CN113122651B

CN113122651B - 与莲根状茎膨大性状主效qtl位点连锁的snp分子标记及应用

Info

Publication number: CN113122651B
Application number: CN202110529880.1A
Authority: CN
Inventors: 王芸; 徐翠容; 李兴需; 朱晋; 刘玉平; 李静; 王直新; 匡晶; 刘正位; 季群; 王春丽
Original assignee: Wuhan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Wuhan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-05-14
Also published as: CN113122651A

Abstract

本发明公开了一种与莲根状茎膨大性状主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用，所述主效QTL位点位于1号连锁群；其区间范围为10.430cM～11.043cM；所述主效QTL位点连锁的SNP分子标记为3个，分别为SNP1～SNP3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3；其中，各标记序列中第251位碱基均为多态性位点，所述分子标记SNP1～SNP3的多态性位点分别为T/C、C/T、T/G。本发明首次定位了控制莲根状茎膨大性状的主效QTL位点，并开发出与其连锁的SNP分子标记。通过开发的SNP分子标记即可在莲幼苗期进行检测，筛选目标根状茎膨大性状的植株，有效缩短育种周期，大大提高选择效率。

Description

与莲根状茎膨大性状主效QTL位点连锁的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明涉及属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与莲根状茎膨大性状主效QTL紧密连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)是睡莲科(Nymphaeaceae)莲属(Nelumbo Adans)多年生水生蔬菜类植物，也是一种兼具经济价值、生态观光和文化价值的作物，主要通过根状茎进行无性繁殖。莲根状茎由莲顶芽和侧芽抽生而成，生长前期根状茎呈莲鞭状，后期根状茎膨大结藕，即为莲的食用部分。莲经过长期的人工驯化可分为藕莲、子莲、花莲三种栽培类型。藕莲以食用根状茎为用，根状茎在生长后期膨大结藕。花莲以观赏荷花为主，在整个生长期根状茎不膨大，呈长条状，即为莲鞭。莲是我国栽培面积最大的水生蔬菜，主要产区集中在湖北、江苏、江西、安徽、河南、山东等省。湖北省是我国藕莲种植面积最大的省份，经济效益显著。根状茎膨大性状是藕莲的重要农艺性状，与藕莲产量和商品性紧密相关。因此研究根状茎膨大机理对藕莲的品种选育有长远指导意义。

近年来，随着基因组测序技术的兴起，分子标记辅助遗传育种发展迅速。相比常规育种过程，利用分子标记辅助遗传育种可以减少育种盲目性、缩短育种周期、提高选择效率。目前，主要用于辅助育种的分子标记有简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)标记、插入/缺失多态性(Insertion/Deletion，InDel)标记和单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)标记，相比SSR和InDel标记，SNP标记具有操作简单、高效批量、可重复性高等优点。

现阶段鲜有利用分子标记技术研究莲根状茎膨大机理的报道，莲育种仍主要通过常规杂交育种，收获杂交后代莲子进行单粒播种，待结藕后挖取莲根状茎进行性状评价，育种工作量大、育种周期长、效率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种与莲根状茎膨大性状主效QTL位点连锁的SNP分子标记及其在莲遗传育种中的应用，本发明利用根状茎膨大表型有明显差异的2个亲本构建F2群体，利用全基因组重测序构建高密度遗传图谱，检测到1个根状茎膨大主效QTL位点，并利用重测序数据开发出3个SNP标记在F2群体中进行了验证；3个SNP分子标记依次命名为SNP1、SNP2、SNP3，所述标记SNP1-SNP3的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1-3所示，各标记第251位碱基为多态性位点；其中SNP1等位变异碱基为T/C，SNP2等位变异碱基为C/T，SNP3等位变异碱基为T/G。

为实现上述目的，本发明所设计一种与莲根状茎膨大性状主效QTL位点连锁的SNP分子标记，所述主效QTL位点位于1号连锁群；其区间范围为10.430cM～11.043cM；所述主效QTL位点连锁的SNP分子标记为3个，分别为SNP1～SNP3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～3；其中，各标记序列中第251位碱基均为多态性位点，所述分子标记SNP1～SNP3的多态性位点分别为T/C、C/T、T/G。

本发明还提供了一种用于检测权利要求1所述SNP分子标记的KASP引物组，所述引物组如下：

本发明还提供了一种含有上述引物的检测试剂/试剂盒。

本发明还提供了一种上述SNP分子标记、上述KASP引物或上述引物的检测试剂/试剂盒在莲根状茎膨大主效QTL基因分型中的应用。

本发明还提供了一种上述SNP分子标记、上述KASP引物或上述引物的检测试剂/试剂盒鉴定或筛选根状茎膨大的莲材料中的应用。

本发明还提供了一种上述SNP分子标记、上述KASP引物或上述引物的检测试剂/试剂盒在莲分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种鉴定根状茎膨大表型性状的莲种质资源的方法，包括以下步骤：

1)提取待检测莲的基因组DNA作为模板；

2)以上述步骤1)的基因组DNA作为模板，使用权利要求2所述KASP引物组任意一种引物组进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物。

基于上述荧光检测仪分析PCR扩增产物，判断依据如下：

若KASP引物组RE-1扩增得到PCR产物(分子标记SNP1)变异位点的碱基为C时，根状茎表现为不膨大，PCR产物(分子标记SNP1)变异位点的碱基为T，则表现为膨大；

或者，若KASP引物组RE-2扩增得到PCR产物(分子标记SNP2)变异位点的碱基为T，根状茎表现为不膨大，PCR产物(分子标记SNP2)变异位点的碱基为C，则表现为膨大；

或者，若KASP引物组RE-3扩增得到PCR产物(分子标记SNP3)变异位点的碱基为G，根状茎表现为不膨大，PCR产物(分子标记SNP3)变异位点的碱基均为T，则表现为膨大。

本发明的有益效果：

1.本发明首次定位了控制莲根状茎膨大性状的主效QTL位点，并开发出与其连锁的SNP分子标记。通过开发的SNP分子标记即可在莲幼苗期进行检测，筛选目标根状茎膨大性状的植株，有效缩短育种周期，大大提高选择效率。

2.本发明中根状茎膨大主效QTL位点位置明确，检测方便快速，不受环境影响。通过检测与根状茎膨大性状相关的分子标记，即可以预测不同莲植株根状茎的膨大与否，进而可以快速筛选根状茎膨大株系用于莲的品种选育，辅助育种选择目标明确，节约育种成本。

附图说明

图1为莲根状茎表型性状(左为膨大根状茎，右为不膨大根状茎)；

图2为莲高密度遗传图谱；

图3为莲根状茎膨大性状QTL定位图；

图4为KASP引物组RE-1在“泰国粉红重瓣”×“鄂莲5号”F2代群体中的检测结果。

图5为KASP引物组RE-2和RE-3在“杏黄×鄂莲9号”杂交后代中的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

本发明涉及缩略语说明

QTL	数量性状基因座
		SNP	单核苷酸多态性
SSR	简单重复序列
		InDel	插入/缺失多态性
KASP	竞争性等位基因特异性PCR
		CTAB	十六烷基三甲基溴化铵
FAM	羧基荧光素
		HEX	六氯荧光素

实施例1

莲根状茎膨大主效QTL位点及其SNP的发掘方法，包括如下步骤：

1)构建莲F2遗传群体“泰国粉红重瓣”×“鄂莲5号”

以根状茎不膨大花莲品种“泰国粉红重瓣”为母本，根状茎膨大藕莲品种“鄂莲5号”为父本进行杂交，杂交F1代通过自交构建莲F2遗传群体，群体大小163株；莲根状茎膨大与不膨大性状见图1所示；

2)提取亲本、F1及F2分离群体叶片DNA

分别取2个亲本、F1代和F2子代植株幼叶，采用CTAB法提取基因组DNA，CTAB提取DNA法参考全志武、汪静等人的方法(10个莲藕品种SSR指纹图谱的构建与品种鉴别，中国蔬菜，2008(3):15-17)。利用1％琼脂糖凝胶电泳、Nanodrop和Qubit检测DNA纯度、浓度及完整性。将DNA样品送至百迈克生物科技有限公司进行全基因组重测序。具体测序技术及流程参考百迈克生物科技网站http://www.biomarker.com.cn/；

3)田间鉴定F2遗传群体根状茎膨大表型性状

连续2年对父母本、F1代及F2子代的根状茎膨大性状进行田间鉴定和统计；

4)构建莲高密度遗传图谱

利用北京百迈克生物科技有限公司的全基因组测序平台对上述莲两个亲本及F2分离群体的DNA样品进行全基因组重测序，在亲本中筛选到多态性SNP位点后，获得多态性SNP位点在F2群体中的分布，对群体进行分型。根据连锁交换规律，以连锁群为单位，利用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到莲高密度遗传图谱(图2)，该图谱由8个连锁群构成，总图距为1,263.92cM，平均图距0.17cM，最短连锁群116.83cM，最长连锁群183.99cM；

5)定位莲根状茎膨大主效QTL位点

根据亲本及F2群体163个子代个体的根状茎膨大表型数据，利用QTL-IciMapping4.1软件和CIM复合区间作图法对F2群体根状茎表型数据及遗传图谱信息进行分析计算，检测到1个与莲根状茎膨大性状相关的主效QTL，位于第1连锁群，区间从10.430cM到11.043cM，区间大小为0.613cM(图3)；检测到与QTL紧密连锁的3个SNP分子标记SNP1、SNP2和SNP3，所述标记SNP1-SNP3的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:1-3所示，各标记第251位碱基为多态性位点；其中SNP1等位变异碱基为T/C，SNP2等位变异碱基为C/T，SNP3等位变异碱基为T/G。

实施例2

利用上述KASP引物组对相应的SNP位点进行检测，验证KASP引物组的应用效果。选取实施例1中莲F2群体92份株系的新鲜叶片材料；采用CTAB法提取叶片基因组DNA，根据上述3个SNP标记序列，设计KASP引物组合成进行PCR扩增，引物序列具体如下：

PCR扩增反应体系如下：

PCR反应程序如下：

94℃、15min；然后10个循环94℃、20sec，61℃、1min(在此步骤每个循环退火温度降低0.6℃，直至退火温度为55℃)；然后26个循环94℃、20sec，55℃、1min。

利用KASP引物组RE-1～RE-3任意一种对实施例1中莲F2群体的92份株系进行检测，反应结束后利用荧光检测仪对PCR扩增产物进行荧光扫描。经验证，KASP引物组合RE-1～RE-3均能对相应SNP位点的基因型分型效果理想(图4)。

实施例3

在莲杂交育种过程中利用SNP标记进行辅助选择。选取田间莲杂交后代材料92份，杂交亲本为“杏黄×鄂莲9号”，利用KA SP引物RE-2和RE-3对杂交单株进行检测。在田间取每份单株新鲜幼叶，采用CTAB法提取叶片DNA，PCR反应体系同实施例2。反应结束后对PCR产物进行荧光检测，通过SNPdecoder工具(ht tp://www.snpway.com/snpdecoder01/)进行基因分型，获得基因分型结果(图5)。

如图4～5所示，聚合在X轴的样本与父本聚在一起，显示FAM荧光信号，表现为根状茎膨大；聚合在Y轴的样本与母本聚在一起，显示HEX荧光信号，表现为根状茎不膨大；在X轴和Y轴中间的样本则为杂合基因型(基于上述判断依据)。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 武汉市农科院

<120> 与莲根状茎膨大性状主效QTL位点连锁的SNP分子标记及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 500

<212> DNA

<213> 莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)

<400> 1

tcgttgatct tcatctttat gacaagtgcg tcgtcgtggg gggagtggac cccgcgtgca 60

tcgtcttcgg tgaagaacat ggggtcttcc atcctaggcc gctttgggag atttcgttct 120

tctctggtgg cctcccgggt tgatgcccga gctgccgtcg aggtgcatcc tgctacgatt 180

gatcctccaa cgatcacgtg gattgttcct cgaactggtc tttcctctgg gggttgcttc 240

tgtggttcgg ycggtcggct gctagactcg ggatcatctc tgctgtgctc tctcttccga 300

cctgtcttat tactattatt attgttatgc tgtacaaaat ttcgtaggta cccgcgacgg 360

ataagctcct ctatctcgtc gcggagatta ttacaatgct cggtgctatg actgtgatcc 420

ctatggaagc tgcagtacaa gtttttattc ctctcattcg ggtttccctt caaacgaggt 480

ggccacttca catacgaggc 500

<210> 2

<211> 500

<212> DNA

<213> 莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)

<400> 2

tctccatata tgcacttggt agcaggttgc caatgtgtgt atatgttgaa aatatataat 60

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aaccatttta taagtattta 500

<210> 3

<211> 500

<212> DNA

<213> 莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)

<400> 3

aacaatttct aatattgttt aactcaaaat attctattaa acccagctaa taattataat 60

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tatattcaga cattattgat cacctaatac ttgttcacat catcatatat ttaaatgggc 180

aaaccaaaat aataaagctt ggaggacaat taaccctgca tctatgcaaa ccaatatctg 240

tttctttatt kcatgttcag ttgcatatag ggcaaagtta atagttgata atcactctca 300

cccataaata aatagttctt aatttagatt atttacctac tgccatggtt tgaatccaat 360

gatgcaacca tttttttttc tgggattgct tgggcttctc aattctccaa atttaggcct 420

tgagtatgaa ttgatgatta ataatgatat aaatatagaa aggttttcta tgattaatag 480

gacatatata ttgtatgata 500

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tggttgcttc tgtggttcgg t 41

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tggttgcttc tgtggttcgg c 41

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aataagacag gtcggaagag agag 24

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaaggtgacc aagttcatgc ttccatgaac caaatgcacc cc 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat ttccatgaac caaatgcacc ct 42

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagagatttt ctcctcacag agct 24

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaggtgacc aagttcatgc ttgcaaacca atatctgttt ctttattt 48

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaggtcgga gtcaacggat ttgcaaacca atatctgttt ctttattg 48

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgccctata tgcaactgaa catg 24

Claims

1.一种与莲根状茎膨大性状主效QTL位点连锁的SNP分子标记，其特征在于：所述主效QTL位点位于1号连锁群；其区间范围为10.430cM-11.043cM；所述主效QTL位点连锁的SNP分子标记为3个，分别为SNP1~SNP3，其核苷酸序列如SEQ ID NO ：1~3；其中，各标记序列中第251位碱基均为多态性位点，所述分子标记SNP1~SNP3的多态性位点分别为T/C、C/T、T/G。

2.用于检测权利要求1所述SNP分子标记的KASP引物组，其特征在于：所述引物组如下：

KASP引物组正向引物1 正向引物2 反向引物 RE-1 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTTGCTTCTGTGGTTCGGT GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTTGCTTCTGTGGTTCGGC AATAAGACAGGTCGGAAGAGAGAG RE-2 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCCATGAACCAAATGCACCCC GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCCATGAACCAAATGCACCCT CAGAGATTTTCTCCTCACAGAGCT RE-3 GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCAAACCAATATCTGTTTCTTTATTT GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGCAAACCAATATCTGTTTCTTTATTG TTGCCCTATATGCAACTGAACATG

。

3.含有权利要求2所述KASP引物组的检测试剂或试剂盒。

4.权利要求3所述检测试剂或试剂盒在莲根状茎膨大主效QTL基因分型中的应用。

5.权利要求3所述检测试剂或试剂盒鉴定或筛选根状茎膨大的莲材料中的应用。

6.权利要求3所述检测试剂或试剂盒在莲分子标记辅助育种中的应用。

7.鉴定根状茎膨大表型性状的莲种质资源的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）提取待检测莲的基因组DNA作为模板；

2）以上述步骤1）的基因组DNA作为模板，使用权利要求2所述KASP引物组进行PCR扩增。