KR102224472B1 - 배의 과형 예측용 분자 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 배의 과형 예측용 분자 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 마커를 이용하면 배 육종 시 원하는 과형을 가진 배의 과실 특성을 유묘기에 조기 선발함으로써 육종 포장 유지를 위한 인력 감소 및 부대 비용 감소 효과가 있으며, 배 품종의 분자육종연구 및 배 육종 관련 산업분야에 매우 유용하게 사용될 것이다.

Description

배의 과형 예측용 분자 마커 및 이의 용도{Molecular marker for predicting fruit shape of pear and use thereof}
본 발명은 배의 과형 예측용 분자 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
배(pear)는 둥글고 평평한 것에서부터 길쭉한 양배꼴(pyriform)에 이르기까지 다양한 과형(과일 모양)을 가지고 있으며, 배의 과형은 과실특성 중 소비자의 선호도를 얻기 위한 주요 품질 지수로 여겨진다.
최근 Applied BiosystemsTM AxiomTM Pear 70K Genotyping Array가 배에서 이용가능한 서양배 레퍼런스 게놈을 토대로 제작되었다. 미국 USDA(United States Department of Agriculture)의 국립유전자원보존소(National Clonal Germplasm Repository)에서 보유중인 1,416개의 배 유전자원을 활용하여 개발된 약 70,000개로 구성된 SNP(Single Nucleotide polymorphism) 분석은 93% 가량의 높은 다형성을 보인 것으로 알려져있으며, SNP에 대한 염기서열 정보는 공개되어 배 유전분석을 위해 이용 가능하다.
배의 육종은 대부분 과수의 특징과 같이 파종 후 착과까지 오랜 기간이 걸리는 유년성과 자가수분이 불가능한 자가불화합성의 특성으로 인해서 육종 주기가 길다는 단점이 있다. 따라서, 육종 효율 제고를 위해서 분자표지 선발을 위한 유용형질 연관표지의 필요성이 증대되고 있다.
HRM(high-resolution melting) 분석은 PCR 증폭 산물 내에서 SNP 탐색을 위한 방법으로 이용된다. 이중 가닥이지만 단일 가닥 DNA에는 결합하지 않는 LCGreen 염료와 같은 포화 삽입 형광물질이 존재할 때 PCR이 완료되면 형광 수준을 측정하면서 PCR 산물을 가열한다. 이때, 관심개체간 SNP 염기 조성의 차이에 의한 녹는점의 온도차이가 발생하는 것을 감지함으로써 염기서열을 결정 및 비교할 수 있는 방법이다.
한편, 한국등록특허 제1699149호에는 '수박의 과형 구별용 DNA 마커'에 대해 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1778877호에는 '황금배와 미니배의 품종 구별을 위한 분자마커'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '배의 과형 예측용 분자 마커 및 이의 용도'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 '황금배'×'압리' 종간교배 F1 집단을 이용한 과형 조절 유전자에 밀접히 연관된 SNP(single nucleotide polymorphism)를 탐색한 후, 분석된 SNP를 탐지할 수 있는 HRM(high resolution melting) 프라이머 세트를 제작하였고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용함으로써 '황금배'×'압리'의 종간교배 F1 집단에서 배의 과형을 조기에 효과적으로 예측할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배의 과형을 예측하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 배의 과형을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 배 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 표적 서열을 분석하고 배의 과형을 예측하는 단계;를 포함하는, 배의 과형을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 배의 과형 예측용 분자 마커를 이용하면 배 육종 시 원하는 과형을 가진 배의 과실 특성을 유묘기에 조기 선발함으로써 육종 포장 유지를 위한 인력 감소 및 부대 비용 감소 효과가 있으며, 배 품종의 분자육종연구 및 배 육종 관련 산업분야에 매우 유용하게 사용될 것이다.
도 1은 황금배(A)와 압리(B)의 과실 모양을 나타낸 사진이다.
도 2는 황금배, 압리 및 '황금배'×'압리' 종간교배 F1 개체의 과실에 대해 과형 지수(fruit shape index, L/D)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 황금배 및 압리간의 종간교배 F1 개체군의 100개체를 통해 구축된 유전자지도에서 과형에 대한 높은 연관성을 보이는 SNP 영역이 위치한 연관그룹 6번을 나타낸다. 좌측의 숫자들은 각 유전체의 상단으로부터의 cM 거리를 나타내며, 빨간색 막대는 과형에 대한 높은 연관성을 보이는 SNP 영역을 나타낸다. 초록색 문자는 배의 유전체에 존재하는 2-6bp의 단순염기서열반복(simple sequence repeat)의 모티프(motif)를 포함하도록 고안된 염기서열로 구성된 분자마커를 의미한다.
도 4는 황금배 및 압리간의 종간교배 F1 개체군의 100개체를 통해 구축된 유전자지도에서 과형에 대한 높은 연관성을 보이는 SNP 영역이 위치한 연관그룹 7번을 나타낸다. 좌측의 숫자들은 각 유전체의 상단으로부터의 cM 거리를 나타내며, 빨간색 막대는 과형에 대한 높은 연관성을 보이는 SNP 영역을 나타낸다. 초록색 및 빨간색 문자는 배의 유전체에 존재하는 2-6bp의 단순염기서열반복(simple sequence repeat)의 모티프(motif)를 포함하도록 고안된 염기서열로 구성된 분자마커를 의미한다.
도 5는 황금배 및 압리간의 종간교배 F1 개체군의 100개체를 통해 구축된 유전자지도에서 과형에 대한 높은 연관성을 보이는 SNP 영역이 위치한 연관그룹 12번을 나타낸다. 좌측의 숫자들은 각 유전체의 상단으로부터의 cM 거리를 나타내며, 빨간색 막대는 과형에 대한 높은 연관성을 보이는 SNP 영역을 나타낸다. 초록색 및 빨간색 문자는 배의 유전체에 존재하는 2-6bp의 단순염기서열반복(simple sequence repeat)의 모티프(motif)를 포함하도록 고안된 염기서열로 구성된 분자마커를 의미한다.
도 6은 CBp06sn_01 프라이머 세트, CBp06sn_02 프라이머 세트, CBp07sn_01 프라이머 세트, CBp12sn_01 프라이머 세트, CBp12sn_02 프라이머 세트 및 CBp12sn_03 프라이머 세트를 각각 이용하여 황금배 및 압리를 대상으로 HRM(high-resolution melting) 분석을 수행하여 얻은 융해곡선(melting curve)을 통해 황금배 및 압리의 유전자형을 확인한 결과이다.
도 7은 CBp06sn_01 프라이머 세트, CBp06sn_02 프라이머 세트, CBp07sn_01 프라이머 세트, CBp12sn_01 프라이머 세트, CBp12sn_02 프라이머 세트 및 CBp12sn_03 프라이머 세트를 각각 이용하여 황금배 및 압리의 종간교배 F1 집단을 대상으로 HRM 분석을 수행하여 얻은 융해곡선을 통해 이들의 종간교배 F1 집단의 유전자형을 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배의 과형을 예측하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 프라이머 세트는, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 배는 황금배 품종 및 압리 품종의 종간교배 F1 집단의 배일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 프라이머 세트는, 황금배 품종 및 압리 품종의 종간교배 F1 집단에서 과형 특성에 밀접한 연관성을 보이는 SNP(single nucleotide polymorphism)를 탐색한 후, 이를 증폭할 수 있는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 CBp06sn_02 마커 증폭용 프라이머 세트이고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 CBp07sn_01 마커 증폭용 프라이머 세트이고, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 CBp12sn_03 마커 증폭용 프라이머 세트이다. 서열번호 3, 5 및 11은 정방향 프라이머이고, 서열번호 4, 6 및 12는 역방향 프라이머이다.
본 발명의 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 조합을 이용하거나; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 조합을 이용하면 보다 높은 확률로 황금배 품종 및 압리 품종의 종간교배 F1 집단의 과형을 예측할 수 있다(표 2).
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 내의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 배의 과형을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs,본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
배 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 표적 서열을 분석하고 배의 과형을 예측하는 단계;를 포함하는, 배의 과형을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 배의 과형을 예측하는 방법에 있어서, 상기 배 시료는 황금배 품종 및 압리 품종의 종간교배 F1 집단의 배일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega사)를 이용할 수도 있다.
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 HRM(High Resolution Melting), 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응 (ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증 (strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 T/G의 유전형이 확인되면 황금배의 과형으로 G/G의 유전형이 확인되면 압리의 과형으로 예측할 수 있으며, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 A/G의 유전형이 확인되면 황금배의 과형으로 A/A의 유전형이 확인되면 압리의 과형으로 예측할 수 있으며, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트에 의해 A/A의 유전형이 확인되면 황금배의 과형으로 A/G의 유전형이 확인되면 압리의 과형으로 예측할 수 있다. 바람직하게는 상기 표적 서열의 증폭은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 프라이머 세트를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
HRM(high resolution melting) 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법으로, "HRM curve 분석"이라고도 하며, 1개의 염기서열 차이도 판별할 수 있도록 0.1~0.5℃ 단위로 정밀하게 융해곡선(melting curve)를 분석하는 방식을 주로 SNP 분석에 적용된다. HRM 분석은 PCR을 통한 증폭 과정 진행 후 이가로스 겔 또는 아크릴아마이드 겔을 만들어 전기영동을 할 필요가 없으며, 실시간유전자 증폭기를 이용한 PCR과 HRM 분석 전용 소프트프로그램(Bio-rad Precision Melt Software)을 활용하여 융해곡선 패턴을 비교하기 때문에 분석에 소요되는 시간을 줄일 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 배의 과형 예측은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 다음, 증폭산물의 해리 온도에 따른 형광 정도를 측정하여 융해곡선을 수득하고, 이를 통해 배의 과형을 예측할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 조합을 이용하거나; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트의 조합을 이용하면 보다 높은 확률로 황금배 품종 및 압리 품종의 종간교배 F1 집단의 과형을 예측할 수 있다(표 2).
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. '황금배' × '압리' 종간교배 F 1 집단의 DNA 추출 및 정량
'황금배(Pyrus pyrifolia)' × '압리(Pyrus bretschneideri, 중국어로 야리(Yali))' 종간교배 F1 집단의 선단부에서 유엽을 채취하고 증류수로 세척한 후 개체별로 포장하여 -80℃에서 보관하였다. 상기 채취한 유엽의 DNA 추출은 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide) 방법을 이용하였다. 어린 잎을 액체 질소를 이용하여 막자사발에 마쇄한 후 샘플 튜브에 옮겼다. 500㎕의 CTAB 버퍼를 첨가하고, 2㎕의 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol)을 첨가한 이후 65℃의 항온수조에 30분간 반응시켰다. 5M 아세트산 칼륨 200㎕를 첨가 후 30분간 얼음에 처리하였다. 이후에, 페놀, 클로로포름 및 이소아밀알코올을 25:24:1로 혼합한 용액 600㎕를 첨가하고 13,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하였으며, 상등액을 새 튜브로 옮기고 600㎕의 클로로포름과 이소아밀알코올을 24:1로 혼합한 용액을 첨가 후 13,000rpm으로 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 새 튜브로 다시 옮기고 600㎕의 차가운 이소프로판올을 첨가하고 -20℃에서 30분간 탈수반응을 시킨 후 13,000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하고 가라앉은 침전물을 확인하였다. 이소프로판올을 버리고 침전물에 차가운 70% 에탄올 500㎕을 첨가한 후 13,000rpm으로 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 에탄올을 버리고 건조한 후, TE(Tris-EDTA) 버퍼 30㎕를 첨가하였다. 그 후, RNase A를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 처리하고, -80℃에 보관하였다. 추출된 게놈 DNA는 24ng/㎕로 정량하였다.
실시예 2. Pear 70K array를 이용한 SNP 표지 개발과 분석
염기서열 분석 및 유전자형 작성을 위해 Pear 70K SNP array를 이용하여 황금배와 압리 그리고 49개체의 '황금배'×'압리' 종간교배 F1 집단에 대한 유전자형 데이터를 확보하였다. Axiom Analysis Suite는 소프트웨어 패키지(Thermo Fisher Scientific사, USA)로 모든 Axiom araay의 유전자형 분석 및 선택된 Axiom araay의 카피수 분석도 가능하다. 따라서 Axiom Analysis Suite 소프트웨어 패키지를 이용하여 데이터를 가공하여 관련성 분석을 위한 SNP 유전자형 데이터를 확보하였다.
실시예 3. 표현형 분석
과실은 만개 후 93일에 각각의 개체로부터 과실 3개를 수확하였으며, 황금배는 원형의 특성을 지니며, 압리는 표주박 모양의 특성을 가지고 있음을 확인하였다(도 1). 각 과실의 가로 최대 직경(D)과 세로 최대 직경(L)을 버니어 캘리퍼스로 측정한 후에, 과형 지수(fruit shape index, L/D)를 계산한 결과, L/D값은 황금배에서 0.9, 압리에서 1.24로 평가되었다. '황금배'×'압리' 종간교배 F1 집단 49개체로부터 수확된 과실은 과형이 황금배와 압리의 중간형태로 확인되었으며, 가로/세로 비율이 1:1인 L/D값이 1이하인 F1 개체는 26개, L/D값이 1이상인 F1 개체는 23개로 판단되었다(도 2).
실시예 4. F 1 전형매가계(full-sib family)의 정밀 과형 유전자 지도작성
황금배와 압리간 종간교배 F1 집단의 100개체를 이용하여 유전자 지도를 작성하였다. JoinMap 5 프로그램을 이용하여 연관분석을 수행하였으며(연관그룹 설정시, LOD=15.0), 마커간의 유전자 지도 거리는 cM(centiMorgans; Kosambi 1944, Ann Eugen 12: 172-175) 단위로 계산하였다. 표현형과 유전자형 간에 연관성 분석은 MapQTL 6.0 프로그램을 이용하였다. 그 결과, 과형 특성에 밀접한 연관성을 보이는 SNP 표지 46개를 연관그룹 6, 7 및 12번 염색체에서 확인할 수 있었다(도 3 내지 도 5).
실시예 5. HRM(high-resolution melting) 분석을 통해 배의 과형 예측
Pear 70K SNP array 분석(Montanari et al. 2019, BMC Genomics., 20:331) 기반으로 과형 연관성이 있는 46개 연관성 마커의 위치를 중국배 레퍼런스 게놈(Wu et al. 2013, Genome research.,23:396-408)에서 BLAST하여 해당 위치를 탐색한 후에, 100-150bp 길이의 PCR 산물을 형성할 수 있도록 HRM 분석용 프라이머를 디자인하였다(표 1). HRM 반응물은 황금배, 압리 또는 이들의 종간교배집단 F1 개체의 gDNA 2㎕(50ng), 2×HRM PCR Master Mix 5㎕, 10μM의 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1㎕ 및 RNase-free water 1㎕를 혼합하여 조성하였고, Rotorgene real-time PCR(QIAGEN, 독일)로 HRM 분석을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 유지시킨 후, 40 사이클(95℃에서 10초, 60℃에서 30초, 72℃에서 10초)로 반복 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 65-95℃까지 0.1℃씩 증가시키면서 형광값을 측정하였다. 모든 사이클 과정이 종료된 후, Rotor-Gene Q Series Software를 이용하여 HRM 분석을 수행하였다.
상기 HRM 분석 결과, 본 발명의 프라이머 세트 6개를 각각 이용하여 황금배 및 압리를 대상으로 HRM(high-resolution melting) 분석을 수행하여 얻은 융해곡선(melting curve)을 통해 황금배 및 압리의 유전자형을 구분할 수 있었다(도 6). 또한, 본 발명의 6개의 프라이머 세트를 단독, 2개 조합 또는 3개 조합으로 사용하여 황금배와 압리의 종간교배 F1 집단 49개체를 대상으로 HRM을 수행하고(도 7) 실제 과형과의 예측 정확도를 분석한 결과, CBp07sn01 프라이머 세트 또는 CBp12sn03 프라이머 세트를 단독으로 이용하였을 때 유전자형으로 예측된 F1 과형과 실제 과형의 일치도가 67.3% 수준임을 알 수 있었고, 특히 CBp06sn02 및 CBp07sn01 프라이머 세트의 조합 또는 CBp06sn02 및 CBp12sn03 프라이머 세트의 조합을 이용하였을 때 F1 과형을 81.6%의 높은 확률로 예측할 수 있음을 확인하였다(표 2). 그러나, 상기 2개의 프라이머 세트의 조합에서 1개의 프라이머 세트를 추가하여 3개의 프라이머 세트를 조합하여 이용하였을 때에 과형 일치도에 변화가 없음을 알 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 CBp06sn02 및 CBp07sn01 프라이머 세트의 조합 또는 CBp06sn02 및 CBp12sn03 프라이머 세트의 조합이 배의 과형을 예측하기에 최적임을 입증하였다.
본 발명에 사용된 HRM 분석용 SNP 프라이머 및 정보
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') Tm
(℃)		 증폭산물
사이즈		 SNP 타입
[압리/황금배]
정방향 역방향
CBp06sn_01 TGGGTTGGCAGAGACATGTA
(서열번호 1)		 AGAAAAGTTTGCAGCAGACGT
(서열번호 2)		 60 89 [C/T]
CBp06sn_02 GCTCTCAAGGTTCACAACGA
(서열번호 3)		 TGCAGATGAAGGTTTGGAGG
(서열번호 4)		 60 92 [G/T]
CBp07sn_01 AGCATGATATCGTTTCAGTTGAC
(서열번호 5)		 GCATGCATACAGTGACAACCATA
(서열번호 6)		 60 90 [A/G]
CBp12sn_01 TTACGTATTTGGTGCAGGGG
(서열번호 7)		 TGCAATCAAACAGACCCTCA
(서열번호 8)		 60 93 [G/A]
CBp12sn_02 CTACGGCCAAATGAGCACAA
(서열번호 9)		 GAGGGAGGCTGATGGGATTT
(서열번호 10)		 60 91 [C/T]
CBp12sn_03 GGATTTGAGCAACCTATTATGGC
(서열번호 11)		 TCCTTTGGCCGTGACATTTG
(서열번호 12)		 60 120 [G/A]
SNP 프라이머 세트 이용할 시 과형 예측 일치도
SNP 프라이머 세트 개체수 일치 일치도(%)
CBp06sn01 49 20 40.8
CBp06sn02 48 29 60.4
CBp07sn01 49 33 67.3
CBp12sn01 49 29 59.2
CBp12sn02 49 27 55.1
CBp12sn03 49 33 67.3
CBp06sn01, CBp07sn01 49 36 73.5
CBp06sn01, CBp12sn01 49 33 67.3
CBp06sn01, CBp12sn02 49 32 65.3
CBp06sn01, CBp12sn03 49 38 77.6
CBp06sn02, CBp07sn01 49 40 81.6
CBp06sn02, CBp12sn01 49 37 75.5
CBp06sn02, CBp12sn02 49 34 69.4
CBp06sn02, CBp12sn03 49 40 81.6
CBp07sn01, CBp12sn01 49 37 75.5
CBp07sn01, CBp12sn02 49 38 77.6
CBp07sn01, CBp12sn03 49 38 77.6
CBp06sn01, CBp07sn01, CBp12sn01 49 37 75.5
CBp06sn01, CBp07sn01, CBp12sn02 49 39 79.6
CBp06sn01, CBp07sn01, CBp12sn03 49 38 77.6
CBp06sn02, CBp07sn01, CBp12sn01 49 40 81.6
CBp06sn02, CBp07sn01, CBp12sn02 49 39 79.6
CBp06sn02, CBp07sn01, CBp12sn03 49 40 81.6
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for predicting fruit shape of pear and use thereof <130> PN19445 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tgggttggca gagacatgta 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agaaaagttt gcagcagacg t 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gctctcaagg ttcacaacga 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgcagatgaa ggtttggagg 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agcatgatat cgtttcagtt gac 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gcatgcatac agtgacaacc ata 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ttacgtattt ggtgcagggg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tgcaatcaaa cagaccctca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctacggccaa atgagcacaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gagggaggct gatgggattt 20 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggatttgagc aacctattat ggc 23 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcctttggcc gtgacatttg 20

Claims (7)

  1. 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 프라이머 세트를 포함하는 배의 과형을 예측하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;인 것을 특징으로 하는 배의 과형을 예측하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 배의 과형을 예측하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 배의 과형을 예측하기 위한 키트.
  5. 배 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭된 표적 서열을 분석하고 배의 과형을 예측하는 단계;를 포함하는, 배의 과형을 예측하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배 시료는 황금배 품종 및 압리 품종의 종간교배 F1 집단의 배인 것을 특징으로 하는 배의 과형을 예측하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 배의 과형을 예측하는 방법.
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