CN111471787A - 一种鉴定水稻耐高温tt1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 - Google Patents

一种鉴定水稻耐高温tt1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴定水稻耐高温TT1基因型的PCR/LDR分子标记和方法，属于水稻育种技术领域。本发明所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，PCR引物对正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。LDR探针包括一条荧光标记探针Probe‑FAM，序列如SEQ ID NO.3所示，一条非耐高温品种等位基因特异探针Probe‑OsTT1，序列如SEQ ID NO.4所示，一条耐高温等位基因特异探针Probe‑OgTT1，序列如SEQ ID NO.5所示。本发明方法不仅能准确快速的鉴定水稻品种或育种群体中各个株系中耐高温基因TT1的基因型，而且能实现较多样品的高通量检测。与常规的分子标记基相比具有更加简便、快捷高效的优势。本发明提供的方法能提高耐高温OgTT1纯合基因型水稻株系选择效率，加快耐高温水稻品种的育种进程。

Description

一种鉴定水稻耐高温TT1基因型的PCR/LDR分子标记和方法
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的PCR/LDR的分子标记和方法。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物，水稻种植面积接近我国粮食作物种植总面积的30％，而总产量则超过我国所有粮食总产量的三分之一。然而全球工业化后温室气体排放导致的全球变暖成日益成为障碍粮食安全一个重要的不利因素。在我国，高温热害已经成为影响水稻生产最重要因素之一，而长江中下游作为主要的水稻产区也成为高温热害的重灾区。
在全球气候持续变暖、水稻生长期间短期高温热害频发的背景下，开展水稻耐高温机理研究，培育耐高温的水稻新品种对水稻生产意义重大。2015年，Li等人鉴定了非洲栽培稻CG14中一个耐高温主效数量性状位点(QTL)TT1。序列分析表明水稻种TT1基因编码一个高度保守的26S蛋白酶体α2亚基，26S蛋白酶体参与泛素化蛋白的降解，研究发现水稻中过表达非洲栽培稻CG14中OsTT1的可以显著增强水稻的耐热性。OsTT1的编码区序列与亚洲栽培稻中的等位基因OsTT1相比，有3个SNP位点SNP1、SNP2和SNP3，其中SNP2位点在亚洲栽培稻中是一个碱基G，而非洲栽培稻品种CG14中是一个碱基A，导致亚洲栽培稻中OsTT1基因编码蛋白质的第99个为氨基酸为精氨酸，而非洲栽培稻CG14中OgTT1基因编码蛋白质的第99为组氨酸。从而使得非洲栽培稻CG14品种具有更强的耐高温特性(Li XM,et al.,Natural alleles of a proteasome α2 subunit gene contribute to thermotoleranceand adaptation of African rice,Nature genetics,2015,10.1038/ng.3305)。OsTT1的发现对于培育耐高温的水稻品种具有重要的价值。
聚合酶链式反应-连接酶检测反应(polymerase chain reaction/ligasedetection reaction,PCR/LDR)是今年来发展起来的一种核酸检测技术，该方法具有较高灵敏度、准确度，并且该方法能够实现多个遗传位点的同时检测，实现较高通量的基因型检测，在医学广泛的用于疾病的诊断(Gibriel A A et al.，Advances in ligase chainreaction and ligation-based amplifications for genotyping assays:Detectionand applications.Mutat Res.,2017,773:66-90)。本发明利用PCR/LDR技术，开发了用于鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的分子标记方法，可用于快速的鉴定水稻种质资源和育种群体中耐高温基因TT1的基因型，相对于传统的分子标记方法具有经济、高效和高准确率的优势。
发明内容
本发明的技术问题：非洲栽培稻CG14中OsTT1的编码区序列与亚洲栽培稻中的等位基因OsTT1相比，有3个SNP位点SNP1、SNP2和SNP3，其中SNP2位点在亚洲栽培稻中的是一个碱基G，而非洲栽培稻CG14中是一个碱基A。基于此，本发明针对传统基于PCR、电泳技术的分子标记技术的检测过程相对繁琐，不利于进行较多样品时的高通量分析等缺点，设计了一种基于PCR/LDR技术的分子标记，用于快速、准确的鉴定水稻耐高温基因TT1的基因型，为筛选鉴定携带有OsTT1等位基因水稻种质资源和耐高温水稻品种的标记辅助选择育种提供参考。
本发明的第一个目的是提供一种鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTTTCTTCCAGTGGCATGGG-3’；(SEQ ID NO.1)
反向引物序列：5’-GGATAGCACTGTAAAACTGC-3’；(SEQ ID NO.2)
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1，和一条耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-GATAATACTGTTGTGCTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FA M-3’；
所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAC-3’；
所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAT-3’。
优选地，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和26个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
优选地，所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1由26个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
本发明第二个目的是提供上述分子标记在水稻育种过程对耐高温基因TT1基因型的鉴定中的应用。
本发明第三个目的是提供一种鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)水稻植株基因组DNA的提取；
(2)利用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTTTCTTCCAGTGGCATGGG-3’；(SEQ ID NO.1)
反向引物序列：5’-GGATAGCACTGTAAAACTGC-3’；(SEQ ID NO.2)
(3)以PCR扩增产物为模板，用LDR探针进行LDR反应；所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1，和一条耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-GATAATACTGTTGTGCTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FA M-3’；
所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAC-3’；
所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAT-3’；
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序，根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
本发明提供的鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的方法具体包括以下步骤：
(1)水稻植株叶片基因组DNA的提取：取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl 1.5×CTAB溶液(1.5％CTAB，75mM Tris-HCl，15mM EDTA，1.05M NaCl，PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA，放-20℃冰箱备用。
(2)PCR扩增体系：25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mM Tris-HCl(pH＝8.8),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.8％(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM，以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。
(3)LDR反应体系：10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5)；10mM MgCl2；10mM DTT；1mM NAD+；3条LDR探针各LDR 0.2pmol；2U的Taq DNA连接酶；4μl的PCR产物。LDR反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。反应结束后的LDR产物用ABI 3730 DNA测序仪分析，根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品的水TT1基因型。若FAM荧光峰值在93个碱基的位置，则对应样品含有耐高温等位基因OgTT1。若FAM荧光峰值在95个碱基的位置；则对应样品不含有耐高温等位基因OgTT1；若存在93和95两个峰，则对应样品为杂合型。
本发明与现有技术相比，其有效效果为：本发明提供的一种鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的分子标记方法，采用PCR关联LDR方法(聚合链式酶反应关联连接酶检测反应)进行检测，本发明提供的方法能够方便的实现水稻耐高温TT1基因的分型，得到的结果具有可靠、稳定、操作简便、快速的特点，适用于较多样品的高通量检测，在水稻种质资源水稻TT1的基因型鉴定，和耐高温水稻新品种的分子辅助育种中有较大的应用价值。
附图说明
图1为申繁14和WYJCG14中TT1基因的SNP2位点测序结果。
图2为实施例1的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
1、水稻材料
申繁14是三系杂交粳稻花优14的恢复系，WYJCG14是携带有耐高温等位基因OgTT1的近等基因系，惠赠与中国科学院植物生理生态研究所林鸿宣院士。通过测序确定了申繁14和WYJCG14的TT1基因的SNP2位点分别为A和G,表明申繁14和WYJCG14分别携带OsTT1和OgTT1等位基因(图1)，所使用的F1来源于申繁14与WYJCG14的杂交。
2、水稻基因组DNA提取：
申繁14、WYJCG14及其杂交F1代水稻植株各取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl1.5×CTAB溶液(1.5％CTAB，75mM Tris-HCl，15mM EDTA，1.05M NaCl，PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA，放-20℃冰箱备用。
3、PCR扩增：
PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTTTCTTCCAGTGGCATGGG-3’；(SEQ ID NO.1)
反向引物序列：5’-GGATAGCACTGTAAAACTGC-3’；(SEQ ID NO.2)；
申繁14、WYJCG14及其杂交F1代水稻基因组DNA，进行PCR扩增，所用PCR正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。PCR扩增体系：25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mM Tris-HCl(pH＝8.8),1.5mMMgCl2,50mM KCl,0.8％(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM，以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。
4、对PCR扩增产物进行LDR反应：
LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1，和一条耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-GATAATACTGTTGTGCTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAC-3’；
所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAT-3’。
LDR反应体系：10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5)；10mM MgCl2；10mM DTT；1mM NAD+；3条LDR探针各LDR 0.2pmol；2U的Taq DNA连接酶；4μl的PCR产物。LDR反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。
LDR反应产物的检测：
反应结束后的LDR产物用ABI 3730DNA测序仪分析，根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品的TT1基因的基因型。若FAM荧光峰值在93个碱基的位置，则对应样品为OgTT1基因型。若FAM荧光峰值在95个碱基的位置，则对应样品OsTT1基因型；若存在93和95两个峰，则对应样品为OgTT1/OsTT1杂合基因型。申繁14、WYJCG14及其杂交F1三个样品的检测结果见图2。
实施例2
实施例2中所用水稻样品为申繁14和WYJCG14杂交F2代群体的24个株系，其他检测的步骤和方法与实施例1相同。检测结果见表1。
Figure BDA0002442111130000071
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，同样落于本发明所要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种鉴定水稻耐高温TT1基因型的PCR/LDR分子标记和方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttcttcca gtggcatggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatagcact gtaaaactgc 20
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gataatactg ttgtgcttgc tttttttttt tttttttttt tttttt 46
<210> 4
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttttttt tttttttttt ttttttacca tcaaatacct tgtacagac 49
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttttttt tttttttttt ttttaccatc aaataccttg tacagat 47

Claims (7)

1.一种鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTTTCTTCCAGTGGCATGGG-3’；(SEQ ID NO.1)
反向引物序列：5’-GGATAGCACTGTAAAACTGC-3’；(SEQ ID NO.2)
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1，和一条耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-GATAATACTGTTGTGCTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAC-3’；
所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAT-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和26个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1由26个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
4.权利要求1-3中任一项所述分子标记在水稻育种过程对耐高温基因TT1基因型的鉴定中的应用。
5.一种鉴定水稻耐高温基因TT1基因型的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)水稻植株基因组DNA的提取；
(2)利用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTTTCTTCCAGTGGCATGGG-3’；(SEQ ID NO.1)
反向引物序列：5’-GGATAGCACTGTAAAACTGC-3’；(SEQ ID NO.2)
(3)以PCR扩增产物为模板，用LDR探针进行LDR反应；所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1，和一条耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-GATAATACTGTTGTGCTTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAC-3’；
所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATCAAATACCTTGTACAGAT-3’；
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序，根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和26个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述非耐高温品种等位基因特异探针Probe-OsTT1由26个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；所述耐高温等位基因特异探针Probe-OgTT1由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成；两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
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