CN114107550B - 一种与大豆百粒重相关的qtl、分子标记、扩增引物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大豆分子育种领域，具体涉及一种与大豆百粒重相关的QTL、分子标记、扩增引物及应用。本发明以栽培大豆和野生豆为亲本构建遗传群体，定位到1个与大豆百粒重相关的QTL，位于大豆第7号染色体的1641719bp‑1795446bp区间，标记区间仅为0.15Mb，并鉴定了一个与百粒重相关的分子标记SSR‑09‑089，可用于分子标记辅助选择育种以及挖掘相关功能基因，同时可以利用野生资源，拓宽栽培大豆的遗传基础。

Description

一种与大豆百粒重相关的QTL、分子标记、扩增引物及应用

技术领域

本发明涉及大豆分子育种领域，具体涉及一种与大豆百粒重相关的QTL、分子标记、扩增引物及应用。

背景技术

百粒重是大豆产量的重要构成因素，而且与大豆的外观品质息息相关。针对百粒重性状进行品种改良，对于提高大豆产量和品质具有重要意义。但是百粒重属于复杂的数量性状，遗传力较高，受多基因控制，传统育种周期长，难度大，需要耗费大量的人力物力。随着分子遗传学的发展，分子标记辅助选择育种为人们加快育种进程提供了新的途径。标记辅助选择育种是指在育种选择时通过对与功能基因相连锁的分子标记对目标性状进行间接选择。利用分子标记对数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)进行定位，是进行标记辅助选择育种的重要手段。

目前国内外科研工作者已经定位了数以百计的大豆百粒重QTL，大部分QTL都是在初级作图群体中得到的，定位区间大。而且群体双亲多为栽培种，在人类长期的驯化选择中，导致其遗传多样性比较单一。野生资源种中遗传变异丰富，具有很多优良性状，如何充分合理的利用野生资源，是大豆种质创新的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与大豆百粒重相关的QTL、分子标记、扩增引物及应用，以解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:

本发明的第一个方面，提供一种与大豆百粒重相关的QTL，所述QTL位于大豆第7号染色体的1641719bp-1795446bp区间。

本发明的第二个方面，提供所述与大豆百粒重相关的QTL的SSR分子标记，所述分子标记位于大豆第7号染色体的1779529bp-1779582bp区间，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个方面，所述SSR分子标记的扩增引物，所述扩增引物如下：

SSR-09-089F：5′-TCATTTTTGACAATGCTTGAAA-3′；

SSR-09-089R：5′-TTGGAACAGACGAGCAAAAA-3′。

本发明的第四个方面，提供所述扩增引物在大豆百粒重性状鉴定中的应用。本发明的第五个方面，利用所述的扩增引物鉴定大豆百粒重性状的方法，包括以下步骤：

S1、提取绥农14、ZYD00006大豆以及待鉴定大豆材料基因组DNA；

S2、利用扩增引物对绥农14、ZYD00006大豆以及待鉴定大豆材料基因组DNA进行PCR扩增；

S3、对扩增产物进行电泳分析，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型与绥农14扩增产物的电泳带型一致，则鉴定为大豆高百粒重性状，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型与ZYD00006扩增产物的电泳带型一致，则鉴定为低百粒重性状。

本发明的第六个方面，提供所述SSR分子标记在大豆百粒重性状选育中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明得到的百粒重QTL区间LOD值为6.29，其贡献率为8.54％。因此，无论是从QTL的定位，还是QTL对表型的贡献率来看，该区间都是大豆百粒重的理想标记区间。而且在该区间鉴定了一个与大豆百粒重相关的分子标记SSR-09-089，本发明结果的重要意义在于，可用于分子标记辅助选择育种以及挖掘相关功能基因，同时可以利用野生资源，拓宽栽培大豆的遗传基础。

附图说明

图1为作图群体构建过程图。

图2为重测序流程图。

图3为母本染色体覆盖深度分布图。

图4为各染色体SNP标记与Bin标记分布密度图。

图5为2013年-2016年CSSL群体百粒重频率分布直方图。

图6为2017年-2020年CSSL群体百粒重线性无偏估计频率分布直方图。

图7为百粒重极端材料聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：与大豆百粒重相关的QTL、分子标记的获得

1、作图群体的构建

2006年以绥农14(SN14)为轮回亲本，以野生大豆ZYD00006为供体亲本，通过连续的回交与自交，构建全基因组导入系群体。具体世代见图1。

2、群体基因型检测

对群体进行重测序检测基因型(流程如图2所示)，步骤包括：

(1)利用CTAB法提取亲本及后代株系DNA。样品检测合格后，用超声破碎的方法将DNA随机打断，DNA片段经末端修复、3'端加A、加测序接头、纯化、PCR扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过Illumina HiSeqTM测序平台进行测序。

(2)将重测序获得的测序reads重新定位到参考基因组上，进行后续变异分析。利用BWA软件比对二代高通量测序得到的短序列与参考基因组。通过比对定位Clean Reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度(图3)、基因组覆盖度等信息，并进行变异的检测。

(4)对于BWA比对得到的结果，使用Picard的Mark Duplicate工具去除重复，屏蔽PCR-duplication的影响。使用GATK进行InDel Realignment，即对存在插入缺失比对结果附近的位点进行局部重新比对，校正由于插入缺失引起的比对结果错误。使用GATK进行碱基质量值再校准(Base Recalibration)，对碱基的质量值进行校正。使用GATK进行变异检测(variant calling)，主要包括SNP和InDel。对SNP进行严格过滤：SNP cluster过滤(5bp内如果有2个SNP则过滤掉)，InDel附近SNP过滤(InDel附近5bp内的SNP过滤掉)；和相邻INDEL过滤(两个InDel距离小于10bp过滤掉)。最终筛选可用的SNP标签为580524个。

(5)利用得到的580524个SNP，以17个SNP为一个窗口，1个SNP为步长在染色体上滑动扫描，当滑窗内的SNP分型为aa的SNP大于12个时分型为aa，当滑窗内的SNP分型为bb的SNP大于14个时分型为bb，其它情况的为ab进行基因型填补和校正。

(6)完成标记填补和校正后，根据子代重组情况进行Bin划分。将各样本按染色体物理位置排列整齐，当任何样本中出现分型转变就认为出现了重组断点，然后将重组断点间的SNP划为Bin中，经过bin筛选，最后以3196个Bin作为作图的标记进行定位(图4)。

3、百粒重表型数据获取

每年在大豆完熟之后，在田间每个株行随机选择5株长势均匀的单株。单株人工脱粒，利用百分之一天平进行百粒重考种，2013年-2016年CSSL群体百粒重频率分布如图5所示。

4、大豆百粒重QTL分析

利用ICIMapping4.1软件中的ICIM(完备区间作图法)法对群体百粒重进行QTL定位，选择ICIM-ADD模块进行分析，导入系群体采用CSL模板。以LOD值设为≥2.5，对大豆百粒重进行QTL分析。在9号染色体上发现百粒重QTL区间，物理位置为1629625bp-1759542bp，如表1所示。

表1大豆百粒重QTL区间

5、根据百粒重QTL区间开发与大豆百粒重相关的分子标记，试验材料为CSSL群体百粒重极端小和极端大的株系各20行。极端表型材料筛选方法：利用ICIMapping4.1软件计算CSSL群体2017年-2020年的百粒重线性无偏估计值，用无偏估计值的平均值±1×标准差作为极端表型的阈值(图6)，最后在极端表型材料里筛选四年里百粒重表型稳定的株系进行标记开发试验，开发分子标记所用极端表型材料百粒重线性无偏估计统计如表2所示。通过单因素方差分析筛选到SSR-09-089与群体百粒重变异相关，标记位于9号染色体1779529bp-1779582bp处，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，单因素方法分析结果如表3所示。

表2开发分子标记所用极端表型材料百粒重线性无偏估计统计

表3单因素方差分析结果

实施例2：与大豆百粒重相关的QTL、分子标记SSR-09-089的应用根据SSR-09-089的基因序列，设计扩增引物，所述扩增引物为：

SSR-09-089F：5′-TCATTTTTGACAATGCTTGAAA-3′，如SEQ ID NO.2所示；

SSR-09-089R：5′-TTGGAACAGACGAGCAAAAA-3′，如SEQ ID NO.3所示。

选取极端百粒重表型材料，CTAB法提取大豆叶片基因组DNA，以上述扩增引物进行扩增，PCR反应体系及程序见表4和表5，扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图7所示，将各品系电泳结果与亲本对比，带型与亲本SN14相同的记为1，与亲本ZYD00006相同的记为2，杂合的记为3，具体结果见表7。

表4 PCR反应体系

表5 PCR反应程序

表6基因分型结果

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 吉林省农业科学院

<120> 一种与大豆百粒重相关的QTL、分子标记、扩增引物及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 大豆

<400> 1

atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atatatatat atat 54

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcatttttga caatgcttga aa 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttggaacaga cgagcaaaaa 20

Claims (3)

1.与大豆百粒重相关的QTL的SSR分子标记在大豆百粒重性状鉴定中的应用，其特征在于，所述分子标记位于大豆第7号染色体的1779529bp-1779582bp区间，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.权利要求1中所述SSR分子标记的扩增引物在大豆百粒重性状鉴定中的应用，其特征在于，所述扩增引物如下：

SSR-09-089F：5′-TCATTTTTGACAATGCTTGAAA-3′；

SSR-09-089R：5′-TTGGAACAGACGAGCAAAAA-3′；

所述应用具体包括以下步骤：

S1、提取绥农14、ZYD00006大豆以及待鉴定大豆材料基因组DNA；

S2、利用扩增引物对绥农14、ZYD00006大豆以及待鉴定大豆材料基因组DNA进行PCR扩增；

S3、对扩增产物进行电泳分析，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型与绥农14扩增产物的电泳带型一致，则鉴定为大豆高百粒重性状，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型与ZYD00006扩增产物的电泳带型一致，则鉴定为低百粒重性状。

3.权利要求1中所述SSR分子标记在大豆百粒重性状选育中的应用。

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