctctgtttt ctttcttcgt 2040

tattctcgat ttccattttt ttttacatca agctctaaaa tcgtttttga agaagaagaa 2100

gcagtagaag atgaagagga gaaagagaaa gagttttgaa atatgcataa ggtgtacttc 2160

aacgaatttt gggtgtattt cttaaatcct ttggtgtatt tctgtaatcc tttaggtata 2220

tttctataat cgtttgggtg aattcctgta accgtttgga tgtatttctg taatcttttg 2280

ggtgtatttc tgtaatcgtt ggggtgtatt tctataatcg tttgggtgta tttctaaagt 2340

tccattatct tcaaatttgg caagaaaatt gttttcatgg aggaagaaga agagtcgttc 2400

ataatgcatg gtaagtagcg cgctttagaa acaggaagtt gttgaagttg ttgaataacg 2460

tgcgttttat ttactcttaa atgtggaaat atgtaatgcg ttaattaagt gtaatgcgtg 2520

tgttttattg gacttgtaag acttgtaagc caaaaagact tgtatgtgta acaagcctca 2580

taaaaaaatc cattattctt ttgcttagag tttgtgtgca tccgtacaaa atcgtaaaat 2640

gcatatgaca taaaataatt aataaaaacg agactcacat atgttgatta tttttctaac 2700

tcttaagcat aatgtaacta ttatatttgt ttaaaaagtt ttcttttctt attatatgat 2760

ttaaattgtt tagacattgg ataagtatat atcttgttta tgtcattggc tatttttttc 2820

accttattgt actcttctat acatatataa tcaacccaaa aaatttcaaa aaaaaaagaa 2880

agttttctag taaattatat gatggattct cttagtctgc gaaaagtata tctgtcattt 2940

ttaatttaat attgttttat tgtcttccaa tttccattga ttttttttaa gtttatacca 3000

atataaaaat aaggtgtgaa atcaatcaaa ttattcaact tgtatactaa ttatcacact 3060

gaaaggaacg cagtttatgt ttatctagaa ttacaagatt tttgcatttt aaaaacaagt 3120

taaagttttt gactttgaat actagcacaa tgaaatgaag aatatatgtt catttttaaa 3180

tctacaaagt ctaatttaaa attcttcaaa ccctttaaat ttaatgccgg cactgtttat 3240

taacaaccta gaaaatgaga gggttgaaca ctagcaaaaa ccattattcg ctcatattgt 3300

tttaataaat gcataaaaaa ttctatcatc acagcatgga aatttcttaa taacttggtt 3360

tatttataaa aagtatattt tgttctttgt attcttgaaa gaccaaatta gacactcatc 3420

aaaggtttgt ctctatagtt tatagcatag ttcatcactt tatatatttg atgcatgaaa 3480

agttgcttta ctttactttt caattattgt gatattcttg acttttcaat cattgtcgac 3540

attttaaaat tggaattttc tcaaacacaa acaaaattca attcatactt taattttaga 3600

tacataataa tacattcaca atgaaattag tcagacttat aaataagtac ttattcattt 3660

aataaagtta taaaaaatta ttgtaaaatt attttttgga acacattcct tctctaattc 3720

ttccaaccac acccaatcaa gaaaaagata gctttaagtt ttgagatata tccctttcat 3780

ttctaagcat agactcaacc gtgcataata aagttatagt atttttttta atgattttat 3840

atacatatat atatatatat atatatatat aaatttagga attatctcaa catatatata 3900

tatatatata tatatatata tatatgttag aataaattaa ggaattatct aaatatagca 3960

tgaaccatac aaatgtaatt acaaaaataa actatacact atattaagat ttccatgtct 4020

aataaataaa tttattcaat tattatattt atatattttc tatataataa atatataatt 4080

caaaaatgct ataaatagaa agcaaaaaat ttccacggcg cacgatagcg tcgactacct 4140

tttaaattct aaaagacgct aagtcgttgc tacgttaaaa tttctctctt tcactttctc 4200

tctctaaaag tcttcagctg cgcgcccatt ttctctctct aacaaacaca ggccatgaaa 4260

ggtcgccgga actccagctc cgactaccgg agtacgccgg aacgcggtgg atattctccc 4320

ggatacgcgt cttctgaggt cagcgccaag tcaacctctt cctccaccgc ctccggtggc 4380

cggaattggg tctcctccgc cgctaggtct gtagcaggaa tcttcaccgc ctgcttcgcg 4440

ccgccggaag ccaccatcag aagctccaag agcttcgggg attctgaaga gttcaaagct 4500

ccatctggta gtagtttgat tttttcttac tcaattttgc tgccatttaa tttgttggaa 4560

aaattcattt cttttttgtt tagcaaagaa tctgatattt tcggtcgtgg aaattggtag 4620

tgtattgttt tggatctggt gcgatgaaaa a 4651

Claims (9)

1.与花生冠腐病抗性相关的分子标记的特异性PCR引物，其特征在于，包括SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物。

2.含有权利要求1所述引物的检测试剂或试剂盒。

3.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在抗冠腐病花生品种的鉴定及选育中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测花生的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，利用SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物进行PCR扩增；

(3)分析扩增产物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR反应体系为：含25 mM Mg²⁺的10×反应缓冲液1.0μl，2.5mM dNTPs 0.8μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.1μl，10μM上、下游引物各0.2μl，DNA50ng，ddH₂O补齐至总体积10μl。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为：95℃预变性5 min；第1个循环是95℃变性50 s，50℃退火40 s，72℃延伸30 s，然后退火温度每个循环降0.3℃，共38个循环；最后72℃延伸8 min。

7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，步骤(3)包括：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若扩增得到大小分别为172bp和354bp的两条特征条带，则待测花生为抗冠腐病花生材料，若扩增仅得到大小为172bp的一条特征条带，则待测花生为不抗冠腐病花生材料。

8.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，所述冠腐病由黑曲霉（Aspergillus niger）所致。

9.权利要求1所述引物或权利要求2所述检测试剂或试剂盒在花生分子标记辅助育种中的应用。

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