CN110669859B

CN110669859B - 一种香蕉枯萎病抗性相关的srap分子标记及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN110669859B
Application number: CN201910961363.4A
Authority: CN
Inventors: 徐春香; 冯国恩; 李小泉; 陈厚彬; 吕顺; 王芳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: Guangxi Meicheng Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-01-26
Anticipated expiration: 2039-10-11
Also published as: CN110669859A

Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记及其检测方法和应用。所述SRAP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，分别具有813bp和400bp。所述检测鉴定香蕉枯萎病抗性的方法，是以待测香蕉样品DNA为模板，采用SRAP分子标记检测引物进行PCR扩增反应并检测扩增产物，若扩增出813bp或400bp的特异性条带则表明待测香蕉样品不具有蕉枯萎病抗性，为香蕉枯萎病感病品种；反之则表明待测香蕉样品具有蕉枯萎病抗性，为香蕉枯萎病抗性品种。本发明提供的SRAP分子标记，为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术，进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及物理化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选。

Description

一种香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及植物抗病育种分子标记技术领域，更具体地，涉及一种香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记及其检测方法和应用。

背景技术

香蕉(Musa spp)是世界贸易的大宗水果，也是仅次于水稻(Oryza sativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)和玉米(Zea mays L.)的第四大粮食作物。香蕉枯萎病，又称为巴拿马病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense,Foc)侵染引起的维管束系统性病害，是一种具有毁灭性的土传真菌病害。香蕉枯萎病是在世界范围内分布最广、毁灭性最强的植物病害之一，已成为香蕉产业发展的最大障碍。据报道，香蕉枯萎病菌目前有4个生理小种，其中4号生理小种是危害最大的一种，几乎能侵染所有的香蕉种类。1976年，我国在台湾地区的香牙蕉上首次发现香蕉枯萎病4号生理小种，随后在广东、福建、海南等香蕉主产区迅速蔓延，严重威胁着我国的香蕉产业。目前仍无有效的防治措施，已成为香蕉产业发展的最大障碍之一。因此，选育和栽培香蕉抗枯萎病抗病是控制该病害的有效途径。

然而传统的育种手段效率低下且选育周期长，耗费大量的人力物力。分子标记辅助选择可以对潜在的抗性资源进行早期筛选，缩短抗病育种的进程，提高育种效率。但目前国内外有关分子标记辅助香蕉抗病育种的报道还比较少，仅有Wang等(2012)利用抗病香蕉品种筛选出了两对与抗病相关的RAPD引物，并成功开发了两个SCAR标记；Cunha等(2015)开发了一个用于鉴定不同基因型香蕉对香蕉枯萎病的抗/感性的SCAR标记；王芳等(2018)利用SRAP分子标记技术筛选出两对与香蕉枯萎病相关的SRAP引物，并成功开发出两个SCAR标记；专利CN201610508539.7、201711087768.7公开的香蕉枯萎病抗性的SCAR分子标记；由于香蕉的枯萎病抗病机理较为复杂，抗病相关的基因较多，目前能够直接有效的用于香蕉育种中分子手段还比较少，因此急需对香蕉抗病机理进行多方面研究，开发多种抗枯萎病香蕉的鉴定方法，这方面的研究对香蕉的抗病育种具有重要意义。另一方面，现有的香蕉枯萎病抗性分子标记较少，且现有的香蕉枯萎病抗性分子标记无法达到100％的准确性，因此可以尝试提供更多不同的抗性分子标记，这样在实际检测时就可以同时利用多种分子标记进行检测，相互验证，从而提高准确性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记。

本发明的另一目的在于提供所述香蕉枯萎病抗性分子标记的检测方法。

本发明的再一目的在于提供所述香蕉枯萎病抗性分子标记的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记，所述SRAP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

本发明所述SRAP分子标记具有813bp或400bp的特异性条，所述特异性条带的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示，所述SRAP分子标记在NCBI核酸数据库和香蕉基因组数据库中均未发现与其具有较高同源性的已知序列，表明所述SRAP分子标记为全新发现的。

本发明还提供一种用于扩增所述SRAP分子标记的引物。

优选地，用于扩增SEQ ID NO:1所述SRAP分子标记的引物序列分别如SEQ ID NO:3～4所示；用于扩增SEQ ID NO:2所述SRAP分子标记的引物序列分别如SEQ ID NO:5～6所示。

Me1-F：5’-TGAGTCCAAACCGGAAG-3’(SEQ ID NO:3)；

Em2-R：5’-GACTGCGTACGAATTTGA-3’(SEQ ID NO:4)；

Me9-F：5’-TGAGTCCAAACCGGAGT-3’(SEQ ID NO:5)；

Em1-R：5’-GACTGCGTACGAATTAAT-3’(SEQ ID NO:6)；

上述的SRAP分子标记或任一所述的引物在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病香蕉品种或在制备香蕉枯萎病抗性检测试剂盒中的应用。

一种鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病香蕉品种的方法，包括如下步骤：

S1.提取待测香蕉样品基因组DNA；

S2.以步骤S1的DNA为模板，利用上述任一所述的引物进行PCR扩增反应；

S3.将S2的PCR扩增产物进行电泳检测，若扩增出813bp或400bp的特异性条带则表明待测香蕉样品不具有蕉枯萎病抗性，为香蕉枯萎病感病品种；反之则表明待测香蕉样品具有蕉枯萎病抗性，为香蕉枯萎病抗性品种。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的反应体系为：50ng/μL模板DNA 1μL，10mM引物11μL，10mM引物2 1μL，Mg²⁺Free 10×Taq buffer 2.5μL，25mM MgCl₂ 1.5μL，2.5mM dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA Polymerase 0.2μL，ddH₂O 15.8μL，总体积25μL。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的反应程序为：预变性94℃5min；变性94℃1min，退火35℃1min，延伸72℃1min，5个循环；变性94℃1min，退火50℃1min，延伸72℃1min，35个循环；终延伸72℃8min。

一种用于鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病香蕉品种的试剂盒，所述试剂盒含有上述任一所述检测SRAP分子标记的引物。

本发明还请求保护所述试剂盒在鉴定香蕉枯萎病抗性或筛选抗枯萎病的香蕉中的应用。

优选地，所述试剂盒还含有PCR扩增反应所需试剂和香蕉样品基因组DNA提取所需试剂。

优选地，所述香蕉为香牙蕉。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种与香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记，为全新发现的，在NCBI核酸数据库和香蕉基因组数据库中均未发现与其具有较高的同源性的已知序列，可用于研究香蕉枯萎病抗病相关的基因，研究香蕉的枯萎病抗病机理。利用本发明的SRAP分子标记，可以对不同的靶基因进行检测，在实际检测时与现有的分子标记配合，从而相互验证，从而提高准确性。本发明的SRAP分子标记为香蕉抗病新品种选育提供分子辅助技术，进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及物理化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为改良CTAB法提取的部分香蕉(Musa spp.)样品的DNA电泳图。1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘抗枯1号’；6：‘北大矮蕉’；7：‘东莞中把’；8：‘齐尾’；9：‘巴西蕉’；10：G30。

图2为SRAP引物Me1-Em2对10个香牙蕉(Musa spp.AAA)样品的PCR扩增电泳图。M：DL 2000 marker；1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘抗枯1号’；6：G30；7：‘东莞中把’；8：‘齐尾’；9：‘巴西蕉’；10：‘北大矮蕉’。

图3为SRAP引物Me9-Em1对10个香牙蕉(Musa spp.AAA)样品的PCR扩增电泳图。M：DL 2000 marker；1：‘农科1号’；2：‘南天黄’；3：‘东蕉1号’；4：BXM51；5：‘抗枯1号’；6：G30；7：‘东莞中把’；8：‘齐尾’；9：‘巴西蕉’；10：‘北大矮蕉’。

图4为SRAP引物Me9-Em1对23个香牙蕉(Musa spp.AAA)样品的PCR扩增电泳图。M：DL 2000 marker；1：G6-1；2：‘抗枯5号’；3：‘南天青’；4：‘东蕉1号’；5：BXM51；6：‘农科1号’；7：‘索马里香蕉’；8：‘荷兰香蕉’；9：‘龙州中把’；10：L1N1；11：‘那坡高把’；12：‘天宝矮蕉’；13：‘墨西哥香蕉’；14：‘漳蕉8-2’；15：Ke2；14:WS2；16:‘广东2号’；17：G20；18：‘河口高把’；19：‘红河矮蕉’；20：‘那龙中把’；21：‘浦北矮蕉’；22：‘定安高芽’；23：G30。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

香蕉枯萎病抗性分子标记筛选供试材料，于2018年10月采样于东莞市香蕉蔬菜研究所香蕉种质资源圃。选用对香蕉枯萎病具有不同抗/感性的香牙蕉(Musa spp.AAA)品种/系共计30份(表1)，包含了一部分东莞市香蕉蔬菜研究所培育的新品种/系和中国多个香蕉产区地方品种以及大面积推广的品种。

表1供试30份香牙蕉(Musa spp.AAA)品种及对香蕉枯萎病4号小种的抗性

实施例1香蕉全基因组DNA提取

一、方法

1、选取香蕉枯萎病抗性不同的香牙蕉品种(表1)分别进行DNA提取。DNA提取方法采用改良十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)：

(1)于2mL离心管中加入1mL改良CTAB提取液(3％CTAB，100mmol/L Tris-HClpH8.0，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％PVP，4％β-巯基乙醇)在65℃水浴中预热。

(2)称取0.2～0.5g香蕉嫩叶于研钵中，加入少量PVP，在液氮中迅速研磨成粉末。

(3)粉末转入预热的CTAB提取液中，充分混匀后65℃保温60min，每隔10～15min摇匀一次，使粉末与提取液充分混匀。

(4)室温下冷却至常温，8000rpm，离心6min，取上清液，转入新的2mL离心管中。

(5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻混匀，12000rpm，离心10min。

(6)吸取上清液于2mL离心管中，加入30％体积的无水乙醇和等体积的DNA提取酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀后静置片刻，12000rpm，离心10min。

(7)吸取上清液转入新的2mL离心管中，加入1/10体积3M醋酸钠和等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，-20℃静置2h以上。

(8)12000rpm，离心10min，倒出上清液，用75％乙醇洗涤DNA 2～3次，室温挥发乙醇，用TE buffer或无菌水溶解DNA，再用适量的RNase A消化(37℃水浴1～2h)，-20℃保存备用。

2、DNA浓度和纯度检测

(1)电泳检测：取2μL DNA母液，加入1μL 6×Loading Bμffer和4μL ddH2O，点样于1％琼脂糖凝胶，120V电泳15～20min左右，在凝胶成像系统下观察、拍照，检测基因组DNA片段大小和完整性。

(2)核酸蛋白仪检测：吸取1μL DNA样品，利用核酸蛋白测定仪测定DNA的质量浓度，以及在波长260nm 280nm处的吸收值A₂₆₀和A₂₈₀，并计算A₂₆₀/A₂₈₀以判断DNA的纯度。并根据以下依据判断DNA的质量：OD₂₆₀/OD₂₈₀应在1.6～1.9之间，大于1.9说明有RNA污染，小于1.6说明有蛋白质污染；OD₂₆₀/OD₂₃₀应大于2.0，小于2.0则表明溶液中残有盐和小分子杂质。

二、结果

采用CTAB改良法提取香蕉基因组DNA，所提取样品的DNA母液浓度均可达到400ng/μL以上，OD₂₆₀/₂₈₀＝1.8左右，质量较好，符合试验要求，可用于后续的SRAP分子标记及SRAP分子标记筛选。图1为该方法提取的部分香蕉样品的基因组DNA电泳图。

实施例2香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记筛选

1、选取‘农科1号’、‘南天黄’、‘东蕉1号’、BMX51、‘抗枯1号’、G30、‘东莞中把’、‘齐尾’、‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’等10个品种，用于SRAP特异条带的筛选。SRAP引物序列见表2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR扩增反应在PCR instrument(Bio-rad T100，Bio-Rad/USA)上进行，PCR反应体系如表3所示，PCR反应条件如表4所示。

表2 SRAP标记引物及序列

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

扩增产物加入4μL的6×Loading buffer后，取8～10μL在1.8％琼脂糖凝胶中电泳，电压120V，电泳40min左右，在紫外凝胶成像仪中进行观察与分析，记录结果。

2、结果显示，通过合成正向引物10条，反向引物10条，组合100对SRAP引物(表2)。以5个抗病品种/系(‘农科1号’、‘南天黄’、‘东蕉1号’、BXM51、‘抗枯1号’)和5个感病品种/系(G30、‘东莞中把’、‘齐尾’、‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’)作为供试材料，筛选出2对与香蕉枯萎病抗感病性相关的SRAP分子标记，分别为Me1-Em2和Me9-Em1。Me1-Em2在5个感病品种/系中均扩增出900bp左右的特异性条带(图2)，Me9-Em1在5个感病品种/系中均扩增出400bp左右的特异性条带(图3)。两对SRAP标记在抗病品种/系中均没有特异性条带的扩增(图2，图3)

将2个SRAP标记的5个感病品种/系(G30、‘东莞中把’、‘齐尾’、‘巴西蕉’、‘北大矮蕉’)扩增出的特异性条带分别进行切胶回收，并送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。将测序结果在BioXM2.7软件上进行比对分析，不同品种/系之间的DNA序列基本一致。Me1-Em2这对引物获得了一段813bp的DNA序列，Me9-Em1获得一段400bp的DNA序列，其序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。将获得的两段DNA序列分别在NCBI核酸数据库和香蕉基因组数据库(http://banana-genome-hub.southgreen.fr/blast)上进行BLAST分析，均未发现与已有的序列具有较高的同源性，其原因可能是因为该特异片段为香蕉基因组中DNA的基因间区域或基因内含子序列。

将此Me9-Em1 SRAP分子标记对另外20个已知其抗感性的品种/系进行PCR扩增，扩增结果如图4所示，在感病品种/系中均出现400bp的特异性条带，而抗病品种没有该条带的扩增，与表1所示的田间抗感型完全一致，且多次重复实验结果一致。

同时，再利用Me1-Em2 SRAP分子标记对另外20个已知其抗感性的品种/系进行PCR扩增，结果显示，在感病品种/系中均出现813bp的特异性条带，而抗病品种没有该条带的扩增，与表1所示的田间抗感型完全一致，且多次重复实验结果一致。表明本发明的香蕉枯萎病抗性SRAP分子标记具有一定的应用价值，进一步可用于以香蕉组培苗、香蕉田间变异株系以及物理化学诱变后代等为筛选群体的香蕉新品种(系)的辅助筛选。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种香蕉枯萎病抗性相关的SRAP分子标记及其检测方法和应用

<141> 2019-10-10

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 813

<212> DNA

<213> 香蕉(Musa spp)

<400> 1

tacccctctt ccagaatgat cctatcgcgg gaggagccat tgtagttata caactttttg 60

gcacagaagt ggagggcgaa tcctatgtca aaatgggttc aagtggtgct ttctctttgc 120

tcggcccgaa ggcactggat tcctattgca atggaaatac gggttacacg atataatcta 180

ctgaatgaag agactggttg acatggaggg cataggtcaa gtacaagaca gagaggctaa 240

cgaaggtgga catggagggc atagcatagg tcaagtacaa gacagagagg ctaactaagg 300

ccaagggagc ttagaaacca ccaacaccaa gagctaaaca tatgcatggg tgtacagcgt 360

tggcgtgagg gaattttttc ataatatagg gcttatttct agcattcatt aacgagatct 420

ccatcttcgg acatgaaagt gaacaaaggc attcttagta agttcaaaag ggagtctcgg 480

atccaatcca caatcaatgg gggaagcagc tacacaagca gcattattgg atttgttcaa 540

aagaaagtat cggatcacac attcgtcagt gcaatttcac aaaggttaac aaggttcaaa 600

gaaagggtgg tcagtgcaac ttcaaaggtt caaagaaagg gtggtcagtt ggggaagaca 660

atatgactct tcccagcacc gtcccgcaga atgtaatagt caacgtacct tttcctcgca 720

tctaccgcta cggccaagta aagcagccaa gtcactactc atgtgtagcg gcagttgtgt 780

ttgcttcaac aatctactga atatatacga tgc 813

<210> 2

<211> 400

<212> DNA

<213> 香蕉(Musa spp)

<400> 2

ttgagtccaa accggagtcg agatcggcag acaataagaa tggaaataga gttgacttca 60

gaatccaatc caatgggaaa aacaataaat gatcaatatg aaataaataa gaaaagtcga 120

catctttatc atatacatac tcagtacaga catagaaggg aaaaatatag gtgaattcta 180

tctcttctta tataggtgaa cggattctac tcttaattcc aatactcggg caggctggta 240

tcattccaat acgagggcgg ggcagagtca attacttgct ttgaagctag tcctgagtcg 300

aggtagtcta ggaagcaagc ttgagtggaa gtaggaaagt agtaagggta tccagtagta 360

agggtatcca gtagtaaaga tattaattcg tacgcagtca 400

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 香蕉(Musa spp)

<400> 3

tgagtccaaa ccggaag 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 香蕉(Musa spp)

<400> 4

gactgcgtac gaatttga 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 香蕉(Musa spp)

<400> 5

tgagtccaaa ccggagt 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 香蕉(Musa spp)

<400> 6

gactgcgtac gaattaat 18

Claims

1.一种香蕉枯萎病4号生理小种抗性相关的SRAP分子标记，其特征在于，所述SRAP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的SRAP分子标记在鉴定香蕉枯萎病4号生理小种抗性或筛选抗枯萎病4号生理小种香蕉品种或在制备香蕉枯萎病4号生理小种抗性检测试剂盒中的应用。

3.一种鉴定香蕉枯萎病4号生理小种抗性或筛选抗枯萎病4号生理小种香蕉品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测香蕉样品基因组DNA；

S2.以步骤S1的DNA为模板，利用扩增权利要求1所述SRAP分子标记的引物进行PCR扩增反应，其中用于扩增SEQ ID NO:1所述SRAP分子标记的引物序列分别如SEQ ID NO:3～4所示；用于扩增SEQ ID NO:2所述SRAP分子标记的引物序列分别如SEQ ID NO:5～6所示；

S3.将步骤S2的PCR扩增产物进行电泳检测，若利用SEQ ID NO:3～4所示引物扩增出900 bp的特异性条带或利用SEQ ID NO:5～6所示引物扩增出400 bp的特异性条带则表明待测香蕉样品不具有香蕉枯萎病4号生理小种抗性，为香蕉枯萎病4号生理小种感病品种；反之则表明待测香蕉样品具有香蕉枯萎病4号生理小种抗性，为香蕉枯萎病4号生理小种抗性品种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的反应程序为：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 1 min，退火35℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，5个循环；变性94℃1 min，退火50℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，35个循环；终延伸72℃ 8 min。