KR101945953B1 - 고추 역병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

고추 역병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추 역병 저항성 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 고추 역병 저항성 품종 판별을 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 고추 역병 저항성 품종을 판별하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커 및 상기 분자마커 증폭용 프라이머 세트는 고추 역병에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 판별 및 육성하여 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

고추 역병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discriminating Phytophthora capsici resistant pepper cultivar and uses thereof}
본 발명은 고추 역병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
고추의 역병은 파이토프토라 캡사이시(Phytophthora capsici)에 의해 발병하는 것으로, 고추를 비롯하여 가지과, 박과 작물 등 다양한 기주 식물들을 침해하여 경제적으로 큰 피해를 주는 주요 식물병원균이다. 국내에서는 1967년 고추에서 최초로 병 발생이 보고된 이후, 수박, 토마토, 가지, 오이, 참외, 호박 등에서도 발생이 보고되어 있다. 특히 국내 전체 채소작물 재배면적의 23%를 차지하는 고추에 발병하여 전국적으로 농가에 큰 피해를 주고 있으며, 그 피해는 날로 증가하고 있다.
고추의 역병 피해를 줄이기 위해서 많은 화학적 방제법이 개발되었지만, 이는 일시적인 방제일 뿐, 완전한 방제가 불가능하여 역병 저항성 품종의 개발 및 보급이 가장 효율적이며 효과적인 방제방법으로 관심받고 있다.
현재까지 고추 역병균과 기주 식물인 고추와의 분자생물학적, 유전학적 연구는 아직 걸음마 단계이며 대부분의 연구는 저항성 분자 표지를 찾는 유전 분석에 초점이 맞추어져 왔다. 오랜 기간 동안 역병 저항성 유전자 지도를 이용하여 고추 역병저항성 유전자를 찾기 위한 다양한 시도가 있었지만, 아직까지 병 저항성 유전자 규명(cloning)은 이루어지지 않고 있다. 여러 작물에서 육종 가치가 높은 형질은 단일 유전자좌에 조절되는 질적 형질(qualitative character)보다 둘 이상의 유전자 즉, 양적 형질 유전자좌(Quantitative trait locus, QTL)에 의해 유전되는 경우가 많다. 고추의 역병 저항성 역시 양적 형질 유전자좌에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다. 역병 저항성은 연구 그룹 또는 식물 재료에 따라 양적 형질 유전자좌의 수 및 위치가 다르지만 염색체 5번에 한 개의 주동유전자좌(major QTL)가 공통적으로 존재한다는 연구 결과가 보고되었다.
식물 세포에 존재하는 저항성 유전자 유사체(Resistance Gene Analogs, RGAs)는 특정한 보존된 구조를 가지고 있으며 병원균을 인지하여 면역반응을 유도하게 된다. RGAs로는 NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat), RLP(receptor like protein) 및 RLK(receptor like kinase)가 알려져 있다. RGAs들은 병원균의 PAMP(pathogen associated molecular pattern)와 병원균이 식물 세포내로 분비하는 작동자(effector)를 인지하여 식물체의 면역반응을 유도한다.
최근에, 고추 역병 저항성 후보유전자로 RGAs가 대두되고 있지만, 고추 유전체 크기(3.5 Gbp)는 근연종인 감자 및 토마토 유전체 크기(800~900 Mbp)에 비해 3~4배 정도 크기 때문에, 기존의 유전자 지도를 기반으로 한 분자 표지 개발 및 활용을 통한 저항성 유전자 규명에는 많은 시간과 비용의 제약이 따른다. 특히, RGAs는 식물 유전체에 수백개의 유전자군을 이루고 있고, 각 식물 종의 RGAs 하부 그룹에 따라 복제 기작에 따른 상동성이 높은 유사 구조를 가지고 있어 단순 서열 분석만으로는 유전자 동정 및 규명에 어려움이 따른다. 기존의 연구를 통해 주동 유전자에 대한 다양한 연관 분자마커가 개발되었지만, 고추의 유전자원의 저항성 집단과 품종 등에 따라 적용범위가 달라지기 때문에 극히 제한적으로 사용 가능하다는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 분자표지를 기반으로 고추 유전체 정보를 분석하여 역병 저항성 주동 유전자가 존재하는 영역을 확정하고, 상기 영역에 존재하는 RGAs 후보 유전자들의 생물정보학적 특성을 기반으로 후보 유전자들을 동정하고, 이들 후보 유전자들에 대한 DNA 서열의 다형성을 분석하여 분자표지 개발을 수행하였다. 또한, 개발된 분자표지들을 이용하여 다양한 고추 유전자원에 역병저항성 표현형과 연관 관계를 분석하였다.
한편, 한국공개특허 제2017-0065110호에는 '고추 병 저항성 품종 판별을 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0015591호에는 '파이토프쏘라 캡사이시 유래의 식물 역병 예방 또는 방제용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 고추 역병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고추 역병에 저항성을 가지는 고추 CM334 유전체의 염색체 5번에 위치하는 주동유전자좌(major QTL)를 확보하였고, 상기 QTL에 존재하는 저항성 유전자 유사체(RGAs)인 NBS-LRR, RLP 및 RLK 서열에 기반한 SNP(single nucleotide polymorphism) 분자마커를 개발하였고, 상기 SNP 분자마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 고추 61개 품종을 대상으로 유전형을 분석한 결과, 본 발명의 분자마커가 고추역병 저항성 품종을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 및 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 역병 저항성 품종을 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추의 역병 저항성 종품 판별을 위한 키트을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추의 역병 저항성 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 RGAs 서열 기반 SNP 분자마커는 고추 역병에 저항성을 갖는 고추 품종을 조기에 선별하여 육성할 수 있으므로, 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대되며, 본 발명의 SNP 분자마커를 이용하여 육성한 고추 역병 저항성 품종의 보급은 고추 재배 농가의 소득 창출에 기여할 수 있을 것이다.
도 1은 고추 5번 염색체의 QTL 영역 및 RGAs 정보를 나타낸 유전자 지도와 물리적 지도로, A는 기존에 보고된 분자마커의 위치와 QTL 정보를 고추 염색체 5번에서 나타낸 유전자 지도이고, B는 상기 A의 분자마커들의 위치와 QTL 영역에서 RGAs를 기반으로 개발한 본 발명의 분자마커의 위치를 나타낸 물리적 지도이다. 본 발명에서 개발한 분자마커의 공분리(co-segregation) 비율을 괄호안에 나타내었다.
도 2는 본 발명에서 개발한 CaNB-5390, CaNB-5410, CaNB-5440, CaNB-5480, CaNB-5500, CaNB-5720, CaRP-5130, CaNB-5330, CaRK-5470, CaNB-5530, CaNB-5170 분자마커 및 기존에 보고된 142964 분자마커의 HRM(high resolution melting) 분석 결과이다. R; 역병 저항성 품종의 해리곡선과 동일한 유전형을 가지는 품종(저항성 동형접합체), S; 감수성 품종의 해리곡선과 동일한 유전형을 가지는 품종(이병성 동형접합체), H; 중도저항성의 해리곡선과 동일한 유전형을 가지는 품종(이형접합체).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 역병 저항성 품종을 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 11개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 11개의 프라이머 세트 즉, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 서열번호 19 및 20; 및 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 모두를 포함할 수 있다. 상기 11개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 고추 역병 저항성 품종을 더욱 효율적으로 구별할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 내지 22의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(24개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 22의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추의 역병 저항성 종품 판별을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추의 역병 저항성 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 고추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 조합은 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 고추의 역병 저항성 품종을 판별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 HRM(high resolution melting) 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
HRM 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 RT-PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리한다. 또한, 증폭 산물을 검출하는 방법 중 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고추 자원의 수집 및 게놈 DNA 추출
본 발명에 사용된 고추 자원 중 상업적 자원으로 판매되는 품종(commercial cultivar)은 종묘상에서 구매하였고, 유전적 자원(genetic resource)과 근교계(inbred line) 그리고 근원종(landrace) 품종은 연구실 증식 종자를 사용하였다.
게놈 DNA 추출을 위해 고추의 어린 잎 6장을 막자사발로 분쇄하였고, 상기 잎의 분쇄물을 이용하여 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Brimide) 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다.
우선, 고추 잎 분쇄물을 1.5 ml 튜브에 넣고 CTAB 핵산 추출 완충액(2% CTAB, 100 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.4 M NaCl) 600 ㎕, PVP(PolyVinylPirrolidone) 0.5 g 및 β-머캡토에탄올(β-mercaptoethanol) 20 ㎕를 넣은 후, 65℃에서 20분 간격으로 섞어주며 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물에 클로로폼(chloroform)과 아이소아밀 알코올(isoamyl alcohol)을 24:1 비율로 혼합한 CI 용액 700 ㎕를 넣어주고 4℃, 15,814 xg 조건으로 15분간 원심분리하였다. 상기 원심분리 후 상층액을 버리고 상층액과 동일한 양인 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)을 400 ㎕를 넣고 -20℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 70% 에탄올을 사용하여 20분 동안 2번 세척하여 상온에 건조시킨 다음 3차 증류수에 용해시켰다. 마지막으로 RNA 제거를 위해, 리보핵산가수분해효소 A(ribonuclease A, RNaseA)를 처리하였다. 상기 과정을 통해 추출된 게놈 DNA는 NanoDrop 2000TM ND-2000(Thermo ScientificTM)을 이용하여 20 ng/㎕의 농도로 희석하였다.
실시예 2. 고추 역병 주동유전자좌(major QTL) 영역 확보, RGAs 동정 및 SNP 분석
기존에 보고된 분자마커(표 1 참고) 중 QTL 영역에 위치하는 분자마커의 DNA 서열을 확보하였고, 상기 확보한 DNA 서열과 역병 저항성 고추 CM334(Capsicum annuum)의 DNA 서열을 Pepper Genome Platform(http://genome.pepper.snu.ac.kr/)으로 BLAST를 수행함으로써, 역병 저항성 고추 CM334의 5번 염색체에 존재하는 주동유전자좌(major QTL) 영역을 파악하였다. 상기 주동유전자좌의 영역은 기존에 보고된 마커를 양끝으로 하는 유전체 영역을 타겟 영역으로 설정하였으며, QTL 영역 안에서 아직까지 분자마커로 개발되지 않은 유전자를 선발하였다. 기존에 개발된 분자마커 및 CM334 염색체의 5번 염색체에 존재하는 본 발명의 분자마커(CaNB-5390, CaNB-5410, CaNB-5440, CaNB-5480, CaNB-5500, CaNB-5720, CaRP-5130, CaNB-5330, CaRK-5470, CaNB-5530 및 CaNB-5170)의 정보는 하기 표 1에 정리하였다.
또한, 선발된 유전자들의 단백질 서열을 이용하여 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)와 Pfam(http://pfam.xfam.org/)으로 RGAs 구조를 갖는 유전자들을 동정하였다. 그 결과, 염색체 5번의 주동유전자좌 영역은 6.2 Mbp(U196349)~139.2 Mbp(P5-SNAP-CM)에 위치해 있음을 확인하였고, QTL 영역 내에는 845개의 유전자가 포함되어 있으며, 그 중 NBS-LRR이 15개, RLK가 3개 및 RLP가 2개 있음을 확인하였다.
또한, 상기 동정된 유전자 중 분자마커 개발을 위한 후보 유전자를 선정하기 위해 역병 저항성 품종과 이병성 품종(C. annuum NB1)의 DNA 서열을 이용하여 MSA(Multiple Sequences Alignment)로 SNP(single nucleotide polymorpism) 분석을 수행하여, 역병 저항성 품종과 이병성 품종 간의 SNP에 기반한 총 11개의 분자마커(NBS-LRR 9개, RLK 1개, RLP 1개)를 개발하였다(도 1).
Figure 112017115697034-pat00001
실시예 3. SNP 분자마커의 개발
상기 저항성 품종과 이병성 품종 간의 DNA 서열 비교 결과를 통해, NBS-LRR에 기반한 분자마커(CaNB-5390, CaNB-5410, CaNB-5440, CaNB-5480, CaNB-5550, CaNB-5720, CaNB-5330, CaNB-5530, CaNB-5170), RLK에 기반한 분자마커(CaRK-5470) 및 RLP에 기반한 분자마커(CaRP-5130), 총 11개를 선별하였으며, 상기 11개의 SNP 분자마커를 확인하기 위해, Primer3Plus(http://www.bioinformatiformatics/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)로 프라이머를 제작하였다(표 2). 142964는 기존에 역병 저항성과 관련있는 것으로 보고된 분자표지로, 비교군으로 사용되었다.
Figure 112017115697034-pat00002
실시예 4. SNP 분자마커를 이용한 고추 품종의 유전형 분석
본 발명에서 개발된 분자마커를 이용하여, 고추 품종의 유전자형 분석을 위해, 상기 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 Rotorgene real-time PCR(QIAGEN, 독일)로 HRM(High-Resolution Melting) 분석을 수행하였다. 실험에 사용된 고추 품종은 역병 저항성(resistant) 44품종, 중도저항성(moderately resistant) 3품종 및 감수성(susceptible) 14품종으로, 총 61개의 고추 품종을 분석하였다(표 3 및 표 4). PCR 반응액은 40 ng/㎕의 주형 핵산, 프라이머 10 pmole/㎕, 10x EasyTaq® 완충액(200 mM Tris-HCl pH 8.3, 200 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4), dNTPs 2.5 mM, SYTO®9 green fluorescent 5 mM, EasyTaq® 핵산중합효소(DNA polymerase) 0.5 U를 넣어 총 20 ㎕이 되도록 혼합하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 유지시킨 다음 40 사이클(95℃ 10초, 60℃ 20초)로 반복한 뒤, 융해곡선(Melt curve) 분석 단계에서는 95℃ 10초, 40℃ 1분, 65℃ 1초간 진행하여 0.1℃마다 형광(fluorescence)을 측정하였다.
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상기 HRM 분석 결과, 본 발명의 11개 분자마커 해리곡선을 통해 고추 61개 품종이 저항성(R), 감수성(S) 및 중도저항성(H) 품종으로 구별되는 것을 확인하였다(도 2). 도면 2의 그래프는 표준(standard) 시료로 사용한 품종과 함께, 실험군으로 저항성 품종은 PR 절세미인, 무병지대를 사용하였고, 중도 저항성 품종은 PR 무적, 역강수문장, 역강홍장군을 사용하였으며, 이병성 품종으로는 칠성초, 제주, 금수강산을 사용하였다.
또한, 상기 HRM 분석 결과를 통해 고추 61개 품종에 대한 분자마커의 효용성을 평가하여 각 고추 품종에 대한 유전형 분석의 결과를 하기 표 5 및 표 6에 정리하였다. 본 발명의 11개 마커를 이용하여 저항성 고추 품종(R1~R44), 중도저항성 고추 품종(MR1~MR3) 및 감수성 품종(S1~S14)을 대상으로 유전형을 분석했을 때, 이미 알려진 고추 품종의 역병 관련 형질이 다르게 확인되는 경우가 관찰되었다. 예를 들어, 저항성 고추 품종으로 알려진 PBC602를 대상으로 하여 본 발명의 분자마커를 사용하여 유전형을 분석한 경우에, 분자마커 11개 중 CaNB-5390, CaNB-5440, CaNB-5500 및 CaNB-5330 마커의 경우, 유전형 분석 결과에서는 저항성이 아닌 감수성의 고추 품종으로 나타나는 것을 확인하였다. 본 발명에서 사용한 61개 품종의 고추는 유전자의 재조합(recombination)에 의해 본 발명의 분자 마커 적용 시에 서로 다른 결과가 나올 것으로 사료되었다. 또한, 기존에 개발되어 있는 분자 마커 중 100% 공분리(co-segregation)되는 분자 마커는 없는 실정이다. 따라서 여러 개의 분자 마커를 조합하여 저항성 품종에 판별 적용하면 90% 이상의 높은 효율로 병 저항성 판별이 가능하다.
표 5 및 표 6의 결과를 토대로, 본 발명의 분자마커 11개는 표현형과의 공분리(co-segregation) 비율에 있어서, CaNB-5390은 77%; CaNB-5410은 62.3%; CaNB-5440은 37.7%, CaNB-5480은 86.9%; CaNB-5500은 83.6%; CaNB-5720은 67.2%; CaRP-5130은 81.97%; CaNB-5330은 83.6%; CaRK-5470은 70.5%; CaNB-5530은 80.3%; 및 CaNB-5170은 49.2%로 나타났으며, CaNB-5480(86.9%), CaNB-5500(83.6%), CaNB-5330(83.6%), CaRP-5130(81.97%) 및 CaRK-5470(70.5%)의 순으로 역병 저항성과 가장 가깝게 연관되어 있음을 확인하였다.
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<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Molecular marker for discriminating Phytophthora capsici resistant pepper cultivar and uses thereof <130> PN17398 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aagccgggtc ttataaactt ccat 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cttgtgaaca tccaaagtta gggg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tagaatccat caaccgtacg taga 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 attgagttag gtggcatctt gact 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gttcgacgag gctctacttt ga 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcagtctgcc aggattaaca atga 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcgaaatcaa tactcctcct tccc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctcacgcgtt gttcttaaaa ggtt 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tcatttatgc gtgcagtatc gtac 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aaatataccc ctcaatgaca caca 24 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggaagtccat tttatctatc ctcaga 26 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atgattttgg gggatttcaa tagt 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gacacatttt gcagattcat caac 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cacccaaaaa ggtaaaaaga aaca 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aagaaagccg tcaccttcat agat 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gctaatttgc aaggattacg ctca 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 tttcaatatc caaagaacac aaca 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gtgaacccaa tgtgatagtg aaag 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gctccgtgtt catctatgtt aaaca 25 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aacagaagga tccatcagca tcat 24 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tatctcctac atcccactga caac 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cttgtcatgg gtggtgcatt aatg 24 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 aaagcttttt acatctcatt caacg 25 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 agtttgagca acatagatgt ggag 24

Claims (5)

  1. 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 고추 역병 저항성 품종 CM334, PBC602, PI201234, PBC280 또는 PBC495를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제1항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추의 역병 저항성 품종 CM334, PBC602, PI201234, PBC280 또는 PBC495 판별을 위한 키트.
  3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충액을 포함하는 것인 키트.
  4. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추의 역병 저항성 품종 CM334, PBC602, PI201234, PBC280 또는 PBC495를 판별하기 위한 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 HRM 분석, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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