CN108371105A - 一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法。本发明利用高密度分子标记的分型结果，结合核心系谱品种重要性状(如抗逆、品质、产量等)相关的标记和基因组区段信息，构建核心系谱品种为主体，引入其他品种优良基因和性状的杂交育种策略，通过整合现有的优质品种资源，实现快速定向育种。本发明的方法极大减少了选种的盲目性和随机性，提高育种效率、降低育种成本；以全基因组高密度SNP标记进行辅助选择，提高了选择效率；同时，获得的衍生品种表型信息和遗传信息，也方便了后续的聚合育种。在聚合育种过程中，随着更多优质种质资源的引入，不断优化和改进最优片段组合模型，加速培育聚合更多优势基因和片段的品种。

Description

一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法
技术领域
本发明属于水稻育种技术领域，尤其涉及一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法。
背景技术
(1)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。它是生物可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP数量多，分布广泛，适于快速、规模化筛查，易于基因分型，在分子育种领域有着广泛的应用。本发明所采用的高密度分子标记，如无特殊说明，通常情况下指SNP，应当理解，采用其他分子标记同样适用于本发明的方法。
(2)第二代DNA测序技术(NGS)是一种高通量低成本的测序技术。利用NGS技术，对已知基因组序列的物种，进行不同个体的全基因组重测序，通过生物信息学分析，与参考基因组进行序列比对，变异检测，得到群体SNP信息。同样，我们可以采用SNP芯片获得SNP信息。SNP生物芯片检测通量很大，一次可以检测几十万到几百万个SNP位点，检测准确性很高(可以达到99.9％以上)，检测费用低廉。
(3)PCR-LDR SNP分型技术是PCR技术和LDR(Ligase Detection Reaction,连接酶检测反应)相结合的检测技术。LDR是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，反之则可以进行连接反应。该技术可进行多重反应，经济、高效。适合中低SNP分型规模，30个SNP位点以内，样本量千个以内的基因型分型试验。
(4)在现代育种过程中，通过核心系谱品种与历史杂交品种间的群体SNP分型信息，构建重组断点图谱(bin map)，在全基因组范围划分窗口(bin)，以窗口为单位进行重新分型，从而了解核心系谱品种在历史育种过程中的动态重组事件，同时阐明育种过程中核心系谱品种被人工强烈选择的基因组区段(通常与优良性状相关)。通过传统的QTL作图分析，结合窗口内的基因信息，进而确定基因组区段与性状(如抗逆、品质等)之间的强相关关系。对于核心系谱品种，获得与各种性状强相关的基因组区段信息，在后续的育种设计中具有重要的指导意义。【相关文献：Pedigree-based analysis of derivation of genomesegments of an elite rice reveals key regions during its breeding.PlantBiotechnology Journal,2016,14(2):638-648】
(5)杂交育种是将两个或多个品种的优良性状通过交配集中在一起，再经过选择和培育，获得新品种的方法。传统的杂交育种方法需要广撒网，存在成本高，投入大，周期长的问题。杂交育种通过优良性状进行后代的筛选，然而对于数量性状，很容易出现误选的情况，这就会充满随机性和运气成分，产生大量的无效重复工作。因此，基于遗传信息(序列、基因、标记等)的设计育种是未来育种领域的发展趋势。
分子标记辅助育种技术是传统的育种技术与分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)相结合的育种技术。分子标记辅助选择为基因聚合提供了一种有效方法，它通过分析与基因紧密连锁的分子标记鉴别目标基因是否存在，可以在早代进行选择，并克服了常规育种中将多个性状或控制某一性状的多个基因聚合于一个品种时需要对逐个性状或基因进行表型筛选鉴定的缺陷。
长期以来，研究者一直在研发多基因聚合的方法，但是，迄今水稻还难以实现高效简捷地聚合多基因的目标。首先，分子标记辅助选择育种技术的成效依赖于对目标基因的功能与效应的认知程度，尽管目前对水稻功能基因组的研究已很深入，但对基因间的互作与调控还知之甚少，目前应用分子标记辅助选择育种成功的案例也都是对单个质量性状基因和效应较大的数量性状基因的应用。其次，分子标记辅助聚合育种技术仍然是建立在传统杂交育种基础之上的目标基因选择技术。对于水稻这样的自花授粉作物，每聚合一个基因仍然需要进行一次杂交，聚合的基因越多，杂交次数越多，育种周期也越长。因此，如何提高杂交和选择的效率，仍然是水稻多基因聚合育种面临的重要障碍。
这里，针对传统杂交育种方法与现行分子标记辅助育种技术存在的瓶颈。我们发明了新的杂交育种策略，一种利用高密度分子标记基于核心系谱品种的聚合育种方法。本方法利用与各种性状强相关的系谱核心基因组区段信息为选择基础，降低基因间互作的干扰；以全基因组高密度SNP标记辅助选择，同时对多个基因进行选择，提高选择效率；以核心系谱品种为背景亲本，以系谱核心基因组区段信息为基础建立多个优良性状导入系再杂交，减少杂交次数提高基因聚合效率。本方法相对于传统方法，极大节省育种时间和成本，实现快速定向育种。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法。
本发明提出了新的杂交育种策略，旨在解决传统杂交育种广撒网、高投入、长周期的难题，从而实现精细化的快速定向育种。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，包括如下步骤：
(1)核心系谱品种和需要引入的外源品种进行重测序或SNP芯片检测，得到高密度分子标记(SNP)分型结果；
(2)利用分型结果，结合性状关联的基因组区段信息，分析确定核心系谱品种需要引入的外源片段信息；
(3)将核心系谱品种与需要引入的外源品种杂交，获得F1代；
(4)F2群体大批量种植，F2群体先利用步骤(2)确定的外源片段内部SNP标记对F2进行筛选，筛选出尽可能多的包含外源片段的F2单株(约500～1000株)，接着根据表型进行进一步筛选出偏向某一亲本或具有某些表型值的F2单株(约50株)；也可以先根据表型筛选出偏向某一亲本或具有某些表型值的F2单株(约500～1000株)，再利用步骤(2)确定的外源片段内部SNP标记对F2进行筛选，筛选出尽可能多的包含外源片段的F2单株(约50株)，具体操作根据资金与育种目标和条件而定；
(5)步骤(4)筛选后的F2单株不断进行自交，在这个过程中根据表型不断保留优质株，直至优良性状稳定(不发生分离)；
(6)假设F5或F6性状稳定，根据表型挑选F5或F6的优质株，进行重测序或SNP芯片基因分型，以核心系谱品种为参考进行染色体片段来源分析，保留遗传背景与核心系谱品种最接近的3～5株结果，再经过1～2代的田间选择和表型考察，选育出1个株系成为品种(自交系)；
(7)重复步骤(1)～(6)，通过核心系谱品种与众多优良品种进行杂交、自交、筛选，得到一系列以核心系谱品种为主要遗传背景的品种(自交系)；
(8)整合利用步骤(7)得到的一系列以核心系谱品种为主要遗传背景的品种(自交系)，进行聚合育种，实现快速定向育种，培育优良品种；
(9)对于亲缘关系较接近、农艺性状差异不大的品种，在步骤(2)时可先将需要引入的外源品种杂交，在F1′代或高世代通过与核心系谱品种复交将外源片段引入，再进行步骤(3)～(6)即可实现多基因快速聚合，培育优良品种。
所述的核心系谱品种为水稻核心系谱品种，优选为华南水稻核心系谱品种“黄华占”及其衍生品种，但不限于此。
所述的黄华占衍生品种优选为黄广油占，但不限于此。
步骤(2)中所述的结合性状关联的基因组区段信息为黄华占系谱基因组区段信息。
步骤(2)中所述的核心系谱品种需要引入的外源片段信息，分以下情况：
A、对于某个具体的性状，品种表型指标与核心系谱品种基本一致，遗传差异较大(同源片段比例<0.5)；对于这种情况，通过杂交重组，引入其他品种的外源片段，与核心系谱品种的片段进行组合，产生累加效应，强强联合，形成性状更优良的品种；
B、对于某个具体的性状，品种表型指标优于核心系谱品种，遗传差异程度较小(同源片段比例>0.7)；对于这种情况，品种存在效应很强的片段，使得性状表现优于核心系谱品种，通过找出该品种与核心系谱品种存在差异的片段，通过杂交重组，将该片段引入到核心系谱品种中；
C、对于某个具体的性状，品种表型指标优于核心系谱品种，遗传差异程度较大(同源片段比例<0.5)；对于这种情况，品种单个片段的效应或者片段的组合显著优于核心系谱品种，通过杂交重组，将优势片段和组合大规模引入到核心系谱品种中。
步骤(4)中所述的F2群体大批量种植的群体大小为约4000～10000株，根据亲本遗传差异大小和拟导入多少个目标性状而定。
步骤(4)中所述的对F2进行筛选时，每个外源片段内部挑选1个SNP标记。
步骤(6)中所述的F6的优质株的群体大小为约10～50株。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明利用高密度分子标记(SNP)的分型结果，结合核心系谱品种重要性状(如抗逆、品质、产量等)相关的标记和基因组区段信息，构建核心系谱品种为主体，引入其他品种优良基因和性状的杂交育种策略，通过整合现有的优质品种资源，实现快速定向育种。
(2)本发明的方法相对于传统育种，极大减少了选种的盲目性和随机性，提高育种效率、降低育种成本；相对于现行少量分子标记辅助选择育种，本发明以全基因组高密度SNP标记进行辅助选择，提高了选择效率；同时，获得的衍生品种表型信息和遗传信息，也方便了后续的聚合育种。
在后续的聚合育种过程中，结合片段标记SNP和表型筛选，在提高表型指标的情况下，尽可能筛选遗传背景接近最优组合的子代。同时，随着更多优质种质资源的引入，能够不断优化和改进最优片段组合模型，加速培育，聚合更多优势基因和片段的品种。
附图说明
图1是“黄华占”性状相关基因组区段分布示意图。
图2是“黄华占”与引入品种杂交策略示意图。
图3是核心系谱品种“黄华占”与衍生改良品种，片段基因分型分析过程示意图。
图4是核心系谱品种“黄广油占”与引入品种五广占、丰粤华占多杂交策略示意图。
图5是实施例2中稻瘟病抗性相关核心基因组区段的差异性结果；其中，HGYZ：黄广油占；HGYZ中出现的基因组区段表示所有的株系与亲本黄广油占基因型不同区段在黄广油占基因组上对应的位点；9个株系中出现的基因组区段表示每个株系与亲本黄广油占基因型不同区段的位点。
图6是实施例2中品质相关核心基因组区段的差异性结果；其中，HGYZ：黄广油占；HGYZ中出现的基因组区段表示所有的株系与亲本黄广油占基因型不同区段在黄广油占基因组上对应的位点；9个株系中出现的基因组区段表示每个株系与亲本黄广油占基因型不同区段的位点。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
为了使本发明的内容、目的及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例(以华南水稻“黄华占”为核心系谱品种的聚合育种过程)，对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的水稻品种：黄华占，审定编号：粤审稻2005010；黄广油占，审定编号：粤审稻2013001；五广占，审定编号：粤审稻2011025；丰粤华占，审定编号：粤审稻2013027；粤晶丝苗2号，审定编号：粤审稻2006067。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1
一、确定核心系谱品种与性状相关的基因组区段信息。
应用背景技术第(4)部分的研究方法，确定华南水稻核心系谱品种“黄华占”与性状相关的1000多个基因组区段信息。后续的分析处理中，这些基因组区段被认为是最小重组单元，且与育种密切相关。
文献【Pedigree-based analysis of derivation of genome segments of anelite rice reveals key regions during its breeding.Plant BiotechnologyJournal，2016，14(2)：638-648】详细介绍了通过群体重测序，结合重组断点图谱(bin map)分析、QTL作图、克隆基因信息确定“黄华占”性状关联区段的研究方法。相关结果示例说明，如下图1所示。
二、获得核心系谱品种和引入品种的SNP分型结果。
对“黄华占”和引入品种，进行高通量测序或SNP芯片检测，从而得到各个品种的SNP分型结果。SNP分型结果如表1所示，从左到右依次为SNP编号、SNP所在的染色体名称、SNP物理坐标、黄华占的SNP碱基型、引入品种1的SNP碱基型，引入品种2的SNP碱基型、以此类推。
表1、“黄华占”与引入品种的SNP分型结果
SNP ID 染色体 坐标 黄华占 品种1 品种2
F0100005918GT chr1 5918 CC CC CC
F0100026201CT chr1 26201 GG GG GG
F0100030478CT chr1 30478 AA AA AA
F0100071882CT chr1 71882 GG GG GG
F0100090669GT chr1 90669 CC CC CC
F0100149920TA chr1 149920 AA AA AA
F0100151492AG chr1 151492 AA AA AA
F0100152207GA chr1 152207 GG CC GG
F0100162529CT chr1 162529 GG GG GG
F0100171752AG chr1 171752 AA AA AA
F0100171972GA chr1 171972 GG GG GG
F0100177766GA chr1 177766 GG GG GG
F0100189396GA chr1 189396 AA AA AA
F0100196654TC chr1 196654 AA AA TT
三、以性状关联的1000多个基因组区段为单位，进行重新分型。
根据“黄华占”与引入品种的SNP分型结果，对性状相关的1000多个基因组区段进行重新分型。分型方法：以核心系谱品种“黄华占”为参考，引入品种与“黄华占”进行比较，对于某一个具体的基因组区段，比较区段内的SNP碱基型，如果碱基型一致的SNP数量比例等于1，则认为该品种对应的基因组区段与“黄华占”同源，标记为“Y”，反之，不同源，标记为“N”。基因组区段重新分型结果示例如表2所示，从左到右依次为性状类型、关联区段的染色体名称、关联区段的染色体起始坐标、关联区段的染色体终止坐标、“黄华占”区段重新分型结果、品种1区段重新分型结果、品种1与“黄华占”同源片段比例、以此类推。
表2、以黄华占为参考，基因组区段重新分型结果
四、以核心系谱品种“黄华占”为基础，确定需要引入的外源片段。
对于某个具体性状，我们用同源片段比例这个指标来衡量其他品种与核心系谱品种“黄华占”之间在遗传水平上的差异程度。同源片段比例越高，遗传差异程度越小。
对于某个具体性状，我们用“-3”、“-2”、“-1”、“0”、“1”、“2”、“3”，7个表型指标来衡量其他品种与核心系谱品种“黄华占”之间在表型水平上的差异程度。“0”表示指标基本与“黄华占”一致，“3”表示显著优于“黄华占”，“-3”表示显著劣于“黄华占”。表型指标的具体评定标准，依赖于实际的生产和实践需求。
接着，确定需要引入的外源片段，分以下3种情况：
1、对于某个具体的性状，品种表型指标与“黄华占”基本一致，为“0”，遗传差异较大(同源片段比例<0.5)。对于这种情况，通过杂交重组，引入其他品种的外源片段，与核心系谱品种“黄华占”的片段进行组合，产生累加效应，强强联合，形成性状更优良的品种。
2、对于某个具体的性状，品种表型指标优于“黄华占”，为“2”或“3”，遗传差异程度较小(同源片段比例>0.7)。对于这种情况，品种存在效应很强的片段，使得性状表现优于“黄华占”，通过找出该品种与核心系谱品种“黄华占”存在差异的片段(对应为“N”的片段)，通过杂交重组，将该片段引入到核心系谱品种“黄华占”中。
3、对于某个具体的性状，品种表型指标优于“黄华占”，为“2”或“3”，遗传差异程度较大(同源片段比例<0.5)。对于这种情况，可以推断，品种单个片段的效应或者片段的组合显著优于核心系谱品种“黄华占”，通过杂交重组，将优势片段和组合大规模引入到核心系谱品种“黄华占”中。
找出符合以上三种情况的所有性状，并且确定性状相关的片段信息。从中，挑选出品种与核心系谱品种“黄华占”非同源的片段。应当理解的是，这些被挑选引入的外源片段对于核心系谱品种“黄华占”而言，具有更高的价值，能够极大的丰富核心系谱品种优良性状的遗传多样性。
对于每个被挑选的片段，从中找出碱基型与片段分型结果一致的SNP位点，且分型一致的SNP位点在物理坐标上，连续不间断，且连续区间最大。从连续区间中部，随机挑选一个SNP位点，作为整个片段在杂交重组事件中的标志物。这里，称之为片段标记SNP位点。
五、核心系谱品种“黄华占”与引入品种进行杂交筛选得到候选F2。
杂交策略如图2和表3所示。策略A：对于遗传差异较小的引入品种1，“黄华占”与引入品种1杂交生成F1，F1自交生成F2，F2于温室内大批量育苗(约4000株)。应用实施例1第四部分得到的片段标记SNP，在SNP标记两端设计引物，利用背景技术第(3)部分的PCR-LDRSNP分型技术对4000株F2幼苗进行分型，通过比较F2后代与亲本“黄华占”的碱基型，筛选出尽可能多的包含外源片段的F2(约1千株)。接着，将这1000个F2幼苗种植到大田，根据表型进行筛选，得到约50株的优质株。策略B：对于遗传差异较大的引入品种2，“黄华占”与引入品种2杂交生成F1，F1自交生成F2，F2大田大批量种植(约1万株)。先通过表型筛选，大量剔除表型性状不符合预期的单株，筛选出表型性状较好的单株1000个。应用实施例1第四部分得到的片段标记SNP，在SNP标记两端设计引物，利用背景技术第(3)部分的PCR-LDR SNP分型技术对1000株F2幼苗进行分型，通过比较F2后代与亲本“黄华占”的碱基型，结合表型筛选出包含外源片段的优质F2单株约50株。
表3、片段标记SNP在F2代分型结果
片段标记SNP 染色体 坐标 黄华占 F2-1 F2-2 F2-3 F2-4
外源片段比例 0.3 0.5 0.7 0.9
F0130538695AG chr1 30，538，695 AA AA AA AA AA
F0124903920GA chr1 24，903，920 GG GG TT GG GG
F0134986104CT chr1 34，986，104 GG GG GG GG GG
F0225981690TC chr2 25，981，690 AA AA AA AA CC
F0203946451TG chr2 3，946，451 AA GG GG AA AA
F0313952946GA chr3 13，952，946 GG GG CC GG GG
F0317882292CT chr3 17，882，292 GG GG GG GG TT
F0432478577AG chr4 32，478，577 AA AA TT AA AA
F0421094987AG chr4 21，094，987 GG GG GG GG GG
F0505390200AG chr5 5，390，200 AA AA AA AA AA
F0507214863AG chr5 7，214，863 AA TT AA AA AA
这里，本发明相对于传统杂交育种方法，F2进行大批量种植，最大限度地获得重组事件。基于遗传信息，进行分析，明确需要引入的外源片段，结合片段标记SNP筛选和表型筛选，提高选择压力，定向地将F2后代的候选范围缩小到50株以内。极大地减少了后续的育种成本，提高了育种效率。
六、候选F2不断进行自交纯化，通过表型优选得到候选F6。
候选F2不断进行自交纯化，依据表型信息，优选得到候选F6代(约20株)。应当理解的是，经过实施例1第五部分处理，确定引入的优势外源片段在任何自交后代中都能稳定遗传。在自交纯化过程中，通过表型进行优选，其他的片段因为遗传连锁、互作和累加效应，在不同的自交后代中，会随机地，不断倾向于核心系谱品种“黄华占”，或引入品种。候选F6代的表型指标与核心系谱品种“黄华占”相比，应当优于“黄华占”。
七、候选F6中，筛选遗传背景最接近核心系谱品种“黄华占”的结果。
采用实施例1第二部分相同的高密度SNP分子标记，应用高通量测序或SNP芯片检测技术，对实施例1第六部分得到的候选F6代进行SNP分型。使用实施例1第三部分的分析方法，以核心系谱品种“黄华占”性状关联的1000多个片段为基准，计算候选F6代中的同源片段比例。从中挑选同源片段比例最高的几个结果，即遗传背景与“黄华占”最接近。将核心系谱品种“黄华占”为主要遗传背景的衍生改良品种命名为“黄华占衍生品种-1”，“黄华占衍生品种-2”，以此类推。
本发明利用高密度分子标记辅助选种，确保在F2快速稳定引入的外源片段。自交后代F6中，在保证表型指标的基础上，优选遗传背景与核心系谱品种最接近的结果。这样，构建了一系列以核心系谱品种“黄华占”为主要遗传背景的衍生改良品种。解决了传统育种中，基于表型优选方法，无法避免的大量低效重复筛选工作。相对于传统育种，本发明，极大减少了选种的盲目性和随机性，提高育种效率、降低育种成本；相对于现行少量分子标记辅助选择育种，本发明以全基因组高密度SNP标记进行辅助选择，提高了选择效率；同时，获得的衍生品种表型信息和遗传信息，也方便了后续的聚合育种。
八、使用核心系谱品种“黄华占”为主要遗传背景的衍生改良品种，进行聚合育种。
引入不同优质品种与核心系谱品种“黄华占”进行杂交重组，重复实施例1第二部分到第七部分的步骤，我们会得到一系列，以核心系谱品种“黄华占”为主要遗传背景的衍生改良品种。将核心系谱品种“黄华占”与所有衍生改良品种的SNP分型信息进行整合，参照实施例1第三部分的分析方法，以1000多个性状关联的片段为基本单元，进行基因分型。
这里，对于每一个基因组片段，片段内部，不同个体间碱基型一致的SNP比例等于1，则认为片段同源，即基因型一致。以此对片段进行聚类、去冗余、分类编号、并分型。对于核心系谱品种“黄华占”，用符号“H”表示，其他片段基因型用“H1”、“H2”等表示。具体分析过程示意图如图3所示，结果如表4所示。
表4、核心系谱品种“黄华占”与衍生改良品种，片段基因分型结果
将核心系谱品种“黄华占”与所有衍生改良品种的表型信息进行整合，应用实施例1第四部分的方法进行标准化衡量。
这里，用“-3”、“-2”、“-1”、“0”、“1”、“2”、“3”，7个表型指标来衡量衍生品种与核心系谱品种“黄华占”之间在表型水平上的差异程度。“0”表示指标基本与“黄华占”一致，“3”表示显著优于“黄华占”，“-3”表示显著劣于“黄华占”。表型指标的具体评定标准，依赖于实际的生产和实践需求。结果如表5所示。
表5、核心系谱品种“黄华占”与衍生改良品种，表型信息标准化结果。
根据表型信息标准化结果，得出每个性状对应的最优品种信息。如果表型指标一致，根据SNP分型结果，应用实施例1第七部分的方法，优先选择遗传背景与核心系谱品种“黄华占”最接近的品种。结果如表6所示。
表6、每个性状对应的最优品种信息。
性状 优势品种
抗性 衍生品种1
品质 黄华占
产量 衍生品种4
株型 衍生品种2
这里，由于衍生品种的主要遗传背景信息与核心系谱品种“黄华占”高度相似，衍生品种的某个性状，表现出比核心系谱品种“黄华占”更优异的品质，基本上可以认为是该品种性状相关的片段组合优于“黄华占”。
根据该理论指导，结合片段基因分型结果，我们推断得到在全基因组范围内最优的片段组合。结果如表7所示。
表7、全基因组范围内最优的片段组合信息。
在实际育种过程中，每个片段(最小重组单元)，不仅仅与单一性状相关，片段可能与多个性状相关。这样，理论上的最优片段组合会存在冲突和矛盾，就需要进行校正。校正方法为：对不同类型的表型进行优先级排序，如抗逆>口感，片段组合如果出现冲突，选择性状优先级高的片段组合。从而得到校正后的最优片段组合。
以校正后的最优片段组合指导聚合育种。从核心系谱品种“黄华占”所有衍生品种中，利用片段分型结果，分析找出包含最优片段组合所有遗传信息，品种数量最少的对应品种信息。这样，能够最大化地减少后续聚合育种的复杂度，并且，本发明以核心系谱品种“黄华占”为遗传背景，降低了基因间互作的干扰，提高了成种概率。
在后续的聚合育种过程中，结合片段标记SNP和表型筛选，在提高表型指标的情况下，尽可能筛选遗传背景接近最优组合的子代。同时，随着更多优质种质资源的引入，能够不断优化和改进最优片段组合模型，加速培育，聚合更多优势基因和片段的品种。
实施例2
本实施例用黄华占衍生的新一代核心系谱品种黄广油占为母本，引入品种1是五广占，引入品种2是丰粤华占。黄广油占高抗稻瘟病，米质未达优质，中感白叶枯；五广占抗稻瘟病，米质国标优质3级、省标优质2级，中抗白叶枯；丰粤华占：中抗稻瘟病，米质国标省标优质2级，中抗白叶枯。育种目的是保持黄广油占的高产和稻瘟病抗性，引入五广占和丰粤华占的优质米质性状和白叶枯抗性，选育高产、优质、抗病的常规稻品种。这3个品种都是本研究团队育成品种，亲缘关系比较接近。
一、确定核心系谱品种与性状相关的基因组区段信息。
应用背景技术第(4)部分的研究方法，确定黄广油占与性状相关的1046多个基因组区段信息：与稻瘟病抗性相关的区段79个，与稻米品质相关的区段692个，后续的分析处理中，这些基因组区段被认为是最小重组单元，且与育种密切相关。
二、获得核心系谱品种和引入品种的SNP分型结果。
对黄广油占和引入品种五广占和丰粤华占，进行全基因组SNP芯片检测，从而得到各个品种的SNP分型结果。将SNP分型结果保存于水稻全基因组SNP标记分子育种云平台。
所述的水稻全基因组SNP标记分子育种云平台是水稻全基因组SNP标记分子育种云平台[简称：SNP标记育种云平台]V1.0，登记号：2018SR164559，首次发表日期：2018年01月11日。
三、以性状关联的1046个基因组区段为单位，进行重新分型。
使用实施例1第三部分的分析方法，利用水稻全基因组SNP标记分子育种云平台对黄广油占、五广占和丰粤华占在1046个基因组区段进行重新分型，以单个基因组片段为单位进行区段同源比例统计。以黄广油占为参照，五广占在这1046个区段上的同源比例是76.77％，丰粤华占是76.39％。详细结果如表8所列：五广占在1046个区段中有243个区段的SNP标记基因型与黄广油占不同，即是这243个区段与黄广油占非同源，全部核心基因组区段的同源比例即为76.77％；丰粤华占在1046个区段中有247个区段的SNP标记基因型与黄广油占不同，即是这247个区段与黄广油占非同源，全部核心基因组区段的同源比例即为76.39％。
表8引入品种与黄广油占的核心基因组区段同源比例
样品名 参考区段数(个) 同源区段数(个) 同源比例
五广占 1046 803 0.7677
丰粤华占 1046 799 0.7639
四、以核心系谱品种“黄广油占”为基础，确定需要固定和引入的外源片段。
对于稻瘟病抗性，黄广油占的稻瘟病抗性是高抗，标记为0；五广占是抗，标记为-1；丰粤华占标记为-2。很明显黄广油占的性状较优，在后续的筛选中需要保留其相关基因组区段。利用水稻全基因组SNP标记分子育种云平台分析黄广油占、五广占和丰粤华占的全基因组差异，对黄广油占、五广占和丰粤华占在79个稻瘟病抗性相关的基因组区段上的差异进行筛选，结合人工校对，确定黄广油占特异的关键区段2个：cHTB-346和cHTB-881。在cHTB-346上开发片段SNP标记SNP-346，该标记位点黄广油占是A碱基，五广占和丰粤华占是G碱基。在cHTB-881上开发SNP标记SNP-881，该标记位点黄广油占是G碱基，五广占和丰粤华占是A碱基。这两个SNP标记被用于F2的辅助选择。
对于品质性状，黄广油占米质没有达到优质标准，标记为0；五广占米质国标优质3级、省标优质2级，标记为2；丰粤华占米质国标省标优质2级，标记为3。利用水稻全基因组SNP标记分子育种云平台分析黄广油占、五广占和丰粤华占的全基因组差异，对黄广油占、五广占和丰粤华占在692个品质相关的基因组区段上的差异进行筛选，保留五广占、丰粤华占与黄广油占有差异的区段，结合人工校对，确定与品质相关的关键区段140个。这140个区段将作为筛选单元对高世代的株系进行筛选。
对于产量性状，黄广油占是已通过国审品种，产量较高、适应性较广，在高世代筛选时以黄广油占的背景核心基因组区段为标准，越接近黄广油占优选度越高。
对于白叶枯性状，由于该性状田间鉴定较易，无需进行基因组的辅助选择。
五、核心系谱品种“黄广油占”与引入品种进行杂交筛选得到候选F2。
黄广油占、五广占和丰粤华占都是本研究团队选育出的品种，亲缘关系比较近，因此可以通过复交的方法进行基因组的聚合。杂交策略如图4所示。2013年晚造在本单位白云基地将5株经过白叶枯菌液接种鉴定后的(五广占/丰粤华占)F4′代抗性株的花粉混合，以黄广油占为母本，进行人工授粉。2014年早造F1代，种植15株(田间编号3055)，经过真假杂种鉴定后全收。2014年晚造在温室种植F2代，应用实施例2第四部分得到的2个黄广油占特异的稻瘟病抗性相关基因组区段标记SNP-346和SNP-881，在SNP标记两端设计引物，利用背景技术第(3)部分的PCR-LDR SNP分型技术对7680株F2幼苗进行分型。这些F2幼苗中，在标记SNP-346和SNP-881都是和黄广油占基因型相同的有1120株。这些单株都移栽到大田，田间编号5196。经过田间农艺性状鉴定后入选10株。
六、候选F2不断进行自交纯化，通过表型优选得到候选F5。
入选的F2单株不断进行自交纯化，应用系谱选育的方法，通过表型优选表现穗大，熟色好、株叶形态好株系，淘汰表现不佳株系。至2016年早造，获得10个F5代表型稳定一致优选株系，田间编号1672～1681区，每个株系种植50株左右。
七、候选F5中，筛选遗传背景最接近核心系谱品种“黄广油占”的结果。
采用实施例2第二部分相同的高密度SNP分子标记，应用高通量SNP芯片检测技术，对实施例2第六部分得到的候选F5代进行SNP分型。使用实施例1第三部分的分析方法，利用水稻全基因组SNP标记分子育种云平台，以核心系谱品种“黄广油占”性状关联的1046个片段为基准，计算候选F5代中的同源片段比例，即确定遗传背景与“黄广油占”的接近程度。株系同源结果见表9。根据该分析结果，1675与亲本黄广油占在核心基因组区间的同源性小于0.7，被剔除掉，不进入下一步筛选。
表9 F5代株系与黄广油占的核心基因组区段同源比例
样品名 参考区段数(个) 同源区段数(个) 同源比例
1672 1046 757 0.7237
1673 1046 912 0.8719
1674 1046 911 0.8709
1675 1046 646 0.6176
1676 1046 937 0.8958
1677 1046 943 0.9015
1678 1046 897 0.8576
1679 1046 758 0.7247
1680 1046 897 0.8576
1681 1046 900 0.8604
再使用实施例2第四部分的分析方法，利用水稻全基因组SNP标记分子育种云平台，计算引入品种基因组区段的导入情况。稻瘟病相关区间的筛选结果见图5，9个株系中1672的导入片段最多，与黄广油占差异最大，被剔除。品质相关区间的筛选见图6，9个株系中1679的导入片段最多(见表10)，被选为最优单株。最终，结合田间性状的表现，筛选出综合抗性性状和品质性状较理想的1679株系为最优组合株系，参加2016年晚造广东省农业科学院水稻研究所品比。品比结果，该品系在16个参试品系中产量排名第一，比对照比粤晶丝苗2号增产16.95％，增产极显著；优质稻综合名次第5，出糙率、整精米率、粒型和胶稠度4项达国优一级，直链淀粉含量1项达国优二级，垩白粒率1项达国优三级；中抗稻瘟病、中抗白叶枯。2017年晚造由广东省农业科学院水稻研究所推荐参加广东省水稻品种区试。
表10 F5代株系与黄广油占在品质相关核心基因组区段的差异
样品名 非同源区段数(个)
1672 71
1673 36
1674 40
1676 37
1677 24
1678 40
1679 73
1680 38
1681 37
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)核心系谱品种和需要引入的外源品种进行重测序或SNP芯片检测，得到SNP分型结果；
(2)利用分型结果，结合性状关联的基因组区段信息，分析确定核心系谱品种需要引入的外源片段信息；
(3)将核心系谱品种与需要引入的外源品种杂交，获得F1代；
(4)F2群体大批量种植，F2群体先利用步骤(2)确定的外源片段内部SNP标记对F2进行筛选，筛选出尽可能多的包含外源片段的F2单株，接着根据表型进行进一步筛选出偏向某一亲本或具有某些表型值的F2单株；或者先根据表型筛选出偏向某一亲本或具有某些表型值的F2单株，再利用步骤(2)确定的外源片段内部SNP标记对F2进行筛选，筛选出尽可能多的包含外源片段的F2单株，具体操作根据资金与育种目标和条件而定；
(5)步骤(4)筛选后的F2单株不断进行自交，在这个过程中根据表型不断保留优质株，直至优良性状稳定；
(6)假设F5或F6性状稳定，根据表型挑选F5或F6的优质株，进行重测序或SNP芯片基因分型，以核心系谱品种为参考进行染色体片段来源分析，保留遗传背景与核心系谱品种最接近的3～5株结果，再经过1～2代的田间选择和表型考察，选育出1个株系成为自交系品种；
(7)重复步骤(1)～(6)，通过核心系谱品种与众多优良品种进行杂交、自交、筛选，得到一系列以核心系谱品种为主要遗传背景的自交系品种；
(8)整合利用步骤(7)得到的一系列以核心系谱品种为主要遗传背景的自交系品种，进行聚合育种，实现快速定向育种，培育优良品种；
(9)对于亲缘关系较接近、农艺性状差异不大的品种，在步骤(2)时可先将需要引入的外源品种杂交，在F1′代或高世代通过与核心系谱品种复交将外源片段引入，再进行步骤(3)～(6)即实现多基因快速聚合，培育优良品种。
2.根据权利要求1所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的核心系谱品种需要引入的外源片段信息，分以下情况：
A、对于某个具体的性状，品种表型指标与核心系谱品种基本一致，遗传差异较大；对于这种情况，通过杂交重组，引入其他品种的外源片段，与核心系谱品种的片段进行组合，产生累加效应，强强联合，形成性状更优良的品种；
B、对于某个具体的性状，品种表型指标优于核心系谱品种，遗传差异程度较小；对于这种情况，品种存在效应很强的片段，使得性状表现优于核心系谱品种，通过找出该品种与核心系谱品种存在差异的片段，通过杂交重组，将该片段引入到核心系谱品种中；
C、对于某个具体的性状，品种表型指标优于核心系谱品种，遗传差异程度较大；对于这种情况，品种单个片段的效应或者片段的组合显著优于核心系谱品种，通过杂交重组，将优势片段和组合大规模引入到核心系谱品种中。
3.根据权利要求1所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：
所述的核心系谱品种为水稻核心系谱品种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：
所述的核心系谱品种为华南水稻核心系谱品种“黄华占”及其衍生品种。
5.根据权利要求4所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：所述的黄华占衍生品种为黄广油占。
6.根据权利要求4所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的结合性状关联的基因组区段信息为黄华占系谱基因组区段信息。
7.根据权利要求1～3任一项所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的F2群体大批量种植的群体大小为4000～10000株，根据亲本遗传差异大小和拟导入多少个目标性状而定。
8.根据权利要求1或2所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的对F2进行筛选时，每个外源片段内部挑选1个SNP标记。
9.根据权利要求1或2所述的基于核心系谱品种的高密度分子标记辅助聚合育种方法，其特征在于：
步骤(6)中所述的F5或F6的优质株的群体大小为10～50株。
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