CN112575102A - 控制莲心皮数的主效qtl、snp分子标记、kasp检测引物组及应用 - Google Patents

控制莲心皮数的主效qtl、snp分子标记、kasp检测引物组及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了控制莲心皮数的主效QTL、SNP分子标记、KASP检测引物组及应用。本发明利用SLAF‑seq开发大量SNP多态性标记获得了控制莲心皮数性状的主效QTL位点，进而在定位区段内设计引物开发了一批特异性强、准确率高的共显性荧光分子标记。本发明所提供的控制莲心皮数的主效QTL位点，其与SNP分子标记紧密连锁，对莲的心皮数的贡献率较高，可用于图位克隆挖掘控制心皮数多少的功能基因和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。本发明提供的莲心皮数的主效QTL位点的SNP分子标记，可以高效选择莲子产量较好的品种，加速莲的育种的进程。

Description

控制莲心皮数的主效QTL、SNP分子标记、KASP检测引物组及 应用
技术领域
本发明涉及控制莲性状的QTL、分子标记以及检测引物，尤其涉及控制莲心皮数的主效QTL、SNP分子标记、KASP检测引物组及其在鉴定莲心皮数量性状或者用于莲分子标记辅助育种中的应用，属于控制莲心皮数的主效QTL、SNP分子标记及其应用领域。
背景技术
莲(Nelumbo nucifera)作为莲科莲属的园林水生植物，主要有三种栽培类型：子莲、藕莲和花莲。子莲主要食用莲子，藕莲主要采收地下茎，而花莲供观赏。中国子莲主要分布于江西、福建、湖南、湖北、浙江等地。近年来，莲子需求量呈逐年上升趋势，目前发展子莲产业具有显著经济效益、社会效益和生态效益。目前，子莲育种仍以传统方法为主，工作量大、周期长、效率不高，未见与子莲心皮数性状紧密连锁的分子标记被开发并利用于育种工作中。
随着分子生物学的深入发展，植物全基因组测序的陆续完成，分子标记的开发和生物信息学取得突破，大大缩短了育种年限，为揭示相关性状的遗传机理和分子机制奠定基础。简化基因组测序(Specific Length Amplified Fragment Sequencing，SLAF-seq)技术是以生物信息学为基础的高度自动化高通量测序技术，可重复性高，测序时间短，信息量大，可利用多态性SNP标记多，在遗传图谱构建和分子标记开发中已有广泛运用。与SSR、ALFP等相比，基于SNP的分子标记技术具有快速、高效、自动化批量检测等优越性，更易于进行基因分型。
利用常规杂交育种技术，选择具有相对性状的品种作为亲本，杂交后获得F1，结莲蓬后筛选心皮数多的品种，品种以无性繁殖方式固定种姓。此外，心皮数量需要在结莲蓬后之后进行田间统计确定，存在周期长，流程重复繁琐，占用大量栽培空间，效率低，人工成本高等问题。
如果获得制莲心皮数性状的主效QTL位点，进而在定位区段内设计引物开发特异性强、准确率高的共显性荧光分子标记，不仅有效克服现有的确定心皮数量存在的问题，还可为子莲心皮数分子标记辅助育种提供可行性方法。
发明内容
本发明的目的之一是提供控制莲心皮数性状的主效QTL位点；
本发明的目的之二是与控制莲心皮数性状的主效QTL紧密连锁的SNP分子标记；
本发明的目的之三是提供所述的SNP分子标记的KASP检测引物组；
本发明的目的之四将所述的SNP分子标记或KASP检测引物对应用于鉴定莲的心皮数量性状或者用于莲分子标记辅助育种。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了控制莲心皮数的性状的主效QTL位点，其定位于第7连锁群上、Marker130895和Marker104686之间；其区间从10.000cM到10.572cM。
本发明还提供了与控制莲心皮数的性状的主效QTL紧密连锁的四个SNP分子标记；其中，第一SNP分子标记命名为Marker130767，等位变异碱基为T/C，SNP位点的等位基因均为C，则极有可能表现为心皮数较多；SNP位点的等位基因均为T，则大概率表现为心皮较少；第二SNP分子标记，位于第七连锁群，命名为Marker130770，等位变异碱基为G/A，SNP位点的等位基因均为A，则极有可能表现为心皮数较多；SNP位点的等位基因均为G，则大概率表现为心皮较少；第三SNP分子标记，位于第七连锁群，命名为Marker130771，等位变异碱基为C/T SNP位点的等位基因均为T，则极有可能表现为心皮较少；SNP位点的等位基因均为C，则大概率表现为心皮较少；第四SNP分子标记，位于第七连锁群，命名为Marker130876，等位变异碱基为G/C，SNP位点的等位基因均为C，则极有可能表现为心皮较少；SNP位点的等位基因均为G，则大概率表现为心皮较少。
本发明进一步提供了检测所述的SNP标记的KASP引物组，包括正向引物1、正向引物2和反向引物，核苷酸序列为5’-3’；其中，用于检测第一SNP分子标记的KASP引物组由SEQID No.1所示的正向引物1、SEQ ID No.2所示的正向引物2和SEQ ID No.3所示的反向引物组成；用于检测第二SNP分子标记的KASP引物组由SEQ ID No.4所示的正向引物1、SEQ IDNo.5所示的正向引物2和SEQ ID No.6所示的反向引物组成；用于检测第三SNP分子标记的KASP引物组由SEQ ID No.7所示的正向引物1、SEQ ID No.8所示的正向引物2和SEQ IDNo.9所示的反向引物组成；用于检测第四SNP分子标记的KASP引物组由SEQ ID No.10所示的正向引物1、SEQ ID No.11所示的正向引物2和SEQ ID No.12所示的反向引物组成。
在进行检测时，两条正向引物的5’端分别连接有荧光标签序列，其中，正向引物1的5’端连接为FAM序列(5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，SEQ ID No.13)，正向引物2的5'端连接为HEX序列(5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，SEQ ID No.14)。
本发明进一步提供了一种鉴定莲心皮数量的PCR检测试剂盒，包括：KASP检测引物组，KASP master mix以及ddH2O。
本发明更进一步提供了一种应用所述KASP检测引物组鉴定莲的心皮数性状中的应用，包括：
(1)提取待检测莲的基因组DNA并进行稀释；
(2)加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP master mix进行PCR扩增；
(3)将PCR产物在荧光定量PCR仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息进行基因分型，获得基因型结果；
(4)根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得HEX荧光信号，则表现为心皮数较多；如果扫描获得FAM荧光信号，则表现为心皮数较少；如果扫描结果为同时有HEX和FAM信号，该位点为杂合基因型。
其中，步骤(1)中所述的稀释是将待检测莲的基因组DNA稀释至18-22ng/μL。
其中，步骤(2)中所述KASP Primer mix包含所述KASP引物组；所述正向引物1的5’端添加有FAM荧光标签序列5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，正向引物2的5’端添加有HEX荧光标签序列5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’；所述PCR的反应程序为：94℃,15min；94℃,20sec，61-55℃,60sec，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃,20sec，55℃,60sec，26个循环。
本发明利用SLAF-seq开发大量SNP多态性标记获得了控制莲心皮数性状的主效QTL位点，进而在定位区段内设计引物开发了一批特异性强、准确率高的共显性荧光分子标记。本发明所提供的控制莲心皮数的主效QTL位点，其与SNP分子标记紧密连锁，对莲的心皮数的贡献率较高，可用于图位克隆挖掘控制心皮数多少的功能基因和分子标记辅助选择，适于大规模推广应用。本发明提供的莲心皮数的主效QTL位点的SNP分子标记，可以高效选择莲子产量较好的品种，加速莲的育种的进程。
本发明整体技术方案的详述
一.利用SLAF-seq方法确定控制莲的心皮数的主效QTL候选区域及连锁标记的开发
本发明以藕莲“巨无霸”为父本，子莲“满天星”为母本，构建了F2遗传群体。其中父本表现为心皮数较少，母本为心皮数较多。对父母本、F1及每个F2单株的心皮数进行田间鉴定并统计。对F2遗传分离群体中2个亲本和175个子代的每份样品播种一粒莲子，萌发后取幼叶，采用CTAB法提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测DNA质量与浓度；将DNA样品用于SLAF-seq测序。构建SLAF文库。
以连锁群为单位，采用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到莲高密度遗传连锁图谱，共构建了8个连锁群，6376个标记紧密连锁，总图距为1,046.82cM，平均标记间图距0.16cM，最短连锁群58.13cM，最长186.26cM。
利用QTL-IciMapping4.1软件，采用加性-完备复合区间作图法(ICIM-ADD)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算，在8条连锁群进行QTL检测，设定的LOD值为2.5或2.0。最终将心皮数量的性状的QTL定位在第3连锁群和第7连锁群分别定位在SNP标记Marker177588和Marker124455之间，区间从102.924cM到104.982cM；Marker130895和Marker104686之间，区间从10.000cM到10.572cM。
基于上述定位区间的标记序列，根据SNP的突变特点，设计竞争性等位基因特异性PCR引物对，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基均为G/A。
二.利用分子标记检测F2群体以及两个亲本
对F2群体中随机选出的96株子代取其幼叶，通过CTAB提取法获得莲植株的基因组DNA。制备KASP Primer mix并进行PCR扩增。利用QuantStudio6Flex机器对PCR扩增产物进行扫描，基于两荧光(FAM荧光和HEX荧光)的激发波长和发射波长不同，从而实现对扩增产物的分型。根据扩增结果可见，其中聚合在X轴的样本为心皮数较少基因型；聚合在Y轴的样本为心皮数较多基因型；在中间的样本为杂合基因型。
本发明涉及缩略语和关键术语定义
QTL：数量性状基因座。
SNP：单核苷酸多态性。
SSR：简单重复序列。
ALFP：扩增片段长度多态性。
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵。
KASP:竞争性等位基因特异性PCR。
附图说明
图1莲高密度遗传连锁图谱。
图2控制莲心皮数量的性状的QTL定位的连锁图谱。
图3本发明提供的控制莲莲心皮数性状的分子标记检测F2群体以及两个亲本的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1利用SLAF-seq方法确定控制莲的心皮数的主效QTL候选区域及连锁标记的开发
1.构建莲的心皮数性状分离群体
在本实施例中，以藕莲“巨无霸”为父本，子莲“满天星”为母本，构建了F2遗传群体。其中父本表现为心皮数较少，母本为心皮数较多。
2.莲的心皮数表型田间鉴定
对父母本、F1及每个F2单株的心皮数进行田间鉴定并统计。
3.基因组DNA的提取以及SLAF文库的构建
对F2遗传分离群体中2个亲本和175个子代的每份样品播种一粒莲子，萌发后取幼叶，采用CTAB法提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测DNA质量与浓度；将DNA样品用于SLAF-seq测序。
SLAF文库的构建流程如下：
(1)首先对莲参考基因组进行电子酶切，筛选双酶切方案，最终选用的酶为RsaI+HaeIII酶；
(2)利用酶切方案对样本DNA酶切、建库；采用Illumina平台Hiseq2500进行双端测序，测序长度为PE150；
(3)初过滤后，利用SLAF技术进行SLAF标记开发。采用GATK和samtools挖掘和筛选高质量的纯合SNP位点(具体流程参考GATK官方网站)。
4.莲高密度遗传连锁图谱的构建
以连锁群为单位，采用HighMap软件分析获得连锁群内Marker的线性排列，并估算相邻Marker间的遗传距离，最终得到莲高密度遗传连锁图谱(图1)，共构建了8个连锁群，6376个标记紧密连锁，总图距为1,046.82cM，平均标记间图距0.16cM，最短连锁群58.13cM，最长186.26cM。
5.莲心皮数的QTL定位
利用QTL-IciMapping4.1软件，采用加性-完备复合区间作图法(ICIM-ADD)对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算，在8条连锁群进行QTL检测，设定的LOD值为2.5或2.0。最终将心皮数量的性状的QTL定位在第7连锁群(图2)，定位在SNP标记Marker130895和Marker104686之间，区间从10.000cM到10.572cM。
6.心皮数QTL区间标记的开发
基于上述定位区间的标记序列，根据SNP的突变特点，设计竞争性等位基因特异性PCR引物对，包括正向引物1、正向引物2和反向引物。两条正向引物末端为等位变异碱基均为G/A。正向引物的5’端连接有荧光标签序列，其中，正向引物1的5’端连接为FAM序列5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'，正向引物2的5'端连接为HEX序列5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
引物序列如下：
767CNF_T:
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGGCCACTAGCATCCTGT(SEQ ID No.1)
767CNF_C:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGGCCACTAGCATCCTGC(SEQ ID No.2)
767CNR:CACAGGTGAACGTAGAACAACTTC(SEQ ID No.3)
770CNF_G:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCACAGTGGCTCCCTTCCTATG(SEQ ID No.4)
770CNF_A:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACAGTGGCTCCCTTCCTATA(SEQ ID No.5)
770CNR：TGAATGAGCTTGCCAACTTGTTAG(SEQ ID No.6)
771CNF_C:
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTCCTATGCCAGCTCAGCCTTC(SEQ ID No.7)
771CNF_T:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCCTATGCCAGCTCAGCCTTT(SEQ ID No.8)
771CNR：TGAATGAGCTTGCCAACTTGTTAG(SEQ ID No.9)
876CNF_G:
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAAAGTACAAGGGGCCAAGTGTG(SEQ ID No.10)
876CNF_C:
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAAAGTACAAGGGGCCAAGTGTC(SEQ ID No.11)
876CNR：CTTTGGAGGTGTGACGCTATTTTT(SEQ ID No.12)。
实施例2利用分子标记检测F2群体以及两个亲本
1.提取莲基因组DNA
对F2群体中随机选出的96株子代取其幼叶，通过CTAB提取法获得莲植株的基因组DNA。
2.KASP Primer mix的制备
表1 KASP Primer mix的成分
Figure BDA0002831083560000111
3.PCR扩增
3.1PCR反应体系为：
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002831083560000121
3.2PCR反应程序为：
94℃,15min；94℃,20sec，61-55℃,60sec，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃,20sec，55℃,60sec，26个循环。
4.基因分型
利用QuantStudio6Flex机器对PCR扩增产物进行扫描，基于两荧光(FAM荧光和HEX荧光)的激发波长和发射波长不同，从而实现对扩增产物的分型。
5.结果分析
扩增如图3所示，其中聚合在X轴的样本为心皮数较少基因型；聚合在Y轴的样本为心皮数较多基因型；在中间的样本为杂合基因型。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉市农业科学院
<120> 控制莲心皮数的主效QTL、SNP分子标记、KASP检测引物组及应用
<130> WH-2001-200908A
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
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<213> Artifical sequence
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc tgaggccact agcatcctgt 40
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gaaggtcgga gtcaacggat tgaggccact agcatcctgc 40
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<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat t 21

Claims (10)

1.控制莲心皮数性状的主效QTL位点，其特征在于，所述主效QTL定位于第7连锁群上、Marker130895和Marker104686之间。
2.按照权利要求1所述的主效QTL位点，其特征在于，其区间从10.000cM到10.572cM。
3.与权利要求1所述的主效QTL位点紧密连锁的SNP分子标记。
4.按照权利要求3所述的SNP分子标记，其特征在于，所述的SNP分子标记包括四个SNP分子标记，其中第一SNP分子标记命名为命名为Marker130767，等位变异碱基为T/C；第二SNP分子标记位于第七连锁群，命名为Marker130770，等位变异碱基为G/A；第三SNP分子标记位于第七连锁群，命名为Marker130771，等位变异碱基为C/T；第四SNP分子标记位于第七连锁群，命名为Marker130876，等位变异碱基为G/C。
5.检测权利要求4所述的SNP标记的KASP引物组，其特征在于，包括正向引物1、正向引物2和反向引物，核苷酸序列为5’-3’；其中，用于检测第一SNP分子标记的KASP引物组由SEQID No.1所示的正向引物1、SEQ ID No.2所示的正向引物2和SEQ ID No.3所示的反向引物组成；用于检测第二SNP分子标记的KASP引物组由SEQ ID No.4所示的正向引物1、SEQ IDNo.5所示的正向引物2和SEQ ID No.6所示的反向引物组成；用于检测第三SNP分子标记的KASP引物组由SEQ ID No.7所示的正向引物1、SEQ ID No.8所示的正向引物2和SEQ IDNo.9所示的反向引物组成；用于检测第四SNP分子标记的KASP引物组由SEQ ID No.10所示的正向引物1、SEQ ID No.11所示的正向引物2和SEQ ID No.12所示的反向引物组成。
6.按照权利要求5所述的KASP引物组，其特征在于，正向引物1的5’端连接核苷酸序列为SEQ ID No.13所示的FAM序列，正向引物2的5'端连接核苷酸序列为SEQ ID No.14所示的HEX序列。
7.鉴定莲的心皮数量性状的PCR检测试剂盒，包括：KASP检测引物组，KASP master mix以及ddH2O，其特征在于，所述的KASP检测引物组是权利要求5或权利要求6所述的KASP检测引物组。
8.权利要求1或2所述的主效QTL位点、权利要求3或4所述的SNP分子标记、权利要求5或6所述的KASP引物组在检测或鉴定莲的心皮数量性状或用于莲分子标记辅助育种中的应用。
9.一种鉴定莲心皮数性状的方法，其特征在于，包括：
(1)提取待检测莲的基因组DNA并进行稀释；
(2)加入权利要求5或6所述的KASP引物组和通用的KASP master mix进行PCR扩增；
(3)将PCR扩增产物在荧光定量PCR仪中进行检测，读取荧光强度信号值，然后将荧光信号值结合标记信息进行基因分型获得基因型结果；
(4)根据荧光信号值进行分析，如果扫描获得HEX荧光信号，则表现为心皮数较多；如果扫描获得FAM荧光信号，则表现为心皮数较少；如果扫描结果为同时有HEX和FAM信号，该位点为杂合基因型。
10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的稀释是将待检测莲的基因组DNA稀释至18-22ng/μL；步骤(2)中将KASP引物组的正向引物1的5’端添加有FAM荧光标签序列，正向引物2的5’端添加有HEX荧光标签序列；
步骤(2)所述PCR扩增的反应程序为：94℃,15min；94℃,20sec，61-55℃,60sec，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃,20sec，55℃,60sec，26个循环。
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