KR101354041B1 - ＰｅｐＭｏＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트 - Google Patents

ＰｅｐＭｏＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 6로 표시된 3개 쌍의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종에서 고추얼룩바이러스(Pepper Mottle Virus; PepMoV)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추 품종에서 고추얼룩바이러스에 대해 고추 저항성 여부를 판별하기 위한 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종에서 고추얼룩바이러스에 대해 고추 저항성 여부를 판별하기 위한 키트를 제공한다.

Description

ＰｅｐＭｏＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트{Primer set, method and kit for selecting PepMoV-resistant pepper cultivar}
본 발명은 고추 품종의 PepMoV에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1 내지 6으로 표시된 3개 쌍의 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종에서 고추얼룩바이러스(Pepper Mottle Virus; PepMoV)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추 품종에서 고추얼룩바이러스에 대해 고추 저항성 여부를 판별하기 위한 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종에서 고추얼룩바이러스에 대해 고추 저항성 여부를 판별하기 위한 키트에 관한 것이다.
고추얼룩바이러스(Pepper Mottle Virus; PepMoV)는 포티바이러스(Potyvirus)에 속하며, 단일가닥 리보핵산으로 이루어진 바이러스이다. 지금까지 고추에서 분리 보고된 포티바이러스는 고추얼룩바이러스 이외에도 감자 바이러스 와이(Potato virus Y; PVY), 담배 에치바이러스(Tobacco etch virus; TEM) 또는 고추잎맥모틀바이러스(Pepper veinal mottle virus; PVMV) 등 많은 바이러스가 보고되고 있다. 현재 우리나라에서 재배되는 고추에는 고추얼룩바이러스가 주로 분포하며, 감염된 고추는 잎과 과실에 병징 발생 및 과실 양의 감소를 유발, 작물 재배에 있어 경제적 손실을 야기한다.
고추얼룩바이러스는 각종 진딧물에 의해서 비영속적으로 전염되거나, 즙액 접종에 의해 고추 및 담배를 포함한 가지과 식물에 전염된다. 고추얼룩바이러스 방제를 위해서는 진딧물 방제, 토양의 소독, 농기구와 종자의 철저한 관리가 필요하다. 그러나 방제방법이 간접적이고, 많은 노력이 필요하기 때문에 고추얼룩바이러스에 저항성을 가진 품종을 육성하는 것이 보다 효율적이고 경제적인 방제 방법이 될 것이다.
고추에서 발견된 포티바이러스에 대한 저항성은 Pvr 유전자에 의해 유전되는 것으로 보이며, 지금까지 7개의 중요한 저항성 유전자와 몇 개의 QTL이 보고되었다. 분자 표지를 이용해 지도를 작성한 결과 염색체 3번과 10번에 각각 저항성 유전자 클러스터가 존재한다는 것이 알려졌으며, 염색체 3번에는 pvr1, pvr2, pvr5 및 QTL 주동유전자가 위치하고 있고, 염색체 10번에는 두 개의 우성유전자인 Pvr4 및 Pvr7이 위치하고 있다. 그러나 이들 분자표지는 포티바이러스 저항성 표현형과 다소 거리를 두고 위치하고 있다. 한편, 고추 CM334(Capsicum annuum cv.CM334) 품종의 Pvr4 유전자는 현재까지 알려진 모든 PVR 병원형 뿐만 아니라 국내에서 발생하고 있는 고추얼룩바이러스에 대해서도 완전한 저항성을 보이는 것으로, 본 발명은 고추얼룩바이러스 저항성 유전자인 Pvr4와 가깝게 연관된 분자표지를 개발한 내용을 제공한다.
고추에서 발견된 포티바이러스 저항성 유전자와 각 유전자와 연관된 토마토 RFLP 분자표지
유전자 스펙트럼 연계된 분자표지 염색체 위치
pvr1 TEV , PepMoV TG56 , TG135 3
pvr2 PVY , TEV CT31 , TG132 3
pvr3 PepMoV nd nd
Pvr4 PVY , PepMoV CD72 , CT124 10
pvr5 PVY CT31 3
pvr6 PVMV TG57 9
Pvr7 PepMoV , PVY CD72 , CT124 10
한편, 한국공개특허 제2011-0129358호에는 ＰＭＭｏＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1010446호에서는 고추 탄저병 균주에 대한 저항성주동유전자 연관 분자표지 개발 및 이의 이용이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 고추 품종의 PepMoV에 대한 저항성 여부를 판별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 현재까지 알려진 모든 PVR 병원형 뿐만 아니라 국내에서 발생하고 있는 고추얼룩바이러스에 대해서도 완전한 저항성을 보이는 것으로 알려진 고추 품종 CM334의 Pvr4 유전자와 가깝게 연관된 새로운 분자표지 3종을 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종의 고추얼룩바이러스에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추 품종의 고추얼룩바이러스에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종의 고추얼룩바이러스에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 분자표지를 많은 고추 작물들에 적용하면 고추얼룩바이러스에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 선별 및 육성할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 분자표지 및 본 발명에서 제공하는 고추 품종 선별 방법은 세균이나 곰팡이와는 다르게 약제에 의한 방제가 거의 불가능한 바이러스의 피해를 막고자 고추얼룩바이러스 저항성 품종을 육성하기 위해 많은 노력을 해온 고추 육종업자들에게 매우 유용할 것이다.
도 1은 4개의 BAC 클론을 BAC 핑거프린팅(fingerprinting)하여, 그 결과를 FPC 프로그램에 적용하여 4개의 BAC 클론이 하나의 콘티그(contig)된 그림을 나타낸다.
도 2는 CM334 × P9 집단에서 TG420B1 프라이머로 증폭한 PCR 산물을 EcoRI으로 절단한 분자표지를 이용하여 유전자형을 결정하는 그림을 나타낸다.
도 3은 CM334 × P9 집단에서 108 프라이머로 증폭한 PCR 산물의 SCAR 분자표지를 이용하여 유전자형을 결정하는 그림을 나타낸다.
도 4는 CM334 × P9 집단에서 146-h5 프라이머로 증폭한 PCR 산물을 Bgl II로 절단한 분자표지를 이용하여 유전자형을 결정하는 그림을 나타낸다.
도 5는 Carthagene-1.2.2의 mapping 프로그램으로 표 3의 32개체에 대한 검정결과 저항성과 이병성을 나타내는 개체의 표현형과 146-h5 분자표지가 2.9cM으로 거리를 나타냄으로써 이 분자표지가 비교적 정확하게 이병성과 저항성을 구분하는 것을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 5의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 프라이머 세트는 고추얼룩바이러스에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 마커로 이용된다. 상기 마커를 개발하기 위해, 먼저 고추 CM334 품종을 이용, HpmsE031과 TG420을 탐침자로 6개의 BAC 클론을 선발하였다. 이 BAC 클론의 염기서열을 바탕으로 저항성 고추 품종 CM334와 이병성 고추 품종 P9의 염기서열을 비교하여 다형성이 있는 염기서열을 탐색하였다. 최종적으로 이러한 다형성 염기서열을 이용하여 프라이머를 디자인하고 이를 고추얼룩바이러스 저항성이 분리되는 집단에서 분석함으로써 고추얼룩바이러스 분자표지인 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 선발하였다.
보다 구체적으로는, 하나의 콘티그(Contig)를 구성하고 있는 TT1B7과 TG420B1 BAC 클론의 염기서열 분석 후 160Kb 염기서열을 바탕으로 평균 길이 1.5Kb에 해당하는 프라이머를 조합 제작하였고, 이후 프라이머 세트를 이용하여 고추 CM334 품종 및 고추 P9 품종으로부터 1개의 SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions) 분자 표지 및 2개의 CAPS(Cleaved amplification polymorphism sequence) 분자 표지를 개발하였다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 프라이머 세트에서, 상기 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 또는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 이병성(susceptible) 특이적 표지이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 바이러스에 감염된 고추 시료에서 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 페놀:클로로포름 추출에 후속한 에탄올 침전화 방법을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 DNA 폴리머라제를 첨가하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지 될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지 될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 증폭 산물의 검출 단계에서, SCAR 분자표지인 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트(108 분자표지)는 증폭 산물의 전기영동만에 의해 이병성 및 저항성 고추 품종을 구별할 수 있지만, CAPS 분자표지인 서열번호 1 및 2(TG402B1 분자표지), 및 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트(146-h5 분자표지)는 증폭 산물을 수득한 후에 수득된 증폭 산물을 적당한 제한효소(예를 들면, EcoRI, BglII 등)로 절단하여 절단 산물을 전기영동함으로써 이병성 및 저항성 고추 품종을 구별할 수 있다.
상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지 되며, 이렇게 표지 된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1) 고추의 HpmsE031 및 TG420 분자표지를 이용한 BAC 클론 선발
고추 CM334 품종의 잎 조직에서부터 만들어진 120,000개의 BAC 클론 중에 고추의 모용과 0cM에 위치하는 SSR 분자표지인 HpmsE031과 고추 유전자지도 염색체 10번에서 HpmsE031에 가장 가까이에 위치하는 RFLP(Restriction Fragment Length Polymerphism) 분자표지인 TG420를 탐침자(probe)로 6개의 BAC 클론을 선발했다. 6개의 BAC 클론에 대해 Amplicon Express(Pullmam)에 BAC 핑거프린팅(fingerprinting)을 의뢰하였다. BAC 핑거프린팅 결과로부터 FPC 프로그램을 이용해 tolerance setting이 3 cutoff가 1e-10일 때 4개의 BAC 클론이 하나의 콘티그(contig)로 연결되는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
2) BAC 콘티그 제작
BAC 클론의 양 끝 염기서열은 BAC 클론으로부터 플라스미드 정제 키트를 이용해 플라스미드를 추출한 뒤 유니버설 프라이머(Univarsal primer)인 SP6 및 T7으로 염기분석을 하도록 NICEM(서울대학교 농생명과학공동기기원)에 의뢰하였다. BAC 핑거프린팅의 결과를 토대로 FPC 프로그램을 이용해 만든 콘티그를 검증하기 위하여 각각의 BAC 클론 양 끝 염기서열로부터 만들어진 프라이머를 선발하여 6개의 BAC 클론에 중합효소연쇄반응을 했다. 중합효소연쇄반응 결과 FPC 프로그램을 이용해 만든 콘티그와 완전히 일치하였다.
3) 분자 표지 개발
하나의 콘티그를 구성하고 있는 TT1B7 및 TG420B1 BAC 클론을 플라스미드 정제 키트를 이용하여 플라스미드만 추출 후 NICEM에 의뢰하여 그 염기 서열을 분석하였다. 총 160Kb의 염기서열이 확보되었고 염기서열 안에서 처음에 BAC 클론을 선발할 때 탐침자로 사용했던 HpmsE031 및 TG420의 염기서열이 보존되어 있는 것을 확인하였다. 160Kb의 염기서열을 바탕으로 평균 길이 1.5Kb에 해당하는 프라이머 132개의 조합을 제작했고, 이를 포티바이러스 이병성 개체인 P9에 적용하여 BAC 클론 TT1B9과 TG420B1이 커버하고 있는 염기서열 160Kb를 증폭하고, P9에서 이 부분에 대한 염기서열분석을 했다. 염기서열 분석한 자료에서 130개의 프라이머를 제작하여 고추 CM334 품종과 고추 P9 품종에 PCR한 결과 10개의 프라이머에서 다형성이 확인되었다. 이들 중 3개의 분자표지가 염색체 10번의 Pvr 저항성 표현형 표지와 가까이 위치하였다. 고추얼룩바이러스 저항성 고추와 이병성 고추에서 각각 1,500bp의 핵산이 PCR 되었고, 이를 BglII 제한효소를 처리하였을 때 저항성 개체만 제한효소에 의해서 잘렸다. 이 프라이머로 CAPS (Cleaved amplification polymorphism sequence) 분자표지를 개발하였다.
고추얼룩바이러스 저항성 유전자를 가진 식물체를 선발하기 위한 분자표지
프라이머명 염기서열(5' - 3') 비고
1 TG420B1F TGCTGTTTAGGCTCTCCAATTAAG(서열번호 1) 이병성 특이적 표지
2 TG420B1R CAACATGTGTGTGTCGAATTCTC(서열번호 2)
3 108F AATCACCACACCAACTCTTATG(서열번호 3) 이병성 특이적 표지
4 108R CATGTTTGGTACAAGAGATAGA(서열번호 4)
5 146-h5F TCGATGCGCAGAATTATATTGACTC(서열번호 5) 이병성 특이적 표지
6 146-h5R GGGATTTGTTTCCCATTTGATGTT(서열번호 6)
4) 고추얼룩바이러스 저항성 분리 집단의 육성
고추 CM334 품종의 Pvr4 유전자는 현재까지 알려진 모든 PVY 병원형 뿐만 아니라 국내에서 발생하고 있는 고추얼룩바이러스에 대해서도 완전한 저항성을 보인다고 한다. 이와는 반대로 고추 P9 품종은 고추얼룩바이러스에 대해 완전한 이병성을 보인다. 병 저항성 품종인 CM334와 이병성 품종인 P9의 F1개체를 육성하고, F2분리 집단을 육성했다. 부계, 모계 및 F1과 F2는 DNA분석에 활용 및 바이러스 저항성 분석에 활용했다. 또한, 더욱 정확한 분석을 위해 900개의 F2개체를 유지하고 게놈DNA를 분리하여 개발된 병저항성 PCR 분자표지와 저항성 표현형과의 분리 양상을 비교 분석했다.
5) F 2 집단의 표현형의 결정
F2 집단의 표현형은 고추얼룩바이러스 snu1을 접종하여 확인하였다. 고추얼룩바이러스 snu1을 접종한 Nicotiana xanti nc을 접종원으로 사용하였다. 접종원을 액체 질소로 얼린 다음 막자 사발로 곱게 마쇄하였다. 접종원 1g 당 5ml의 인산 완충액(0.615M K2HPO4, 0.385M KH2PO4, pH7.0)을 넣고 잘 섞은 뒤, 그 상층액을 접종용 완충액으로 사용하였다. 식물체에 접종할 때에는 식물의 본엽이 2~4장이 되는 때에 접종하였다. 접종할 때에는 제1,2 본엽에 연마제(Carborandum, 300 메쉬)를 뿌리고, 손가락으로 접종용 완충액을 접종부위에 부드럽게 문질러 접종하였다. 접종 14일 후부터 표현형 결정이 가능하며, 잎에 반점이 나타나는 식물체를 이병성으로, 나타나지 않는 식물체를 저항성으로 분류하였다.
6) F 2 집단의 핵산 추출
식물체의 2~3cm 길이의 어린 잎을 2장 떼어 1.7ml의 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 식물체가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 4mm의 알루미늄 비드를 2개 넣고 Tissuelyser(Retsch, QIAGEN)을 이용하여 방향을 바꿔주며 3분간 분쇄한 다음, 60℃의 CTAB 핵산 추출 완충액(2% CTAB, 20mM EDTA, 100mM Tris-Cl pH 8.0, 1.4M NaCl)을 600㎕ 넣었다. 다시 PVP(Polyvinylpyrrolidone)를 0.5g, β-머캅토에탄올을 12.5㎕ 넣어 위 아래로 잘 섞은 다음 65℃의 항온 수조에서 1~2시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 잠시 식힌 후, 클로로포름:이소아밀알코올(24:1) 용액을 700㎕ 넣었다. 4℃에서 12,000rpm으로 15분 동안 원심분리하고, 상층액만을 새로운 마이크로원심분리 튜브에 취하였다. 상층액의 2배 부피의 4℃, 99% 에탄올이나 상층액과 동량의 이소프로판올을 넣고, -20℃에서 1~2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 4℃, 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 70%의 에탄올을 800㎕ 넣어, 4℃, 12,000rpm으로 10분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 버렸다. 한번 더 70% 에탄올로 핵산 침전물을 씻어 준 다음 공기 중에서 5시간 건조시켰다. 건조가 끝나면 50㎕의 TE 완충액(1mM EDTA, 10mM Tris-Cl)과 RNase(10㎕/ml)을 넣어 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 핵산은 분광광도계(ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc)로 정량하였다.
7) CAPS 분자표지를 이용한 유전자형 결정
유전자형 검사는 PCR 장비로 수행하였다. PCR 반응액은 1X PCR 완충액(500mM KCl, 100mM Tris-Cl pH 8.3, 15mM의 MgCl2), 프라이머 0.25pM, 주형 핵산 20ng, dNTPs 0.25mM, 핵산중합효소 0.5U으로 구성하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 4분 동안 가열한 다음 34 사이클(95℃ 30초, 60℃ 1분 30초, 72℃ 1분 30초)을 반복한 뒤, 70℃에서 10분 반응하고 4℃에서 보관하였다. TG420B1 분자표지는 5㎕ PCR 반응 산물에 제한효소 EcoRI 1㎕을 첨가한 뒤 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 1.5% 아가로스 겔에 제한효소 처리한 핵산 산물을 로딩한 후, 전기영동하여 밴드를 확인하였다(도 2). 고추 CM334 품종과 유사한 식물체를 고추얼룩바이러스 저항성을 가지는 동형접합체(R)로, 고추 P9 품종과 유사한 식물체를 고추얼룩바이러스 이병성의 동형접합체(S)로 분류하였다. 두 지표식물과 다른 형태의 양상을 보이는 식물체는 R와 S를 모두 갖는 이형접합체(H)로 분류하였다. TG420B1 분자표지는 500bp에 강한 밴드가 있는 것을 저항성(R)으로, 500bp와 400bp에 두 개의 밴드가 있는 것을 이병성(S)으로 표시하여 구별하였다. TG420B1은 우성(dominant) 분자표지로 이형접합체를 구별하지 못하였다(도 2).
146-h5 분자표지는 상기의 PCR 반응액과 동일하게 사용하였으며 PCR 반응은 95℃에서 3분 동안 가열한 다음 40 사이클(95℃ 30초, 59℃ 30초, 72℃ 1분 30초)을 반복한 뒤, 70℃에서 10분 반응하고 4℃에서 보관하였다. 146-h5 분자표지는 5㎕ PCR 산물에 제한효소 BglII 1㎕를 첨가하였고, 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 2% 아가로스 겔에 제한효소 처리한 핵산 산물을 10㎕ 로딩한 후, 전기영동하여 밴드를 확인하였다(도 4). 146-h5 분자표지는 900bp와 150bp의 밴드가 있는 것을 호모저항성(A)으로, 1050bp, 900bp 및 250bp의 밴드가 있는 것을 헤테로 저항성(H)으로, 1050bp의 강한 밴드만 있는 것을 이병성(B)으로 겔 사진상에 표시하여 구별하였다.
8) SCAR ( Sequence Characterized Amplified Regions )를 이용한 유전자형 결정
SCAR 분자표지 분석은 MyCycler Thermal Cycle(BIO-RAD, 미국) 장비로 수행하였다. PCR 반응액은 1X PCR 완충액(500mM KCl, 100mM Tris-Cl pH 8.3, 15mM의 MgCl2), 프라이머 0.25pM, 주형 핵산 20ng, dNTPs 0.25mM, 핵산중합효소 0.5U으로 구성하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 4분 동안 가열한 다음 34 사이클(95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분)을 반복한 뒤 72℃에서 10분 동안 가열한 뒤 반응을 종료하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 PCR 반응으로 증폭한 핵산 산물을 로딩한 후, 전기영동하여 밴드를 확인하였다(도 3). 108 분자표지는 1500bp의 강한 밴드를 보이는 것을 호모저항성(A), 1250bp의 강한 밴드를 보이는 것을 호모이병성(B)으로, 1500bp와 1250bp에서 모두 강한 밴드를 보이는 식물체는 R 및 S를 모두 갖는 이형접합체(H)로 분류하였다.
실시예 1. CM334 × P9 고추 집단에서 분자표지와 고추얼룩바이러스 저항성 표현형의 분리 검정
고추얼룩바이러스에 저항성인 품종인 CM334와 이병성인 품종인 P9을 교배하여 얻은 F2 집단 100개의 식물체에 고추얼룩바이러스를 접종하여 표현형을 조사하고, 핵산을 추출하여 2개의 CAPS 분자표지와 1개의 SCAR 분자표지로 유전자형을 분석하였다. 100개의 F2 집단에서 3 종류의 분자표지 모두에서 공동 분리되는 것을 확인하였다. 도 6은 Carthagene-1.2.2 의 mapping 프로그램으로 하기 표 3의 32개체에 대한 검정결과 저항성과 이병성을 나타내는 개체의 표현형과 146-h5 분자표지가 2.9cM으로 거리를 나타냄으로써 이 분자표지가 비교적 정확하게 이병성과 저항성을 구분하는 것을 나타낸다. 또한, 108 분자표지는 2.9cM 떨어진 것으로 나타났으며 비교적 가까운 마커로 이병성을 분리 가능함을 확인할 수 있었으며, TG420B1 분자표지는 이병성을 구별하는 마커로 사용은 가능하나 Linkage group을 형성하지 못함으로 미루어 정확한 검정은 어려움을 확인하였다.
표현형과 분자표지의 공분리 검정
품종 표현형 TG420B1 146-h5 108
CM334 R R A or H A or H
P9 S S B B
F2-1 S S B B
F2-2 R R A A
F2-3 S S B B
F2-4 R R A A
F2-5 S S B B
F2-6 S S B B
F2-7 R S H H
F2-8 R S H H
F2-9 R S - H
F2-10 R S H H
F2-11 R R A A
F2-12 R S A H
F2-13 R S H H
F2-14 R R A A
F2-15 R S H H
F2-16 R R A A
F2-17 R S B H
F2-18 R S H H
F2-19 R R B A
F2-20 R S H H
F2-21 R R H A
F2-22 R S B H
F2-23 S S B B
F2-24 R R A A
F2-25 R S - H
F2-26 S S B B
F2-27 R R H H
F2-28 R S H H
F2-29 R S H H
F2-30 R R A B
F2-31 T S B B
F2-32 R S H H
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  3. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추 품종의 고추얼룩바이러스 (Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 품종의 고추얼룩바이러스(Pepper mottle virus)에 대해 저항성 여부를 판별하기 위한 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
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