CN111334604A - 一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 - Google Patents
一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111334604A CN111334604A CN202010249141.2A CN202010249141A CN111334604A CN 111334604 A CN111334604 A CN 111334604A CN 202010249141 A CN202010249141 A CN 202010249141A CN 111334604 A CN111334604 A CN 111334604A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- sequence
- ldr
- seq
- rice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101150045313 COLD1 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 38
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 66
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 43
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 244000184734 Pyrus japonica Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 22
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 5
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100029173 Phaeosphaeria nodorum (strain SN15 / ATCC MYA-4574 / FGSC 10173) SNP2 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100094821 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SMX2 gene Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCOCCO)C=C1 LBCZOTMMGHGTPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 2
- 240000002582 Oryza sativa Indica Group Species 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000034353 G alpha subunit Human genes 0.000 description 1
- 108091006099 G alpha subunit Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003287 bathing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000009394 selective breeding Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记及方法,属于水稻育种技术领域。本发明所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针,PCR引物对正向引物序列如SEQ ID NO.1所示,反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。LDR探针包括一条荧光标记探针Probe‑FAM,序列如SEQ ID NO.3所示,一条籼型等位基因特异探针Probe‑ind,序列如SEQ ID NO.4所示,一条粳型等位基因特异探针Probe‑jap,序列如SEQ ID NO.5所示。本发明方法不仅能准确快速的鉴定水稻品种或育种群体中各个株系中耐低温基因COLD1的基因型,而且能实现较多样品的高通量检测。与常规的分子标记基相比具有更加简便、快捷高效的优势。本发明提供的方法能进一步提高COLD1‑ind纯合基因型株系的选择效率,加快耐低温水稻品种的育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域,尤其涉及一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR的分子标记和方法。
背景技术
水稻是起源于热带和亚热带地区的农作物,因此对低温胁迫非常敏感,尤其是苗期和孕穗期,这是限制水稻种植区域的一个主要因素。在水稻的种植过程中,由于人工的驯化和选择使粳稻种植区域延伸到年积温较低的温带和寒带地区。
中科院植物研究所种康研研究组与中国水稻研究所钱前研究组以及其他合作者分析了127个不同水稻品种和野生稻中COLD1基因序列,发现了7个SNP位点,其中粳稻特异的SNP2影响了COLD1蛋白活性而赋予粳稻耐寒性。研究发现,包含粳稻COLD1基因的籼稻近等基因系以及超表达该基因的粳稻材料都显著增强了耐寒性,而功能缺失突变体cold1-1或RNAi株系却对低温非常敏感。COLD1基因编码一个G-蛋白信号调节因子,定位于细胞质膜和内质网。水稻处于低温胁迫是,COLD1蛋白与G-蛋白α亚基RGA互作,激活Ca2+通道,触发下游耐寒防御反应,使G-蛋白GTP酶活性增强。该成果揭示了通过驯化得到的COLD1等位基因和特异SNP赋予水稻耐寒性的新机制。粳型COLD1等位基因可直接用于对超级杂交稻亲本9311和其它籼粳稻的耐寒性改良,对基于分子辅助育种培育水稻耐寒新品种具有重要的应用前景(Ma Y,et al.,COLD1 Confers Chilling Tolerance in Rice,Cell.,2015,160:1-13)。
聚合酶链式反应-连接酶检测反应(polymerase chain reaction/ligase detectionreaction,PCR/LDR)是今年来发展起来的一种核酸检测技术,该方法具有较高灵敏度、准确度,并且该方法能够实现多个遗传位点的同时检测,实现较高通量的基因型检测,在医学广泛的用于疾病的诊断(Gibriel A A et al.,Advances in ligase chain reaction andligation-based amplifications for genotyping assays:Detection andapplications.Mutat Res.,2017,773:66-90)。本发明利用PCR/LDR技术,开发了用于鉴定COLD1基因型的分子标记方法,可用于快速的鉴定水稻种质资源和育种群体中COLD1的基因型,相对于传统的分子标记方法具有经济、高效和高准确率的优势。
发明内容
本发明的技术问题:籼型和粳型COLD1基因第四个外显子中的一个单核苷酸多态性位点SNP2,在SNP2位点,粳稻为一个碱基A,而大多数的籼稻为碱基T。基于此,本发明针对传统基于PCR、电泳技术的分子标记技术的检测过程相对繁琐,不利于进行较多样品时的高通量分析等缺点,设计了一种基于PCR/LDR技术的分子标记,用于快速、准确的鉴定COLD1基因的基因型,为筛选鉴定携带有粳型COLD1等位基因水稻种质资源和耐低温胁迫水稻品种的标记辅助选择育种提供参考。
本发明第一个目的是提供一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记,其特征在于,所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针,其中,所述PCR引物序列为:
正向引物序列:5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’;(SEQ ID NO.1)
反向引物序列:5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’;(SEQ ID NO.2)
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM,一条籼型等位基因特异探针Probe-ind,和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap:
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示:
5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’;
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’;
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’。
优选地,所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和20个碱基的寡聚核苷酸T组成,寡聚核苷酸T的长度可以调节,根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度;所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记,5’进行磷酸化标记。
优选地,所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成;所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成;两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
本发明第二个目的在于提供上述分子标记在水稻育种过程对耐低温基因COLD1基因型的鉴定中的应用。
本发明第三个目的是提供一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)水稻植株基因组DNA的提取;
(2)利用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增;所述PCR引物序列为:
正向引物序列:5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’;(SEQ ID NO.1)反向引物序列:5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’;(SEQ ID NO.2)
(3)以PCR扩增产物为模板,用LDR探针进行LDR反应;所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM,一条籼型等位基因特异探针Probe-ind,和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap:
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示:
5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’;
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序,根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
本发明提供的鉴定COLD1基因型的方法具体可包括以下步骤:
(1)水稻植株叶片基因组DNA的提取:取50mg左右叶片,用剪刀剪碎,放入2ml离心管,加入600μl 1.5×CTAB溶液(1.5%CTAB,75mM Tris-HCl,15mM EDTA,1.05M NaCl,PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠,在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s;研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min,加入450μl氯仿,剧烈震荡后,12000转/min离心10min;取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中,加入900μl的无水乙醇,混匀后在-20℃冰箱放置10min,12000转/min离心10min,弃上清,晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA,放-20℃冰箱备用。
(2)PCR扩增体系:25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA,正向引物和反向引物各0.5pmol,10mM Tris-HCl(pH=8.8),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.8%(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM,以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为:95℃预变性2分钟;然后40个循环的94℃变性30秒,56℃退火90秒,72℃延伸60秒;最后72℃延伸10分钟。
(3)LDR反应体系:10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5);10mM MgCl2;10mMDTT;1mM NAD+;3条LDR探针各LDR 0.2pmol;2U的Taq DNA连接酶;4μl的PCR产物。LDR反应程序:95℃变性2分钟;40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。反应结束后的LDR产物用ABI 3730DNA测序仪分析,根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品的COLD1基因型。若FAM荧光峰值在81个碱基的位置,则对应样品的COLD1基因型为籼型。若FAM荧光峰值在86个碱基的位置;则对应样品的COLD1基因型为粳型;若存在81和86两个峰,则对应样品的COLD1基因型为杂合型。
本发明与现有技术相比,其有效效果为:
本发明提供的一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的分子标记方法,采用PCR关联LDR方法(聚合链式酶反应关联连接酶检测反应)进行检测,本发明提供的方法能够方便的实现水稻耐低温COLD1基因的分型,得到的结果具有可靠、稳定、操作简便、快速的特点,适用于较多样品的高通量检测,在水稻种质资源耐低温基因COLD1的基因型鉴定,和耐低温水稻新品种的分子辅助育种中有较大的应用价值。
附图说明
图1为申繁14和9311中COLD1基因的SNP2位点测序结果。
图2为实施例1的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。
实施例1
1、水稻材料
申繁14是三系杂交粳稻花优14的恢复系,9311是超级杂交稻亲本籼稻品种,我国在2002年完成了9311的全基因组草图,通过测序发现申繁14和931中COLD1基因的SNP2位点分别为A和T,表明申繁14和9311分别携带粳型和籼型的COLD1基因(图1),所使用的F1来源于申繁14与9311的杂交。
2、水稻基因组DNA提取:
申繁14、9311及其杂交F1代水稻植株各取50mg左右叶片,用剪刀剪碎,放入2ml离心管,加入600μl1.5×CTAB溶液(1.5%CTAB,75mM Tris-HCl,15mM EDTA,1.05M NaCl,PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠,在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s;研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min,加入450μl氯仿,剧烈震荡后,12000转/min离心10min;取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中,加入900μl的无水乙醇,混匀后在-20℃冰箱放置10min,12000转/min离心10min,弃上清,晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA,放-20℃冰箱备用。
3、PCR扩增:
PCR引物序列为:
正向引物序列:5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’;(SEQ ID NO.1)
反向引物序列:5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’;(SEQ ID NO.2);
申繁14、9311及其杂交F1代水稻基因组DNA,进行PCR扩增,所用PCR正向引物如SEQ IDNO.1所示,反向引物如SEQ ID NO.2所示。PCR扩增体系:25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA,正向引物和反向引物各0.5pmol,10mM Tris-HCl(pH=8.8),1.5mM MgCl2,50mMKCl,0.8%(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM,以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为:95℃预变性2分钟;然后40个循环的94℃变性30秒,56℃退火90秒,72℃延伸60秒;最后72℃延伸10分钟。
4、对PCR扩增产物进行LDR反应:
LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM,一条籼型等位基因特异探针Probe-ind,和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap:
荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示:
5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’
粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’;
LDR反应体系:10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5);10mM MgCl2;10mMDTT;1mM NAD+;3条LDR探针各LDR 0.2pmol;2U的Taq DNA连接酶;4μl的PCR产物。LDR反应程序:95℃变性2分钟;40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。
LDR反应产物的检测:
反应结束后的LDR产物用ABI 3730DNA测序仪分析,根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品的COLD1基因的基因型。若FAM荧光峰值在81个碱基的位置,则对应样品的COLD1基因型为籼型。若FAM荧光峰值在86个碱基的位置,则对应样品的COLD1基因型为粳型;若存在81和86两个峰,则对应样品的COLD1基因型为杂合型。申繁14、9311及其杂交F1三个样品的检测结果表明申繁14携带粳型COLD1基因,9311携带籼型COLD1基因,F1则为杂合型(图2)。
实施例2
实施例2中所用水稻样品为申繁14和9311杂交F2代群体的48个株系,其他检测的步骤和方法与实施例1相同。检测结果见表1。
应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围,凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案,同样落于本发明所要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记和方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacacagtgt gctttgattt c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtctccat ggattgcatg 20
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttcatcaat ttccctgtaa tttttttttt tttttttttt 40
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttttttt ttttttttcc tttccaatgt tttgatgtcc a 41
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttttttt tttttttttt tttcctttcc aatgttttga tgtcct 46
Claims (7)
1.一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的PCR/LDR分子标记,其特征在于,所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针,其中,所述PCR引物序列为:
正向引物序列:5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’;(SEQ ID NO.1)
反向引物序列:5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’;(SEQ ID NO.2)
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM,一条籼型等位基因特异探针Probe-ind,和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap:
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示:
5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’;
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’;
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记,其特征在于,所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和20个碱基的寡聚核苷酸T组成,寡聚核苷酸T的长度可以调节,根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度;所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记,5’进行磷酸化标记。
3.根据权利要求1所述的分子标记,其特征在于,所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成;所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成;两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
4.权利要求1-3中任一项所述分子标记在水稻育种过程对耐低温基因COLD1基因型的鉴定中的应用。
5.一种鉴定水稻耐低温基因COLD1基因型的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)水稻植株基因组DNA的提取;
(2)利用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增;所述PCR引物序列为:
正向引物序列:5’-CACACAGTGTGCTTTGATTTC-3’;(SEQ ID NO.1)
反向引物序列:5’-ATGTCTCCATGGATTGCATG-3’;(SEQ ID NO.2)
(3)以PCR扩增产物为模板,用LDR探针进行LDR反应;所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM,一条籼型等位基因特异探针Probe-ind,和一条粳型等位基因特异探针Probe-jap:
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示:
5’-P-TTTCATCAATTTCCCTGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’
所述籼型等位基因特异探针Probe-ind序列如SEQ ID NO.4所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCA-3’
所述粳型等位基因特异探针Probe-jap序列如SEQ ID NO.5所示:
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTCCAATGTTTTGATGTCCT-3’;
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序,根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述荧光标记探针Probe-FAM由一段和模板配对的序列和20个碱基的寡聚核苷酸T组成,寡聚核苷酸T的长度可以调节,根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度;所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记,5’进行磷酸化标记。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述籼型等位基因特异探针Probe-ind由18个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成;所述粳型等位基因特异探针Probe-ind由23个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的和模板配对的序列组成;两条等位基因特异探针的3’端的最后一个碱基分别于两个等位基因的功能性SNP位点配对。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010249141.2A CN111334604A (zh) | 2020-04-01 | 2020-04-01 | 一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010249141.2A CN111334604A (zh) | 2020-04-01 | 2020-04-01 | 一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111334604A true CN111334604A (zh) | 2020-06-26 |
Family
ID=71178678
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010249141.2A Pending CN111334604A (zh) | 2020-04-01 | 2020-04-01 | 一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111334604A (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101985659A (zh) * | 2010-11-13 | 2011-03-16 | 上海交通大学 | 检测精神分裂关联基因的试剂盒及其制备方法 |
CN102453749A (zh) * | 2010-10-18 | 2012-05-16 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 检测食品中转基因成分的方法 |
CN108371105A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-08-07 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法 |
CN109251996A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-01-22 | 上海市农业科学院 | 检测水稻耐低温基因COLD1基因型的dCAPS标记及应用 |
-
2020
- 2020-04-01 CN CN202010249141.2A patent/CN111334604A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102453749A (zh) * | 2010-10-18 | 2012-05-16 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 检测食品中转基因成分的方法 |
CN101985659A (zh) * | 2010-11-13 | 2011-03-16 | 上海交通大学 | 检测精神分裂关联基因的试剂盒及其制备方法 |
CN108371105A (zh) * | 2018-03-16 | 2018-08-07 | 广东省农业科学院水稻研究所 | 一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法 |
CN109251996A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-01-22 | 上海市农业科学院 | 检测水稻耐低温基因COLD1基因型的dCAPS标记及应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
YITING SHI ET AL.: ""One SNP in COLD1 Determines Cold Tolerance during Rice Domestication"", 《 JOURNAL OF GENETICS AND GENOMICS》 * |
周国华主编: "《SNP检测技术与个体化药物治疗》", 28 February 2015, 苏州:苏州大学出版社 * |
李江华著: "《烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)基因多态性与心脑血管病关系的代谢组学研究》", 30 November 2017, 北京:科学技术文献出版社 * |
田孟祥等: ""水稻苗期耐低温基因COLD1新功能标记的设计与验证"", 《作物杂志》 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108893551B (zh) | 一种检测花生高油酸含量的分子标记方法及应用 | |
CN107916299B (zh) | 普通小麦snp位点标记及其在小麦相关性状检测中的应用 | |
CN113355446B (zh) | 与白菜紫色性状相关的InDel分子标记及其应用 | |
CN106498088B (zh) | 基于SNP位点鉴定糙果苋的CAPs分子标记及其应用 | |
CN114427007A (zh) | 一种与苦瓜全雌性相关的kasp分子标记及其应用 | |
CN109182557B (zh) | 一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的snp分子标记及其应用 | |
CN111471787A (zh) | 一种鉴定水稻耐高温tt1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 | |
CN112126691B (zh) | 利用猪2号染色体基因多态性位点辅助检测猪背膘厚性状的方法、引物、试剂盒及应用 | |
CN111471790B (zh) | 与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-7D.1紧密连锁的分子标记及应用 | |
CN117683927A (zh) | 水稻抗稻瘟病基因的功能性kasp分子标记及其应用 | |
CN114606332A (zh) | 用于判断西瓜果肉硬度的SNP位点、Hf-KASP1标记及其应用 | |
CN116377082A (zh) | 绵羊lcorl基因单核苷酸多态性标记在生长性状选择中的应用 | |
CN113736866B (zh) | 用于检测番茄黄化曲叶病毒病抗性的snp位点组合及其应用 | |
CN106636406B (zh) | 与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用 | |
CN111363843A (zh) | 鉴定水稻硝酸盐转运蛋白基因nrt1.1b基因型的pcr/ldr分子标记和方法 | |
CN111334604A (zh) | 一种鉴定水稻耐低温基因cold1基因型的pcr/ldr分子标记和方法 | |
CN110747280B (zh) | 与马寒冷适应性相关的te标记及其应用 | |
CN111647677B (zh) | 与小麦籽粒灌浆速率QTL QGfr.sicau-6D紧密连锁的分子标记及应用 | |
CN114606335A (zh) | 玉米抗甘蔗花叶病毒病基因的kasp分子标记的开发及应用 | |
CN114908182A (zh) | 一种与黄瓜全雌性状相关的snp标记及其应用 | |
CN114262741A (zh) | 苏氏圆腹鲶抗病性状相关的snp分子标记及其应用 | |
CN111560457A (zh) | 一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E2的PCR/LDR分子标记和方法 | |
CN113528703A (zh) | 水稻稻瘟病抗性基因Pid3-A4的KASP分子标记开发及其应用 | |
CN112280887B (zh) | 用于栝楼苗期雌雄株基因表达研究的内参基因及其应用 | |
CN113736906B (zh) | 用于检测番茄黄萎病抗性的snp位点组合及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200626 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |