KR101410329B1 - Ｔｓｗｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TSWV 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 고추 작물들에 적용하여 TSWV에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있게 하는 기반기술을 제공하고자 하는 것이다.

Description

ＴＳＷＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트 {Primer set, method and kit for selecting TSWV-resistant pepper cultivar}

본 발명은 TSWV 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 TSWV (Tomato spotted wilt virus)에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법에 관한 것이다.

부니아바이러스과 (Bunyaviridae family), 토스포바이러스속 (Tospovirus genus)에 속하는 TSWV (Tomato spotted wilt virus)는 1920년대에 처음 발견되었다. TSWV의 유전체는 3부분으로 나뉘어져 있으며 약 80~110nm 크기의 RNA로 구성되어 있다. 기주 범위가 매우 넓어 약 900 종의 식물을 감염시킬 수 있으며, 총채벌레 (Thripidae, Thysanoptera)를 매개로 한 감염이 많다.

TSWV에 전염된 고추는 수확량이 감소하고 과실의 품질이 저하되는데, 최근 한국 전라남도를 중심으로 TSWV에 의한 병해가 발생했고, 빠른 속도로 감염이 확산되고 있어 큰 피해가 발생하고 있다. TSWV와 같은 바이러스에 의한 병은 화학적 또는 생물적 방제가 매우 어렵고, 또한 TSWV는 국내에 만연한 총채벌레에 의해 전염될 수 있기 때문에 병 저항성 유전자를 이용한 저항성 품종의 육성이 절실하게 필요하다.

여러 연구 그룹에서 TSWV 저항성을 연구했는데, 캡시쿰 치넨세 (Capsicum Chinense) 및 캡시쿰 바카툼 (C. baccatum) 종 'PI152225', 'PI159236', 'CNPH-275', 'PI-15', 'C00943', '7204', 'ECU-973'에서 저항성 유전자원을 찾았다. 대립유전자 검정 (allelism test) 결과 캡시쿰 치넨세에 속하는 'PI159236', 'PI152225', 'CNPH-275', '7204'의 TSWV 저항성이 단일 우성 유전자에 의해 유전된다는 사실을 확인했고, 그 유전자가 하나의 유전자좌 'Tsw'에 위치한다는 것을 확인하였다.

최근의 분자유전학적인 연구에 의해 Tsw 유전자가 염색체 10번에 위치한다는 사실이 밝혀졌다. 2개의 연구 그룹은 Tsw 저항성 유전자를 이용한 효율적인 육종을 위하여 RAPD (random amplified polymorphic DNA) 및 RFLP (restriction fragment length polymorphism)를 이용하여 저항성 유전자 연관 분자마커를 개발했다 (Moury et al ., Genome, 2000, 43(1): 137-142, 2000). 그 중 한 연구 그룹에서는 유전적 거리가 가까우면서도 비교적 분석이 용이한 PCR-기반 분자마커인 SCAC568을 개발했다. 그러나 SCAC568은 Tsw 유전자좌로부터 1cM 이상 떨어져 있고, 또한 단 하나의 분자마커이기 때문에 육종 소재의 TSWV 저항성 유전형을 분석하는 데 한계가 있다.

한편, 한국등록특허 제0984169호에는 'TMV 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0129358호에는 'PMMoV 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트'가 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 TSWV 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 TSWV에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 육성하기 위해 고추와 토마토의 비교유전체 방법을 이용하여 고추의 Tsw 저항성 유전자좌에 연관된 18개의 분자마커를 개발하였고, Tsw 저항성 유전자를 중심으로 양 방향에 위치하면서 가장 가깝게 연관된 4개의 분자마커 세트를 이용하여 고추의 TSWV 저항성 동형접합체, 이병성 동형접합체 및 이형접합체 유전형을 분명하게 선별할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 TSWV (Tomato spotted wilt virus)에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 분자마커를 고추 작물에 적용하면, TSWV에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 TSWV 저항성 유전자 분자마커 및 본 발명에서 제공하는 TSWV 저항성 고추 품종 선별 방법은 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 TSWV 저항성 고추 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 안정적인 고품질 고추 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.

도 1은 고추와 토마토의 비교유전체 연구 방법을 통해 개발한 분자마커를 나타낸다. TG420 분자마커를 이용하여 Tsw 유전 지역에 해당하는 (corresponding) 토마토 유전체 염기서열을 찾은 후, 다시 토마토 유전체 염기서열과 유사한 고추 유전체 염기서열을 찾아 18개의 분자마커를 개발했다. 분자마커에 대한 유전자 지도는 2개의 F2 분리집단에서 공분리 분석을 수행하여 얻은 결과를 바탕으로 작성되었다.
도 2는 TSWV N-7, TSWV N-8, TSWV S-1, TSWV S-2 분자마커의 HRM 분석 결과를 나타낸다. Tsw 유전자를 중심으로 양 방향에 위치하면서 가장 가깝게 연관된 4개 분자마커의 HRM 분석 결과로, 저항성 동형접합체 (R), 이병성 동형접합체 (S), 이형접합체 (H) 유전형이 분명하게 구별된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 TSWV (Tomato spotted wilt virus)에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 5의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 7의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 8의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

상기 서열번호 9 내지 36의 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 8의 올리고뉴클레오티드가 해당 올리고뉴클레오티드의 연속된 뉴클레오티드 절편을 포함할 수 있는 것처럼 해당 올리고뉴클레오티드의 연속된 뉴클레오티드 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도 (complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체 (analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 (alkylphosphorothioate) 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질 (intercalating agent)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

또한, 본 발명은

고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트 (Promega)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응 (PCR), 리가아제 연쇄반응 (ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭 (nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템 (transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소 (replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

TSWV 저항성 유전자에 연관된 분자마커를 개발하기 위하여 2개의 분리집단인 'Telmo' F2 집단, 'Special x PI152225' F2 집단을 이용했다. Telmo F2 집단은 Enza Zaden의 F1 상용품종인 'Telmo'를 자가교배하여 얻은 210개체로 구성되고, SP F2 집단은 TSWV 저항성 계통 (accession)인 'PI152225'와 이병성 품종인 'Special'을 교배한 F1을 다시 자가교배하여 얻은 843개체로 구성된다. 분리 집단의 병 저항성을 평가하기 위한 접종 실험에서 저항성 대조군으로 'PI152225' 및 'PI159234'를 사용했고, 이병성 대조군으로는 'RNaky' 및 'Special'을 사용했다.

2. TSWV 균주 및 저항성 평가

TSWV 균주 (isolate)는 국립원예특작과학원의 TSWVPap.을 분양받아 사용했고, 담배 (Nicotiana rustica)를 이용하여 증식시켰다. 분리집단의 종자를 파종하고 3주가 지난 뒤 카보런덤 (carborundum)을 이용한 즙액 접종법으로 바이러스를 접종했으며, 접종 2주 후에 접종하지 않은 상엽의 병징을 확인하여 병 저항성을 평가했다. 잎에 황화 현상이 나타나거나, 신초가 죽으면서 줄기가 검게 말라 죽는 개체는 이병성으로 분류했고, 잎에서 시료를 채취하여 DAS-ELISA 분석을 통해 다시 한번 TSWV 감염 여부를 확인했다.

3. 게놈 DNA 추출과 유전자형의 결정

식물체의 게놈 DNA는 CTAB (Hexadecyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 추출하였다. 1.4ml 튜브에 어린 잎 2장과 2개의 비드 (bead), CTAB 버퍼 (2% CTAB, 20mM EDTA, 100mM Tris-Cl pH 8.0, 1.4M NaCl) 500㎕, PVP (PolyVinylPirroliodone) 0.5g, β-머캅토 에탄올 20㎕을 넣고, 조직분쇄기 (tissue lyser, QIAGEN)를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄 후 1 시간 동안 65℃에서 가열하면서 20분 간격마다 잘 섞어 주었다. 반응 후 클로로포름 (chloroform)과 이소아밀알코올 (isoamylalcohol)을 24:1로 섞은 CI 용액 500㎕를 넣어 잘 섞고, comti-514R 원심분리기를 이용하여 3,000rpm으로 30분간 원심분리 한다. 상층액을 96 웰 v-보텀 플레이트 (v-bottom plate)로 옮기고 동량의 이소프로필 알코올 (isopropyl alcohol)을 넣은 다음 -20℃에서 1~2시간 반응시킨다. gDNA를 응축시키기 위해 3,000rpm으로 30분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 펠렛을 얻었다. 펠렛은 70% 에탄올을 첨가하여 3000rpm에서 20분간 원심분리하는 과정을 두 번 수행한 후 상온에서 건조하고 TDW에 용해시켰다.

SNP 분자마커의 유전자형 분석은 Rotorgene real-time PCR 장비 (Corbett research)를 이용한 HRM 분석으로 수행하였다. 각 반응마다 1xPCR 완충액 (500mM KCl, 100mM Tris-Cl (pH 8.3), 15mM의 MgCl₂), 프라이머 0.5pM, 주형 핵산 50ng, dNTPs 0.25mM, SYTO9 0.25mM, 핵산중합효소 0.5U을 넣고 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 4분 동안 반응시키고, 95℃ 20초, 58℃ 20초 및 72℃ 30초로 구성되는 반응을 45회 반복한 후, 70~90℃ 온도 범위에서 0.1℃ 마다 형광을 측정하였다. 캡시쿰 치넨세 (C. chinense) 'PI152225'의 해리 곡선 그래프와 동일한 개체의 유전형을 저항성 동형접합체 (R)로, 캡시쿰 애넘 씨브이 (C. annuum cv .) 'Special'의 해리 곡선 그래프와 동일한 개체를 이병성 동형접합체 (S)로, 두 지표식물과 다른 형태의 그래프를 보이는 개체의 유전형은 이형접합체 (H)로 분석했다.

4. 고추와 토마토의 비교유전체 분석

고추 유전체 정보는 Capsicum annuum BAC 홈페이지 (cab.pepper.snu.ac.kr)에서, 토마토 유전체 정보는 Sol genomics network 홈페이지 (sogenomics.net)에서 얻었다. 비교적 근연관계가 가까운 작물 사이에서 유전자 서열은 잘 보존되어 (conserved) 있기 때문에 토마토 유전체 서열에서 유전자의 위치 및 염기서열을 예측하기 위하여 FGENESH 프로그램 (linux1.softberry.com)을 사용했다. 토마토의 유전자 서열을 이용하여 Capsicum annuum BAC 홈페이지의 BLAST 프로그램을 실행했고, 토마토 유전자와 유사한 (homology) 고추의 유전자를 포함한 고추 유전체 염기서열을 찾았다.

5. TSWV 저항성 유전자 연관 SNP 분자마커 개발

고추의 유전체 염기서열에서 FGENESH 분석을 수행하여 상대적으로 SNP의 분포율이 높은 유전자 간 서열 (intergenic sequence)을 구분했다. 유전자 간 서열에서 프라이머를 고안하고 PCR한 다음 PI152225 및 Special의 염기서열을 분석했다. 두 식물체의 염기서열을 비교하여 SNP를 찾고, SNP를 중심으로 약 200bp의 앰플리콘 (amplicon)을 증폭할 수 있도록 HRM 분자마커 프라이머를 디자인했다. HRM 분자마커는 PI152225 및 Special의 gDNA를 대조구로 사용하여 다형성을 확인했다.

6. 연관 분석 및 유전자 지도 작성

개발한 분자마커는 Telmo F2 집단, SP F2 집단에서 공분리 분석 (co-segregation analysis)을 수행했다. 분자마커 사이의, 그리고 분자마커와 병 저항성 유전자 사이의 유전적 거리를 계산하기 위하여 유전자 지도를 작성했다. 유전자지도 작성은 CarthaGene software 1.2 소프트웨어 (de Givry et al. 2005)를 이용했다. 유전적 거리 산출은 Kosambi function을 이용했고, 프로그램 옵션 세팅 값은 'LOD : 4, 최대유전적 거리 : 30cM'으로 조정했다.

실시예 1. TSWV 저항성 표현형 조사 및 유전분석

TSWV 저항성의 유전 양상을 분석하기 위하여 작성한 두 개의 F2 집단, 2개의 저항성 대조군 캡시쿰 애넘 'PI159234' 및 캡시쿰 애넘 'PI152225', 2개의 이병성 대조군 캡시쿰 애넘 씨브이 'RNaky' 및 캡시쿰 애넘 씨브이 'Special'에 TSWVPap을 접종한 뒤 병 발생을 관찰했다. 'PI159234' 및 'PI152225'는 접종한 30개체 모두 저항성을 나타냈고, 'RNaky' 및 'Special'은 30개체 모두 이병성으로 나타나 접종 실험이 성공한 것을 확인했다 (표 1). Telmo F2 집단에서는 전체 210개체 가운데 155개체가 저항성, 55개가 이병성으로 나타나는 3:1 분리비를 보여 TSWV 저항성이 단일 우성 유전자에 의해 유전된다는 것을 알 수 있었다 (P=0.690). 그러나 SP F2 집단은 전체 843개체 가운데 598개체가 저항성, 245개체가 이병성으로 나타나 통계적으로 3:1 분리비를 만족하지는 않았다 (P=0.006). 그러나 이후에 분자마커로 분석한 결과 단일 분자마커에 의해 각 개체의 저항성을 설명할 수 있기 때문에 SP F2 집단의 TSWV 저항성 역시 단일 우성 유전자에 의해 유전됨을 알 수 있었다.

Telmo F2 및 SP F2 분리집단의 병 저항성 검정 결과

계통 및 집단	예상 분리비 (R:S)	관찰된 개체 수		X2	P
		R	S
'RNaky'	0 : 1	0	30	-	-
'Special'	0 : 1	0	30	-	-
'PI159234'	1 : 0	30	0	-	-
'PI152225'	1 : 0	30	0	-	-
F2 'Telmo'	3 : 1	155	55	0.159	0.690
F2 'Speical' x 'PI152225'	3 : 1	598	245	7.42	0.0064

실시예 2. 비교유전체 분석을 통한 Tsw 연관 고추 유전체 서열 확보

고추에서 Tsw 유전자로부터 2.1cM 유전적 거리에 위치하는 TG420 분자마커는 토마토 유전자 지도 Tomato-EXPEN 2000의 염색체 10번에 위치하며, 길이가 7841kb인 SL1.50sc06504 스캐폴드 (scaffold)의 480kb~4481kb 위치에 TG420 분자마커의 염기서열이 존재한다 (도 1). TG420 분자마커로부터 토마토의 유전적 거리로 약 13.5cM 거리에 위치한 SL1.50sc06504의 5140kb 위치까지를 Tsw 저항성 유전자 해당 부위 (corresponding region)로 가정했다. 약 4480kb~5149kb 위치의 염기서열에 대해 FGENESH 프로그램을 이용하여 유전자 수와 위치를 예측했다. 총 103개 유전자가 예측되었고 그 염기서열을 이용하여 고추의 전체 유전체 염기서열 DB에서 BLAST 프로그램을 이용하여 높은 유사성 (similarity)를 보이는 고추 유전체 염기서열을 찾았다. 북쪽 방향 (north direction)에는 246kb의 스캐폴드, 남쪽 방향 (south direction)에는 653kb의 스캐폴드로 총 2개의 고추 스캐폴드를 찾았다 (도 1).

실시예 3. TSWV 저항성 유전자와 연관된 SNP 분자마커 개발

북쪽 방향 (North direction)의 스캐폴드에서 8개의 분자마커 TSWV N-1, TSWV N-2, TSWV N-3, TSWV N-4, TSWV N-5, TSWV N-6, TSWV N-7 및 TSWV N-8을 개발했다 (도 1). SP F2 집단에서는 8개의 분자마커가 모두 다형성을 보였다. 공분리 분석 결과 TSWV N-1 및 TSWV N-2는 843개체 가운데 8개체가 재조합체로 (0.94cM), TSWV N-3 및 TSWV N-4는 5개체가 재조합체로 (0.59cM), TSWV N-5 및 TSWV N-6는 4개체가 재조합체로 (0.47cM), TSWV N-7 및 TSWV N-8은 3개체가 재조합체로 (0.35cM) 각각 분석되었다 (표 2). Telmo F2 집단에서는 이 가운데 6개의 분자마커가 다형성을 보였다. 공분리분석 결과 TSWV N-1 및 TSWV N-2는 210개체 중에 5개체가 재조합체로 (2.38cM), TSWV N-4, TSWV N-5, TSWV N-6 및 TSWV N-7은 4개체가 재조합체로 (1.9cM) 각각 나타났다 (표 3).

남쪽 방향 (south direction)의 스캐폴드에서는 10개의 분자마커 TSWV S-1, TSWV S-2, TSWV S-3, TSWV S-4, TSWV S-5, TSWV S-6, TSWV S-7, TSWV S-8, TSWV S-9 및 TSWV S-10을 개발했다 (도 1). SP F2 집단에서는 10개의 분자마커가 모두 다형성을 보였다. TSWV S-1 및 TSWV S-2는 843개체 가운데 2개체가 재조합체로 (0.23cM), TSWV S-3 및 TSWV S-4 는 5개체가 재조합체로 (0.59cM), TSWV S-5, TSWV S-6, TSWV S-7, TSWV S-8, TSWV S-9 및 TSWV S-10은 7개체가 재조합체로 (0.89cM) 각각 분석되었다 (표 2). Telmo F2 집단에서는 TSWV S-1, TSWV S-3, TSWV S-4, TSWV S-5, TSWV S-6, TSWV S-7, TSWV S-8, TSWV S-9 및 TSWV S-10의 9개 분자마커가 다형성을 보였으며, 210개체 가운데 1개체만 재조합체로 (0.47cM) 분석되었다 (표 3).

이전에 개발된 분자마커 가운데 Tsw 유전자에 가장 가깝게 연관된 것으로 보고된 SCAC568는 SP F2 집단에서만 다형성을 보였는데, 843개체 가운데 16개체가 재조합체로 나타났고, Tsw 유전자로부터 1.89cM 거리에 위치했다. 이 결과를 미루어 볼 때 본 연구에서 개발한 분자마커는 모두 이전에 개발된 SCAC568보다 Tsw 유전자에 더 가까이 연관되었음을 알 수 있었다.

두 개의 F2 집단에서 각 분자마커 재조합체의 패턴을 분석한 결과 북쪽 방향 (north direction)의 스캐폴드에서 개발한 8개의 분자마커 (TSWV N-1~8)와 남쪽 방향 (south direction)의 스캐폴드에서 개발한 10개의 분자마커 (TSWV S-1~10)의 재조합 패턴이 상이하여 Tsw 유전자를 중심으로 서로 반대 방향에 위치하는 것을 알 수 있었다 (표 3). 서로 반대 방향에 위치하면서 Tsw 유전자에 가까이 연관된 TSWV N-7, TSWV N-8, TSWV S-1 및 TSWV S-2 분자마커를 각각 하나씩 사용하여 유전형을 분석한다면 약 1 - (0.35 x 0.23) = 99.92%의 확률로 정확하게 육종 소재의 TSWV 저항성을 분별할 수 있다 (표 2 및 도 2).

분자마커의 프라이머 서열

분자마커 이름	프라이머 서열 (5'-3')
TSWV N-1 F	GGGGGATCCTATCCATCCTA (서열번호 9)
TSWV N-1 R	CCTCGATGCAACGGTAAAAG (서열번호 10)
TSWV N-2 F	TCACCTCAATCGATCCTTGTC (서열번호 11)
TSWV N-2 R	GGAATGTTTGTCAATGGGAAC (서열번호 12)
TSWV N-3 F	TCGATTCTATCGTTCCATCAA (서열번호 13)
TSWV N-3 R	TCCAACCAAATCATTGGAGA (서열번호 14)
TSWV N-4 F	TGAGTTGATCGTCAAAAGAACACC (서열번호 15)
TSWV N-4 R	AACACACCTCAACTATCAGTTGTTCAC (서열번호 16)
TSWV N-5 F	AGGAAAACCCCACGTACCTT (서열번호 17)
TSWV N-5 R	CATTCTTCACCATTTCCTCTCA (서열번호 18)
TSWV N-6 F	CAAGTGTTCTGCGATTGGGC (서열번호 19)
TSWV N-6 R	CTTTGGTAGAGAAATCACAAGAGGC (서열번호 20)
TSWV N-7 F	CCATAAAAGTAAATCATGACAACAGGG (서열번호 5)
TSWV N-7 R	AGTGGCTGCAATAAGAAAGAACCC (서열번호 6)
TSWV N-8 F	AATGATTTATGGCTCTTCCTGGC (서열번호 7)
TSWV N-8 R	CAATAAAATGGGTGAAACAACCG (서열번호 8)
TSWV S-1 F	GCATGTACTTTGATTAAATTCCACGG (서열번호 1)
TSWV S-1 R	CAAGCTAACCCAAAGTAAATTAAAGCAA (서열번호 2)
TSWV S-2 F	GGAGGTAACAAGCAGAGACGGG (서열번호 3)
TSWV S-2 R	CATCCCATCACAAGCAGTAAGATAGC (서열번호 4)
TSWV S-3 F	CTTCCAAGTGCCCATTCATT (서열번호 21)
TSWV S-3 R	CAAAAGCAGCAGCAGAGTTG (서열번호 22)
TSWV S-4 F	GAGGATTCACTGAAACTGAAGAG (서열번호 23)
TSWV S-4 R	GTACTTTGTTCCCTTTTTCACTT (서열번호 24)
TSWV S-5 F	CGACCATGATTCCATCCTCA (서열번호 25)
TSWV S-5 R	CCATGTGATATTGGCTCGGG (서열번호 26)
TSWV S-6 F	TCTCTCTCTCCCCTCACGAA (서열번호 27)
TSWV S-6 R	TGCTGCTTTATGTTCGCTTG (서열번호 28)
TSWV S-7 F	TGAAATGAAGGCTGAAAGAGCG (서열번호 29)
TSWV S-7 R	TCACACCAAATTCTCAAACACTGC (서열번호 30)
TSWV S-8 F	GGGAGCTGGAGCACTTACAG (서열번호 31)
TSWV S-8 R	ATAATCCGCCGTGCTTACAG (서열번호 32)
TSWV S-9 F	CCAACTCAAGCATATTACTCCC (서열번호 33)
TSWV S-9 R	GGGTTATATGCATTTTCAGCC (서열번호 34)
TSWV S-10 F	TTGCAGGATTAGAAATACAAGCGTC (서열번호 35)
TSWV S-10 R	TTCCAGATTAGGACAAGAGACCTGC (서열번호 36)

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Primer set, method and kit for selecting TSWV-resistant pepper cultivar <130> PN12225 <160> 36 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 gcatgtactt tgattaaatt ccacgg 26 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 caagctaacc caaagtaaat taaagcaa 28 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ggaggtaaca agcagagacg gg 22 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 catcccatca caagcagtaa gatagc 26 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ccataaaagt aaatcatgac aacaggg 27 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 agtggctgca ataagaaaga accc 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aatgatttat ggctcttcct ggc 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 caataaaatg ggtgaaacaa ccg 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gggggatcct atccatccta 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 cctcgatgca acggtaaaag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 tcacctcaat cgatccttgt c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ggaatgtttg tcaatgggaa c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tcgattctat cgttccatca a 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tccaaccaaa tcattggaga 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 tgagttgatc gtcaaaagaa cacc 24 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 aacacacctc aactatcagt tgttcac 27 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 aggaaaaccc cacgtacctt 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 cattcttcac catttcctct ca 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 caagtgttct gcgattgggc 20 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ctttggtaga gaaatcacaa gaggc 25 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 cttccaagtg cccattcatt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 caaaagcagc agcagagttg 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gaggattcac tgaaactgaa gag 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gtactttgtt ccctttttca ctt 23 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 cgaccatgat tccatcctca 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ccatgtgata ttggctcggg 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 tctctctctc ccctcacgaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 tgctgcttta tgttcgcttg 20 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 tgaaatgaag gctgaaagag cg 22 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 tcacaccaaa ttctcaaaca ctgc 24 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 gggagctgga gcacttacag 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 ataatccgcc gtgcttacag 20 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 ccaactcaag catattactc cc 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 gggttatatg cattttcagc c 21 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 ttgcaggatt agaaatacaa gcgtc 25 <210> 36 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 ttccagatta ggacaagaga cctgc 25

Claims (8)

1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하고, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 TSWV (Tomato spotted wilt virus)에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 33 및 34의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 35 및 36의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
4. 제1항 또는 제3항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
6. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제3항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TSWV에 대해 저항성을 갖는 고추 품종을 선별하기 위한 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.

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