KR101818420B1 - 고추 흰가루병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

고추 흰가루병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추 흰가루병 저항성 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추의 흰가루병 저항성 품종 선별을 위한 키트 및 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한, 흰가루병 저항성 고추 품종 선별 방법에 관한 것으로, 본 발명의 분자마커는 고추 흰가루병에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

고추 흰가루병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discrimination of powdery mildew-resistant pepper cultivar and uses thereof}
본 발명은 고추 흰가루병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추의 흰가루병 저항성 유전자인 PMR1(powdery mildew resistance 1) 연관 분자마커에 관한 것이다.
흰가루병 병원균 레베일루라 타우리카(Leveillula taurica)는 자낭균류에 속하는 절대 기생하는 특징을 가진 곰팡이로 다양한 작물에 흰가루병을 일으켜 작물의 품질과 수확량에 큰 피해를 주고 있다. 흰가루병은 조기낙엽을 일으켜 작물의 수확량과 시장성을 떨어뜨린다. 지난 수십 년간 레베일루라 타우리카는 시설재배에서뿐만 아니라 노지에서도 문제가 되고 있다. 대부분의 흰가루병은 식물체 외부에 기생하는 균에 의한 것인 반면 레베일루라 타우리카는 내생하는 특성을 지녀 화학적 방제에 의한 효과가 미비한 실정이다. 따라서 레베일루라 타우리카에 의한 흰가루병의 방제를 위하여 저항성 유전자를 이용한 저항성 품종 육성의 필요성이 대두되고 있다.
고추의 경우 캡시쿰(Capsicum) 속에 속하는, 재배에 주로 사용하는 캡시쿰 안늄(C. annuum)은 레베일루라 타우리카에 대한 저항성이 부족하지만, 캡시쿰 박카툼(C. baccatum)과 캡시쿰 프루테스센스(C. frutescens)에서는 레베일루라 타우리카에 대한 고유 저항성이 발견됨에 따라 캡시쿰 안늄과의 종간 교잡을 통해 흰가루병 저항성 유전자의 이입이 가능해 졌다. 특히 캡시쿰 박카툼(C. baccatum) 종에서 다수의 계통이 흰가루병에 대해 고도의 저항성을 보였으며, 캡시쿰 치넨세(C. chinense)를 유전적 교량(genetic bridge)으로 이용하여 캡시쿰 안늄(C. annuum)에 도입할 수 있을 것이라 보고되었다.
고추에서 흰가루병의 저항성에 대한 연구는 에티오피아의 저항성 품종(Ethiopian resistant cultivar)인 H3와 이병성을 나타내는 Vania 품종를 교배 후 약배양(anther culture)을 통해 구축한 DH 집단을 활용하여 5개의 양적형질유전자좌(quantitative trait locus, QTL)가 밝혀진 바 있다. 이 중 Lt_6.1 유전자좌가 표현형에 약 26%로 가장 크게 영향을 미치고 Lt_9.1은 토마토의 Lv 좌(locus)와 오솔로그(ortholog)를 갖는다고 보고되었다.
고추의 흰가루병은 저항성과 유전연구에 대한 연구가 부족한 실정으로, 육종을 위한 저항성 유전자 탐색과 연관 분자표지 개발이 필요하다. 본 발명자들은 저항성 육종계통 'VK515 R'을 이병성 계통 'VK515 S'와 교배를 통해 F2:3 집단을 구축하여 유전양상을 분석하고 흰가루병 저항성 유전자인 PMR1이 염색체 4번에 위치하는 것을 밝혔고, 유전지역을 분자표지 CZ2_11628과 HRM4.1.6을 통해 4Mb 구간으로 한정하여, 이 유전지역 안에 재조합형이 나타나지 않은 0cM 분자표지 5개의 세트를 발명하여 육종 소재의 흰가루병 저항성을 신뢰성 있게 분석할 수 있도록 하였다.
한편, 한국등록특허 제0919753호에는 '메론 및 참외에서 유용한 흰가루병 저항성 연관 SCAR마커 및 이를 이용한 저항성 참외 품종 선발방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1010446호에는 '고추 탄저병 균주(Colletotrichum capsici)에 대한 저항성주동유전자 연관 분자표지 개발 및 이의 이용'이 개시되어 있으나, 본 발명의 고추 흰가루병 저항성 품종의 구별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 캡시쿰 안늄(Capsicum annuum) 저항성 육종계통 'VK515 R'과 이병성 계통 'VK515 S'의 교배를 통해 F2:3 집단을 구축하여 유전양상을 분석하였고, 흰가루병 저항성 유전자인 PMR1의 유전자 지도작성에서 5개의 분자마커(ZL1_10691, CZ2_11628, ZL1_1826, HRM2_A4, 및 HRM4.1.6)를 유전체 서열 기반으로 개발하였으며, PMR1의 기원 탐색에서 GBS 실험결과에 따라 3개의 SNP 분자마커(HPGV_1313, HPGV_1344, 및 HPGV_1412)를 추가로 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 및 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 흰가루병 저항성 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추의 흰가루병 저항성 품종 선별을 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한, 흰가루병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 분자마커는 고추 흰가루병에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대되며, 본 발명의 분자마커를 이용하여 육성한 고추 흰가루병 저항성 품종의 보급은 재배 농가에 고품질의 고추를 생산할 수 있게 할 것이다.
도 1은 고추 흰가루병에 대한 계통별 표현형을 보여주는 사진이다.
도 2는 PMR1의 연관지도로, a는 캡시쿰 안늄(Capsicum annuum)의 유전자 지도이고, b는 'VK515' F2:3 집단에 연관된 7개의 분자표지를 보여주는 지도이며, c는 'L_Zunla-1' 유전체의 염색체 4번 상의 SNP 분자표지의 물리적 위치를 나타내는 그림이다.
도 3은 PMR1의 유전자 지도 및 물리적 거리를 비교한 그림으로, a는 연관된 캡시쿰 아눔(C .annuum)의 'L_Zunla-1' 유전체의 4번 염색체 상에 PMR1 연관 마커의 물리적 위치를 보여 주는 그림이며, b 및 c는 'VK515' F2:3 집단의 유전자 지도로, c에서 3, 37 및 57은 헤테로저항성 재조합형 식물체를 83 및 27은 호모저항성 재조합형 식물체를 의미한다.
도 4는 PMR1의 기원을 찾기 위해 'VK515 R'과 'VK515 S'의 부모로부터 ZL1_1826과 HRM4.1.6 분자표지의 서열을 확인한 결과로, a는 특이적 InDel 분자표지를 보여주는 그림이며, b는 PMR1 지역의 GBS(genotyping by sequencing)에 따른 SNP 동정 결과로 확인된 22개 SNP의 계통발생 분석 결과이다. a 그림의 삼각형은 분자표지를 확인하기 위한 프라이머의 위치를 표시한 것이다.
도 5는 본 발명의 ZL1_1826 SCAR 분자표지와 CZ2_11628 CAPS 분자표지의 PCR 결과(a)와 SNP 분자표지 HRM4.1.6과 HRM2_A4의 HRM 표준곡선(b)을 나타낸다. RR: 저항성 유전형, rr: 이병성 유전형, Rr: 헤테로 F1 유전형.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 및 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 고추 흰가루병 저항성 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 8개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상의 프라이머 세트를 포함할 수 있고, 8개의 프라이머 세트 모두를 포함할 수도 있다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트들은, 캠시쿰 안늄(Capsicum annuum)의 저항성 육종계통 'VK515 R'과 이병성 계통 'VK515 S'의 교배를 통해 F2:3 집단을 구축하고, F2:3 집단의 유전양상을 분석하여 흰가루병 저항성 유전자인 PMR1이 염색체 4번에 위치한다는 것을 밝힌 후, 상기 유전지역을 분자표지 CZ2_11628과 HRM4.1.6을 통해 4Mb 구간으로 한정하여, 이 유전지역 안에 재조합형이 나타나지 않는 것으로 확인된 분자표지를 증폭할 수 있는 프라이머 세트들로, 유전체 서열 해독에 기반하여 개발한 2개의 SCAR(sequence-characterized amplified region) 마커를 증폭할 수 있는, 서열번호 1과 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3과 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와; 1개의 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 마커를 증폭할 수 있는, 서열번호 5와 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와; 2개의 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 증폭할 수 있는, 서열번호 7과 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9와 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 GBS(Genotyping-by-sequencing) 실험 결과로 동정된 다형성을 기반으로 개발된 3개의 SNP 마커를 증폭할 수 있는 서열번호 11과 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13과 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 15와 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 및 15는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 16은 역방향 프라이머이다.
본 발명의 용어 'F2:3 집단'은 F3 집단의 표현형으로부터 F2 유전형이 유추된 집단을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 저항성 육종계통 'VK515 R'과 이병성 계통 'VK515 S'의 교배를 통해 F2세대 102 개체의 집단을 구축하였으나, 흰가루병이 발생하지 않아 표현형 조사를 진행하지 못해, 세대를 진전하여 F2 각각의 식물체마다 F3 종자를 수확하여 20립씩 파종하여 1932 개체의 F3 집단을 구축하였고, 상기 1932 개체의 F3 집단을 F2 유전형 분석에 사용하여, 총 102개의 F2:3 집단이 발명에 사용되었다. F2:3 집단의 유전형은 전술한 바와 같이 F3 표현형으로부터 유추하였는데, F3의 표현형이 모두 저항성으로 확인되면 F2는 호모저항성; F3의 표현형이 저항성과 이병성으로 분리되면 F2는 헤테로 저항성; F3의 표현형이 모두 이병성으로 확인되면 F2는 호모이병성으로 판별하였다.
본 발명의 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 및 서열번호 15 및 16 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 및 서열번호 15 및 16의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트들은 고추 흰가루병에 대한 총 8개의 분자마커(분자표지)들을 기반으로 제작되었으며, 상기 분자마커들이 고추 흰가루병 저항성 품종 판별에 사용될 수 있는 것은 병 저항성 유전자 PMR1의 각 분자표지 위치에서 저항성 및 감수성 품종에 따라 특정 염기가 삽입 또는 결실, 또는 단일염기다형성이 존재하는 확률이 높은 것에 근거한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 고추의 흰가루병 저항성 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 흰가루병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 흰가루병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
부모 개체는 삼성종묘로부터 분양받아 각각 흰가루병 저항성 계통 캡시쿰 안늄(Capsicum annuum) 'VK515 R'과 이병성 계통 캡시쿰 안늄(C. annuum) 'VK515 S'를 사용하였다. 저항성 시판 품종은 농우바이오로부터 분양받은 캡시쿰 안늄(C. annuum) 'PM 신강'과 흥농 종묘로부터 분양받은 이병성 시판 품종 캡시쿰 안늄(C. annuum) '부강'은 대조군으로 사용하였다. 부모 'VK515 R' x 'VK515 S' 교배조합을 통해 'VK515'F2:3 집단을 구축하여 PMR1의 유전자 지도를 작성하는데 사용하였다. 이는 'VK515'F1을 자가교배하여 2012년 F2 종자를 수확한 후 F2 식물체는 선발 없이 종자를 수확하여 2015년 각각 F2:3 집단을 구축하는 과정을 거쳤다. 총 102개의 F2:3 집단은 병 저항성을 평가하고 유전자 지도를 작성하는데 사용하였다.
2. 병 저항성 평가
F2:3 집단은 파종 후 60일 후에 흰가루병 저항성을 평가하는데 사용하였다. 'VK515 R'과 'PM 신강'은 저항성 대조군으로 사용하였고, 'VK515 S'와 '부강'은 이병성 대조군으로 사용하였다. 흰포자형성의 유무를 관찰하는 것으로 병 저항성을 판별하였다.
3. 게노믹 DNA 추출
식물체의 게노믹(genomic) DNA는 어린 잎으로부터 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 추출하였다(Doyle and Doyle 1987, Phytochem Bull 19:11-15). 추출한 게노믹 DNA는 Nanodrop 2000 분광광도계(Thermo scientific, 미국)를 이용하여 정량하였다.
4. 염색체 지역화
기존 고추 염색체 유전자 지도 작성에 사용된 SNP 분자표지(Kang et al. 2014, Kor J Hortic Sci Technol 32:535-543)를 사용하여 PMR1의 염색체 지역을 확인하였다. 상기 발표된 분자표지 중에 'VK515 R'과 'VK515 S'에서 뚜렷하게 다형성을 나타내는 총 96개의 SNP 분자표지가 사용되었다. PMR1의 지역화를 위하여 102개의 F2 집단에서 92개체의 식물체가 SNP 유전형 분석에 사용되었고 유전형 분석은 제조사의 매뉴얼에 따라 Fluidigm® EP1TM system(Fluidigm corporation, 미국)을 활용하여 수행되었다.
5. 분자표지 개발
앞선 PMR1의 염색체 지역화를 통하여 분자표지 KS16052G01이 PMR1과 연관되어있는 것을 확인하였고, 추가적인 마커 개발을 위해 이 분자표지 KS126052G01의 3cM 주변으로 캡시쿰의 유전적 정보를 사용하여 PCR 프라이머를 디자인하였다. 부모간 다형성을 찾기 위해 PCR 산물을 용출하고 서울대학교 농생명과학공동기기원(NICEM)에서 서열분석을 실시하였다. PCR 밴드간 다형성의 경우 SCAR(sequence-characterized amplified region) 분자표지를 개발하는데 사용하였고, SNP(single nucleotide polymorphism) 마커는 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence) 또는 HRM(high-resolution melt) 분자표지를 개발하는데 사용하였다. CAPS 분자표지는 CAPS Designer(https://solgenomics.net/tools/caps_desinger/caps_input.pl) 프로그램을 사용하여 제작하였고 HRM 마커는 박 등(2009, Hortic Environ Biotech 50:31-39)의 방법을 사용하여 제작하였다.
6. 유전형 분석 및 유전자 지도 작성
92개의 F2 집단과 102개의 F2:3 집단은 PMR1 유전자 지도 작성에 사용되었다. 유전형 분석을 위해 SCAR 분자표지(ZL1_1826)의 PCR은 25㎕의 부피로; 2.5㎕ 10×buffer, 2㎕ 10mM dNTPs, 10μM 농도의 정방향 및 역방향 프라이머 각 1㎕, 15.2㎕ 증류수, 0.3㎕ Taq DNA 중합효소, 20ng/㎕ 게노믹 DNA 3㎕의 조성으로 수행하였다. PCR 조건은 초기 변성 95℃ 5분, 35 사이클로 95℃ 30초 변성, 56℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 확장 후에 마지막 확장(extension) 과정으로 72℃ 10분을 수행하였다. CAPS 분자표지(CZ2_11628)의 PCR은 앞서 언급된 PCR 반응 조성과 동일한 구성으로 수행하되, PCR 조건에서 35 사이클의 마지막 단계가 72℃ 30초로 조정하여 수행하였고, 증폭된 PCR 산물은 제한효소 TaqαI(New England Biolabs, 미국)를 제조사의 매뉴얼의 방법에 따라 처리하여 절단하였다. 효소 처리된 PCR 산물은 전기영동하여 UV transilluminator로 관찰하였다.
HRM 분자표지(HRM4.1.6 및 HRM2_A4)는 Light Scanner® (Idaho Technology Inc., 미국)를 통해 분석하였다. 반응물은 20㎕의 부피로 60mM 염화칼륨(KCl), 10mM Tris-Cl, 2.5mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.25mM dNTP, 정방향 및 역방향 프라이머 각 5pmol, 1 유닛 Taq 중합효소, 1.25μM Syto9, 50ng 게노믹 DNA의 조성으로 수행하였다. PCR 조건은 최초 변성 95℃ 5분, 35 사이클로 95℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초 후에 마지막 확장 과정으로 72℃ 10분을 수행하였고, HRM은 0.1℃씩 1초 간격으로 증가하여 70℃에서 90℃까지의 온도 구간에서 수행하였다.
연관분석은 CarthaGene 소프트웨어(Schiex and Gaspain, 1997, Proc 5th Intl Conf on ISMB)를 통해 수행하였다. 연관그룹을 5.0 값의 LOD 역치(threshold)와 최대 거리를 30cM으로 하여 분자표지의 'L_Zunla-1'상의 물리적 거리를 고려하여 형성하였다. 분자표지간 유전적 거리는 Kosambi 거리를 기반으로 cM으로 나타내었고 MapChart 2.3 소프트웨어를 사용하여 유전자 지도를 작성하였다.
7. PMR1 지역의 InDel 분자표지 서열분석
위치 특이적 InDel 분자표지를 분석하기 위해 캡시쿰 안늄(C. annuum) 'VK515' 부모의 서열, 캡시쿰 안늄(C. annuum) 'L_Zunla-1', 캡시쿰 치넨세(C. chinense) 'PI159236' 버전 1.2, 그리고 캡시쿰 박카툼(C. baccatum) 'PBC81' 버전 1.2를 MAFFT 다중 서열 정렬 프로그램(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/)을 사용하여 배열하였다. 배열된 서열은 Jalview tool(Waterhouse et al. 2009, Bioinformatics 25:1189-1191)을 활용하여 도식화하였다.
8. Genotyping-by-sequencing(GBS)
8-1. 라이브러리 준비
GBS는 12개의 'VK515'F2개체(11개체는 호모한 유전형, 1개체는 헤테로한 유전형을 갖는 식물체)를 사용하여 'VK515 R'과 'VK515 S' 부모를 2반복씩 함께하여 분석을 실시하였다. 400ng의 게노믹 DNA가 사용되어 Illumina 서열분석에 사용되었고, Truong 등(2012, PLoS ONE 7:e37565)의 방법을 따라 GBS 라이브러리를 준비하였다. 부모와 12개의 F2개체의 게노믹 DNA는 제한효소 PstI과 MseI에 의해 자르고, MseI 어댑터(adapter)와 PstI 어댑터를 각각의 샘플에 다른 바코드를 부여하여 잘린 조각에 붙였다. 증폭 이후의 라이브러리 정량은 Bioanalyzer DNA 1000 칩(Agilent Technologies, 미국)으로 수행하였다. 같은 양의 어댑터가 부착된 각각의 샘플은 한데 모아 서열분석을 실시하였다.
8-2. 서열분석 및 SNP 동정
서열분석은 HiSeq 2000(Illumina, 미국)으로 마크로젠에서 수행하였다. 가공되지 않은 리드(raw read)들은 각각의 어댑터로 역다중화하였고, 어댑터와 바코드 서열은 CLC genemics workbench 소프트웨어(버전 8.0)를 사용하여 제거하였다. 처리된 리드들은 Burrows-Wheeler Aliger(BWA, 버전0.7.12)를 사용하여 캡시쿰 안늄(C. annuum) 'L_Zunla-1' 버전 2.0에 대응하게 정렬하였다. 리드 그룹화와 정렬은 Picard Tools(버전 1.1119)과 SAMtools(버전 1.1)를 사용하여 수행하였다. Genome-wide SNP calling을 위해 GATK(Genome Anaysis Toolkit) UnifiedGenotyper(버전 3.3)를 사용하였고, 30 QUAL 값보다 크고 최소 3 이상의 depth를 기준으로 고품질의 SNP를 다름 분석을 위해 선발하였다.
9. PMR1 지역의 GBS로부터 동정된 SNP 분자표지의 비교 분석
캡시쿰 안늄(C. annuum) 'L_Zunla-1', 캡시쿰 치넨세(C. chinense) 및 캡시쿰 박카툼(C. baccatum)의 유전체에서 PMR1 지역에 해당하는 각각의 서열은 'VK515' 유전체로부터 얻은 GBS-SNP와 함께 정렬하였다.
10. 계통발생 분석(Phylogenetic analysis)
계통수 분석은 DARwim 6.0.9를 사용하여 분석하였다.
실시예 1. 흰가루병 저항성의 유전분석
'VK515'F2:3 집단과 대조군에 레베일루라 타우리카(Leveillula taurica)를 접종하여 파종 후 60일 후에 병 저항성을 평가하였다. 흰가루병 저항성 'PM 신강'과 'VK515 R'은 병징이 나타나지 않았고, 흰포자 형성도 관찰되지 않았다. 이와 마찬가지로 'VK515'F1 식물체 또한 같은 증상이 나타났다. 반면 '부강'과 'VK515 S'에서는 흰색 포자가 잎의 아랫면에 형성된 것이 관찰되었다(도 1). 102개의 'VK515'F2:3 집단 중에서 24 집단(총 451개체)에서는 호모한 저항성이, 48 집단(총 898개체)에서는 분리양상이, 그리고 30 집단(총 582개체)에서는 호모한 이병성이 확인되었다. 그리고 이 비율은 1:2:1의 비율(χ2 = 1.06; P = 0.59)에 맞아 떨어져 'VK515 R'의 흰가루병 저항성이 하나의 우성유전자로 유전된다는 것을 알 수 있었다(표 1).
'VK515' 집단의 흰가루병 저항성 분리 양상
계통 및 집단 집단의 수 표현형 예상 분리비 χ2 P
저항성 헤테로 이병성
VK515 R 20 20
VK515 S 20 20
VK515 F1 20 20
VK515 F2:3 집단 102 (1931) 24 (451) 48 (898) 30 (582) 1:2:1 1.06 0.59
*괄호 안 숫자는 F2:3 'VK515'의 식물체 숫자를 의미
실시예 2. 분자표지 개발 및 PMR1 의 유전자 지도 작성
PMR1의 염색체 위치를 먼저 확인하기 위하여, 기존에 발표된 96개의 분자표지(Kang et al. 2014)를 사용하여 'VK515'F2 집단에 유전형 분석을 실시한 결과, 염색체 4번을 이루는 7개의 분자표지(KS21061G15, CAPS_CONTIG.12621, CAPS_CONTIG.6527, CAPS_CONTIG.7592, CAPS_CONTIG.8288, CAPS_CONTIG.4984, 및 CAPS_CONTIG.9996)가 PMR1에 연관군을 형성하였다(도 2b). 가장 가까운 분자표지는 KS16052G01와 CAPS_CONTING.12621로 각각 0cM과 24.8cM으로 거리를 두는 것으로 나타났다.
추가적인 분자표지는 캡시쿰의 유전체 정보를 활용하여 제작하였다. 서열분석을 통한 SNP 탐색을 위하여, 14쌍의 프라이머를 염색체 4번상의 PMR1 지역의 'CM334' 유전체 서열을 활용하여 제작하였다. 서열분석 결과 7개의 SNP를 3쌍의 HRM 분자표지로 전환하였다. 이 HRM 분자표지중 HRM2_A4와 HRM4.1.6은 다형성을 나타내고 표현형 정보와 동시 분리(co-segregation)되었다. 또한 26쌍의 PCR 프라이머를 염색체 4번상의 'L_Zunla-1' 유전체 서열 정보를 활용하여 제작하였다. 그 결과 두개의 SCAR 분자표지, ZL_1826과 ZL_10691, 그리고 하나의 CAPS 분자표지 CZ2_11628을 개발하였다(도 5).
총 6개의 다형성을 띄는 분자표지(ZL1_10691, CZ2_11628, ZL1_1826, KS16052G01, HRM2_A4, 및 HRM4.1.6)를 102개의 'VK515'F2:3 집단에 적용하여 유전자 지도를 작성하는데 사용하였다(표 2 및 도 3). 102개의 F2:3 집단의 유전형 분석을 기반으로 ZL1_10691은 3개의 재조합형, CZ2_11628과 HRM4.1.6 분자표지는 각각 하나의 재조합형을 나타냈다(도 3b). 그 결과 PMR1의 유전지역은 CZ2_11628과 HRM4.1.6 분자표지에 의해 염색체 4번상에서 1cM구간으로 한정되었다(도 3b). 이 1cM 구간은 'L_Zunla-1' 염색체 4번의 아래쪽에 약 4Mb 길이로 물리적 거리를 나타냈다. 최종적으로 6개의 분자표지에서 ZL1_1826, KS16052G01, HRM2_A4는 흰가루병 저항성 표현형 결과와 동시 분리(co-segregation)되어 PMR1과 0cM의 유전적 거리를 나타냈다(도 3).
PMR1 저항성 유전자 연관 분자표지
분자표지 유형 프라이머 서열정보(5'→3') (서열번호) 증폭산물(bp)
ZL1_10691 SCAR F: TCCTGTTTTCTCCCCCTTTT (1) 1160
R: CTTTGGCAATATCCCGTTCA (2)
ZL1_1826 SCAR F: CGAAGTCATTAAAGTTCATTGGG (3) 1259
1070
R: GCAATAAATGCCCTTCCACA (4)
CZ2_11628 CAPS F: GCTAGGATCCTGCTCGTGAGA (5) 166, 174
340
R: GTTGCTCTTGCTTCTGCTGC (6)
HRM4.1.6 SNP F: AATTAAAGGACTTAAGTTTGACAGTT (7) 203
R: GAAATTGTCGATGAACATCCGT (8)
HRM2_A4 SNP F: TTCAGCCAGTGATCTGGAGC (9) 169
R: TCAAATTCCTTGCACAAATCAT (10)
HPGV_1313 SNP F: GGGTTTTCACTCCTCTTTTGC (11) 187
R: TCCACCATGAAGGTGTAACG (12)
HPGV_1344 SNP F: AAAAGGCAAGAGCATTACATGA (13) 196
R: TTGTTGTTGTCGTTGTTGTTGA (14)
HPGV_1412 SNP F: TCTCGGAGGGAAAACTGAAA (15) 178
R: AAGCATAAGGGCATGTTTGG (16)
실시예 3. PMR1 의 기원 탐색
PMR1의 기원을 찾기 위해 연관된 분자표지의 서열분석을 실시하였다. 'VK515 R'과 'VK515 S'의 부모로부터 ZL1_1826과 HRM4.1.6 분자표지의 서열을 확인하여 각각의 유전체(캡시쿰 안늄(C. annuum) 'L_Zunla-1', 캡시쿰 치넨세(C. chinense) 및 캡시쿰 박카툼(C. baccatum))에 대응하도록 정렬하였다(도 4).
ZL1_1826의 서열 정렬 결과 236bp의 InDel이 'L_Zunla-1'와 'VK515 S'에 특이적으로 나타났으며, 34bp의 InDel은 'VK515 R'과 캡시쿰 박카툼 유전체에서, 그리고 20bp의 InDel은 캡시쿰 치넨세를 제외한 유전체 모두에서 나타났으며, 6bp와 7bp의 InDel은 캡시쿰 치넨세, 캡시쿰 박카툼 및 'VK515 R' 유전체 특이적으로 나타났다(도 4a). HRM4.1.6(Chr4.1.6) 분자표지는 141bp의 InDel을 캡시쿰 치넨세, 캡시쿰 박카툼 및 'VK515 R' 유전체 특이적으로 나타냈으며, 33bp의 InDel은 'VK515 S'와 'L_Zunla-1' 유전체 특이적으로 나타났다(도 4a). 따라서 ZL1_1826과 HRM4.1.6(Chr4.1.6) 분자표지 서열은 종 특이적으로 InDel이 나타났고 상기 서열분석 결과 PMR1 지역의 서열이 'VK515 R'의 경우에는 캡시쿰 치넨세(C. chinense)와 캡시쿰 박카툼(C. baccatum)과 긴밀히 연관되어 있는 것을, 'VK515 S'의 경우에는 캡시쿰 안늄(C. annuum)과 연관되어 있는 것으로 보아 'VK515 R'의 PMR1은 캡시쿰 치넨세 또는 캡시쿰 박카툼의 염색체 이입의 결과로 추정할 수 있었다(도 4a).
PMR1의 기원을 찾기 위한 추가적 실험과 4Mb 구간의 물리적 거리로 나타나는 재조합 억제 현상을 확인하기 위하여, GBS 실험 결과를 캡시쿰 안늄 'L_Zunla-1', 캡시쿰 치넨세 및 캡시쿰 박카툼의 유전체에 각각 정렬하여 분석하였다. 'VK515' 부모간에 79개의 SNP를 염색체 4번상에서 탐색하였다. 이중 22개의 SNP(표 3)는 PMR1 지역에서 발견하였고 이중 9개의 SNP는 3쌍의 HRM 분자표지로 전환하였다. HPGV_1313(SNP4, SNP5 및 SNP6), HPGV_1344(SNP7), HPGV_1412(SNP8, SNP9, SNP10, SNP11 및 SNP12)의 세 HRM 분자표지는 유전형 분석에 사용하였다.
유전형 분석 결과, 재조합형은 하나도 나타나지 않았다. 이를 통해 PMR1 지역이 재조합이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 22개의 SNP는 계통발생 분석을 통해 PMR1 지역에서 'VK515 S', 캡시쿰 안늄(C. annuum), 캡시쿰 치넨세(C. chinense)가 그룹을 형성하고(도 4b), 반면에 'VK515 R' 및 캡시쿰 박카툼(C. baccatum)이 그룹을 형성하는 것을 확인하였다. 이 결과는 InDel 특이적 분자표지의 결과와 유사하였고 최종적으로 PMR1은 캡시쿰 박카툼 종에서 유래된 것으로 추측되었다.
PMR1 지역의 Genotyping-by-sequencing(GBS)에 따른 SNP 동정 결과
SNP 마커 위치*(bp) C. chinense C. annuum VK515 S C. baccatum VK515 R
SNP1 208,150,769 G A A G G
SNP2 208,150,786 G G G G A
SNP3 208,150,812 G G G A A
SNP4 213,138,206 A A A G G
SNP5 213,138,261 G G G A A
SNP6 213,138,271 C C C T T
SNP7 213,443,584 G T G T T
SNP8 214,126,005 C C C T T
SNP9 214,126,011 G G G A A
SNP10 214,126,045 G G G A A
SNP11 214,126,057 G G G T T
SNP12 214,126,060 C C C A A
SNP13 215,383,249 T T T A A
SNP14 215,383,263 T T C T T
SNP15 215,383,781 C C C T T
SNP16 215,383,782 A A A G G
SNP17 215,383,790 A A A G G
SNP18 215,383,795 T T T C C
SNP19 215,383,827 T T T C C
SNP20 215,383,830 G G G A A
SNP21 215,383,850 G G C G G
SNP22 215,580,751 G G A G G
* 위치는 염색체 4번상의 위치를 의미함.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Molecular marker for discrimination of powdery mildew-resistant pepper cultivar and uses thereof <130> PN16387 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcctgttttc tccccctttt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctttggcaat atcccgttca 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgaagtcatt aaagttcatt ggg 23 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcaataaatg cccttccaca 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gctaggatcc tgctcgtgag a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gttgctcttg cttctgctgc 20 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aattaaagga cttaagtttg acagtt 26 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaaattgtcg atgaacatcc gt 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttcagccagt gatctggagc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcaaattcct tgcacaaatc at 22 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gggttttcac tcctcttttg c 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tccaccatga aggtgtaacg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 aaaaggcaag agcattacat ga 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ttgttgttgt cgttgttgtt ga 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tctcggaggg aaaactgaaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 aagcataagg gcatgtttgg 20

Claims (7)

  1. 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 및 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 흰가루병 저항성 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추의 흰가루병 저항성 품종 선별을 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충액을 포함하는 것인 키트.
  5. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 흰가루병 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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Title
NCBI Reference Sequence: NC_029980.1 (2016.05.06.)
V. Lefebvre et al., Theor Appl Genet(2003), vol. 107. pp.661-666
조진관 등. 한국육종학회 심포지엄 2016 한국육종학회-차세대BG21사업단-GSP사업단 공동심포지엄 PC-105 (p.265-265).

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