KR101432280B1 - 캡시컴 안늄의 종내집단을 이용한 ssr 마커 및 유전자 연관지도 - Google Patents

캡시컴 안늄의 종내집단을 이용한 ssr 마커 및 유전자 연관지도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 식물의 종내 집단을 이용하여 개발된 캡시컴 안늄 유전자 연관지도 작성용 DNA 마커, 및 상기 DNA 마커를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하며, 상기 DNA 마커 및 프라이머 세트는 캡시컴 안늄의 고밀도 유전자 연관 지도의 작성에 이용되어, 분자육종에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

캡시컴 안늄의 종내집단을 이용한 SSR 마커 및 유전자 연관지도{SSR markers and Genetic linkage map using Intraspecific population of Capsicum annuum}
본 발명은 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 식물의 종내 집단(Intraspecific population)을 이용하여 개발된 캡시컴 안늄 유전자 연관지도 작성용 SSR 마커, 및 상기 SSR 분석을 실시하여 작성된 캡시컴 안늄의 유전자 연관 지도에 관한 것이다.
고추는 가지과(Solanacea)에 속하는 작물로 열대지방에서는 다년생, 온대지방에서는 1년생으로 자란다. 국내에서는 쌀 다음으로 주요한 농산물로서 국민 1인당 고추소비량이 세계에서 가장 높은 수준이다(농림부). 재배종으로 사용하는 고추는 5개 종(species)로 C. annuum, C. baccatum, C. chinense, C. frutescens, C. pubescens로 야생종까지 포함하면 현재까지 25종 이상이 보고되고 있으며 미주를 거쳐 유럽으로 전파된 후 아프리카와 남미를 비롯한 열대지방, 인도네시아, 태국 등의 아열대지방 및 우리나라와 중국 등의 온대 몬순지방에 이르기까지 광범위하게 재배되고 있다(Andrews, 1990).
최근의 고추 육종가들은 전통적 육종법과 분자육종법을 함께 수행함으로써 전통적 육종법의 효율을 극대화하고 있다. 고추의 유용형질은 한 개의 우성 혹은 열성 유전자에 의해 지배되는 질적형질과 수개의 유전자에 의해 지배되는 양적형질로 나뉜다. 현재까지 연구된 바에 의하면 고추의 질적형질은 매운맛, 과의 오렌지색과 적색, 세균성점무늬병 저항성, 감자바이러스 Y(Potato virus Y, PVY)와 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV) 저항성, 웅성불임 등이고 양적형질은 과의 모양이나 무게, 역병과 탄저병 저항성 및 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV) 저항성 등이 알려져 있다(Boukema, 1980; Carnata et al., 1996; John et al., 1988; Carnata et al., 2002; Huh et al., 2001; Lefebvre et al., 1995; Tai et al., 1999).
질적형질은 멘델의 독립유전법칙에 따라 후대에서 명료하게 분리되므로 양적형질에 비해 비교적 쉽게 육종에 이용할 수 있다. 그러나 양적형질의 경우 additive effect나 epistatic effect와 같은 유전자들의 상호작용과 형질발현에 관여하는 환경요인들 때문에 목적 형질을 갖는 품종을 쉽게 육성하기란 힘들다. 이러한 점에서 볼 때 유용유전자에 대한 표식을 육종가가 갖는다면 육종가는 우수한 품종을 효율적으로 육성할 수 있을 것이며, 이는 분자표지를 활용함으로써 가능해진다.
초기의 분자표지는 분석방법이 매우 까다로웠으나 현재에는 육종에 쉽게 활용할 수 있는 PCR법을 이용한 표지개발이 대부분이어서 고추육종에서 분자표지가 차지하는 비중이 커지고 있다.
이러한 요구에 따라, 본 발명자들은 특히, 고추 육종에 활용하기 더욱 적합하도록 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 종내 집단의 교배를 이용하여 SSR 마커 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 고밀도 유전자 연관지도를 개발하고, 종래의 SNU3 및 TMDH 지도와의 비교를 통해 검증함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 고추의 재배종인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 식물의 다양한 염기서열정보로부터 개발된, 캡시컴 안늄 유전자 연관지도 작성용 SSR마커 및 이의 증폭용 프라이머, 그리고 이들의 이용을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 캡시컴 안늄 종내 집단 및 상기 SSR마커를 이용하여 캡시컴 안늄의 유전자 연관 지도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관 지도와 SNU3 및 TMDH 지도와의 비교지도를 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)의 유전자 연관지도 작성용 SSR(Sinple Sequence Repeat) 마커를 제공한다.
특히, 상기 SSR 마커는 표 3에 기재되어 있고, 도 1a 내지 3d의 캡시컴 안늄 (Capsicum annuum)의 유전자 연관지도 상의 좌위를 가지는 것으로, 도 1a 내지 도 3d에 나타나 있는 BAC 클론 유래 79개 마커, NCBI sequence data base 유래 187개 마커, cDNA library 유래 140개 마커, 및 형질과 연관된 마커 9개를 포함하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로 본 발명은, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM이고 총장 3,001 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 1 내지 549의 정수 중 하나로서, 5, 6, 19, 26, 39, 40, 49, 50, 61, 71, 121, 124, 135, 151, 161, 172, 175, 220, 222, 241, 252, 262, 268, 277, 279, 293, 304, 306, 315, 320, 329, 353, 358, 383, 391, 404, 405, 436, 444, 447, 511, 534 및 539은 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 1의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 1 내지 81의 정수 중 하나로서, 5, 6, 19, 26, 39, 40, 49, 50, 61 및 71은 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 2의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 82 내지 140의 정수 중 하나로서, 121, 124 및 135는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 3의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 141 내지 218의 정수 중 하나로서, 151, 161, 172 및 175는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 4의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 219 내지 237의 정수 중 하나로서, 220 및 222는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 5의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 238 내지 269의 정수 중 하나로서, 241, 252, 262 및 268은 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 6의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 270 내지 305의 정수 중 하나로서, 277, 279, 293 및 304는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 7의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 306 내지 345의 정수 중 하나로서, 306, 315, 320 및 329는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 8의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 346 내지 392의 정수 중 하나로서, 353, 358, 383 및 391는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 9의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 393 내지 444의 정수 중 하나로서, 404, 405, 436 및 444는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 10의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 445 내지 471의 정수 중 하나로서, 447은 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 11의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 472 내지 509의 정수 중의 하나이다)를 제공다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 12의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 510 내지 549의 정수 중 하나로서, 511, 534 및 539는 제외된다)를 제공한다.
상기 유전자 연관지도는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 유전자 연관지도 작성용 집단으로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)의 유전자 연관지도 작성을 위한, SNU3, TMDH 지도 유래 43개의 SSR 프라이머 및 웹 써치 SSR 프라이머 93개를 포함하는, 상기 SSR 마커 증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는 표 3에 기재되어 있는 프라이머 세트이다.
보다 구체적으로 본 발명은, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM이고 총장 3,001 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 1 내지 549의 정수 중 하나로서, 5, 6, 19, 26, 39, 40, 49, 50, 61, 71, 121, 124, 135, 151, 161, 172, 175, 220, 222, 241, 252, 262, 268, 277, 279, 293, 304, 306, 315, 320, 329, 353, 358, 383, 391, 404, 405, 436, 444, 447, 511, 534 및 539은 제외된다)가 제공된다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 1의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 1 내지 81의 정수 중 하나로서, 5, 6, 19, 26, 39, 40, 49, 50, 61 및 71은 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 2의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 82 내지 140의 정수 중 하나로서, 121, 124 및 135는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 3의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 141 내지 218의 정수 중 하나로서, 151, 161, 172 및 175는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 4의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 219 내지 237의 정수 중 하나로서, 220 및 222는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 5의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 238 내지 269의 정수 중 하나로서, 241, 252, 262 및 268은 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 6의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 270 내지 305의 정수 중 하나로서, 277, 279, 293 및 304는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 7의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 306 내지 345의 정수 중 하나로서, 306, 315, 320 및 329는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 8의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 346 내지 392의 정수 중 하나로서, 353, 358, 383 및 391는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 9의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 393 내지 444의 정수 중 하나로서, 404, 405, 436 및 444는 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 10의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 445 내지 471의 정수 중 하나로서, 447은 제외된다)를 제공한다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 11의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 472 내지 509의 정수 중의 하나이다)를 제공다.
본 발명은 더 나아가, 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 12의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 510 내지 549의 정수 중 하나로서, 511, 534 및 539는 제외된다)를 제공한다.
상기 SSR 마커 증폭용 프라이머 세트는 증폭산물의 크기가 100~300 bp, Tm이 57~63℃ 및 GC 비율이 20~80%인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 데이터베이스 상에 등록된 고추(Capsicum ) BAC 클론의 염기서열정보로부터 1~6 bp인 SSR 모티프를 반복하는 BAC 클론을 선발하는 단계; 및 상기 선발된 BAC 클론의 SSR 모티프의 플랭킹(flanking) 염기서열로부터 제3항의 BAC 클론당 1 내지 3 개의 유전자 연관지도작성용 SSR 프라이머 세트를 디자인 및 제작하는 단계를 포함하는, 고추 유전자 연관지도 작성용 SSR 프라이머 세트를 선발하는 방법을 제공한다.
특히, 이때 SSR 반복 모티프 수는 1 bp 염기는 10회이상 반복 및 2~6 bp 염기는 5회이상 반복되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 유전자 연관지도 작성용 집단으로서 캡시컴 안늄 (Capsicum annuum)을 대상으로 SSR 분석을 실시하여 작성된, 도 1a 내지 도 3d의 캡시컴 안늄의 고밀도 유전자 연관지도를 제공한다.
일 구체예로써, 본 발명의 실시예에서는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성하였다. 이 때, F2 집단은 190개체를 수득하여 분석하였다.
특히, 본 발명의 캡시컴 안늄의 고밀도 유전자 연관지도는 인접한 좌위 간 평균 거리 5.45 cM이며, 총장 3,001 cM인 것을 특징으로 하고, 연관군인 1~12에 할당된 SNU3, TMDH 지도 유래 43개의 SSR 프라이머, BAC 클론 유래 79개 마커, NCBI 시퀀스 데이터베이스 유래 187개 마커, cDNA 라이브러리 유래 140개 마커, 웹 써치 SSR 프라이머 93개, 형질과 연관된 마커 9개를 포함한다.
이처럼, 본 발명은 고추의 재배종인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) X 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)을 대상으로 다양한 염기서열정보로부터 개발된 SSR 마커와 이를 이용하여 작성된 고추의 유전연관지도 및 이의 용도를 제공한다.
본 발명의 유전자 연관지도 작성용 SSR 마커와 유전자 연관지도는 MAS(Maker assisted selection)에 활용되어 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)의 육종 연한을 단축시키고 유용한 유전자 및 형질의 탐색에 기여할 수 있을 뿐 아니라, 가지과 식물의 종분화 및 게놈중복 연구를 위한 기초자료로서 활용이 가능하다. 특히, 본 발명은 캡시컴 안늄 종내 집단(interspecific population)을 이용한 것이므로 육종 활용에 더욱 유리하다.
도 1a는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 1의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_1이다.
도 1b는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 2의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_2이다.
도 1c는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 3의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_3이다.
도 2a는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 4의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_4이다.
도 2b는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 5의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_5이다.
도 2c는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 6의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_6이다.
도 2d는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 7의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_7이다.
도 2e는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 8의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_8이다.
도 3a는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 9의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_9이다.
도 3b는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 10의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_10이다.
도 3c는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 11의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_11이다.
도 3d는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단을 이용하여 작성된 본 발명의 캡시컴 안늄의 유전자 연관군 12의 고밀도 유전자 연관지도 FnP(AA)_12이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
'다형성(polymorphism)'은 집단에서 적어도 1% 이상의 빈도로 유전자 변이가 나타나는 경우를 말한다. 대립인자의 단백질 생산물에 대한 단백질 다형성, 한 개 뉴클레오티드의 변이를 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이라고 한다.
'마커'는 좌위 또는 연관된 좌위를 확인할 때 기준점으로 사용되는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 코딩 생성물(예를 들어, 단백질)을 지칭한다. 마커는 게놈 뉴클레오티드 서열로부터 또는발현된 뉴클레오티드 서열로부터(예를 들어, RNA, nRNA, mRNA, cDNA 등으로부터), 또는 코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 마커 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 서열을 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라미어 세트으로 사용된 핵산을 포함한다.
특히, 본 발명에서는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 연관지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다
'뉴클레오티드'는 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 핵산을 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체(예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
'유전자 연관지도(Linkage map)'는 유전자의 상대적인 위치를 나타내는 유전지도로서, DNA marker들(유전자와 다른 식별 가능한 DNA 서열/SNP, SSR)의 유전적 성질 패턴에 따라 그들의 상대적인 염색체 위치를 나타낸다. 지도에서 마커간 거리는 그들이 얼마나 자주 함께 유전되는지에 대한 빈도를 나타낸다. 유전적 연관 지도는 가계 트리 내에서 두 개의 마커가 얼마나 빈번하게 같이 유전되는지를 관찰함으로써 구축된다. 상기 연관지도는 임의로 육성된 어떤 실험집단에서 양친 사이에 다형성을 보이는 표지를 상호간의 recombination value를 거리로 환산하고 이들의 순서를 정하여 표지간의 연관군(Linkage group)을 만드는 Mapping 작업을 통해 완성된다(Jones et al., 1997)
'MAS(Marker-assisted selection)'란 목적형질을 지배하는 유전자좌와 동일위치 혹은 긴밀하게 연관되어 있는 분자표지를 작물육종에 적용할 수 있는 방법이다. MAS를 이용할 경우 목적형질을 갖는 식물체를 형질발현시까지 재배하거나 표현형을 검정하기 않고, 초기에 목적형질의 유전형을 결정할 수 있기 때문에 새로운 품종을 육종하는데 소요되는 시간을 단축시킬 수 있다(Asins, 2002).
'비교 지도(comparative map)'란 서로 다른 종(species)에서 상동 유전자(homologous gene)들의 염색체상 위치를 비교함으로써 얻어진 보존된 염색체 단편(Conserved chromosomal segment)의 지도를 말한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 가지 (Solanacea)에 속하는 고추, 즉 캡시컴(Capsicum) 속 식물의 일 종인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 유래의 다양한 염기서열정보로부터 개발된 SSR마커 및 이를 이용하여 작성된 고추의 유전자 연관지도에 관한 것이다.
본 발명은 이러한 고추, 그 중에서도 특히 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)의 고밀도 유전자 연관지도에 관한 것이다. 이들은 MAS, MAB에 활용되어 고추의 육종및 유용한 유전자 및 형질의 탐색에 활용된다.
유전자 연관지도는 MAS에 의한 육종효율 향상에 크게 기여할 수 있을 뿐만 아니라 분자지도에 기초한 유용유전자와 클로닝, 공동표지를 이용한 타 작물과의 비교유전체학에도 유용한 재료로 이용된다(Grube et al., 2000; Pierre et al., 2000; Prince et al., 1993). 최근에는 MAB(Marker-assisted breeding)의 Background selection에 사용되는데 교배 후 공여친의 염색체 제거에 효과적으로 사용되며 밀도가 높은 유전자 연관지도를 이용할수록 공여친 염색체가 최소로 존재하는 개체를 선발할 수 있다.
고추의 유전체는 크기가 2,702~3,420 Mbp로 추정되고(Arumuganathan and Earle, 1991), 고추의 유전자 연관지도는 C. annuum X C. chinense 조합에서 isozyme 표지(Tanksley, 1984)와 토마토에서 유래된 표지(Prince et al., 1993; Tanksley et al., 1988)를 이용하여 처음 작성되었으며, 이후로 고추를 재료로 자체 제작한 RFLP와 AFLP, RAPD, SSR 표지 등의 다양한 종류의 표지가 포함된 유전자 연관지도가 만들어지고 있다. 이중 우리나라에서는 46개의 SSR 표지와 287개의 RFLP 표지가 집적된 SNU2(Lee et al., 2004)를 비롯해 180개의 SSR 표지와 63개의 RFLP 표지가 집적된 SNU3(Yi et al., 2006) 의 유전자 연관지도가 작성되었다.
고추의 고밀도 유전자 연관지도는 양적형질좌위(Quantitative trait loci, QTL) 분석의 정확도를 높여 유용유전자 분리 및 연관 표지탐색을 대량으로 수행할 수 있는 기회를 높이는데 결정적인 역할을 한다(Djian-Caporalino et al., 2001). 또한 목적형질에 대한 QTL의 위치를 정확하게 파악하거나 QTL과 동일 혹은 인접한 위치에 존재하는 분자표지가 많을수록 MAS를 통한 고추 육종의 효율은 향상되며, 때때로 기 개발된 표지가 다형성 때문에 그 활용성이 표지가 개발된 집단에서만 제한될 경우 이용 가능한 표지가 많다는 것은 곧 MAS에 의한 육종효율 향상과 직접적인 연관이 있다. MAS(Marker-assisted selection)란 목적형질을 지배하는 유전자좌위와 동일위치 혹은 긴밀하게 연관되어 있는 분자표지를 작물육종에 적용할 수 있는 방법이다.
따라서, 본 발명 역시 이러한 용도에 유용하게 사용될 수 있다.
일 관점에서, 본 발명은 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 식물의 유전자 지도 작성용 SSR(Sinple Sequence Repeat) 마커에 관한 것이다.
“마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌위를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머쌍으로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자 연관지도상의 위치는 유전자좌위(genetic locus)로 일컬어진다.
바람직하게는, 상기 유전자 연관지도 작성용 SSR 마커는 고추Capsicum)의 게놈 DNA를 사용하여 도 1a 내지 3d의 연관군 오른쪽에 표시하고 있는 바와 같은 BAC-end sequencing을 통한 BAC 클론 유래 79개 마커(파란색), NCBI sequence data base 유래 187개 마커(검은색), cDNA library 유래 140개 마커(붉은색),형질과 연관된 마커 9개(분홍색)를 포함한다.
본 발명에서 상기 SSR(Sinple Sequence Repeat) 마커는 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) 속 식물의 유전자 지도 작성을 위한 것이다.
특히, 유전자 연관지도 작성용 집단으로 종내 집단, 즉, 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) x 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)을 대상으로 다양한 염기서열정보로부터 개발된 SSR를 이용하여 작성된 고추의 유전자 연관지도를 작성한다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 유전자 지도 작성용 집단은 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단이다.
또한, 본 발명은 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관지도 작성용 SSR 마커 증폭용 프라이머를 포함한다.
"프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다. 본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다
본 발명에서 사용하는 프라이머는, 증폭된 DNA의 길이가 100-300 bp이고, 정방향 및 역방향 프라이머간의 녹는점(melting temperature, Tm) 값이 3℃ 이하이며 전체적인 Tm 값은 57℃에서 63℃ 이내인 것이 바람직하다. 또한 GC 함량은 20%~80%인 것이 좋다. 바람직한 예로서, 표 3에 나타나 있는 SNU3, TMDH map 유래 43개의 SSR 프라이머, web search SSR primer 93개(갈색) 등이 있다.
한편, 본 발명에서 사용되는 SSR 마커 및 프라이머는 이하와 같은 방법으로 찾을 수 있다.
우선, 예를 들어 SSR 마커를 BAC-end sequencing을 통해 찾는다. 일례에서, FP11E와 FP11H BAC library로 18,432개 클론을 염기서열 분석하여 15,609개의 BAC-end sequence를 얻고, 이로부터 5,106개의 SSR을 포함하는 프라이머를 Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)를 이용해 합성하여 다형성분석에 사용할 수 있다. 그리고, 12만개 이상의 Capsicum nucleotide sequence는 NCBI site(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 확보하여 SSR 프라미어 합성에 이용할 수 있다
본 발명은 또한, 고추에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라미어 세트을 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 고추 유전자 연관지도 작성용 SSR 마커를 동정하는 방법을 포함한다.
본 발명의 방법은 배추에서 게놈(genomic) DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라미어 세트으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
그러므로, 본 발명은 상기 프라미어 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 캡시컴 안늄 유전자 연관지도 작성용 SSR 마커를 동정하기 위한 키트를 포함한다.
본 발명의 키트에서, 프라미어 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한 데이터베이스 상에 등록된 고추 BAC 클론의 염기서열정보로부터 ≥18 bp인 SSR 모티프를 포함하는 BAC 클론을 선발하는 단계; 및 상기 선발된 BAC 클론의 SSR 모티프의 플랭킹(flanking) 염기서열로부터 BAC 클론당 1 내지 3 개의 유전자 연관지도 작성용 SSR 프라이머 세트를 디자인 및 제작하는 단계를 포함하는 캡시컴 안늄 유전자 연관지도 작성용 SSR 프라이머 세트를 선발하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명에서는 SSR 반복 모티프는 1개의 염기가 반복되는 것(mono-)에서부터 6개의 염기가 반복되는 것(hexa-)까지가 바람직하며, 반복되는 모티프의 수는 1개의 염기가 반복되는 것은 10회 이상, 2개에서 6개 염기가 반복되는 것은 5회 이상으로 하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명은 다른 관점에서 유전자 연관지도 작성용 집단으로 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)을 대상으로 SSR(Simple Sequence Repeat) 분석을 실시하여 작성된 도 1a 내지 도 3d의 캡시컴 안늄의 유전자 연관지도에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 유전자 연관지도에서, 상기 유전자 연관지도 작성용 집단은 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) x 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)의 교배로 생성된 집단이다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 유전자 지도 작성용 집단은 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄( Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단이다. 상기 CM334는 고추의 가장 많은 피해를 주는 역병균(Phytophthora capsici)에 대해 저항성을 나타내고, ECW123R은 이병성을 나타내는 종으로서, 역병의 QTL분석에 매우 용이한 조합이다. "저항성"은 식물이 물질 투여, 병원체 감염, 또는 스트레스에 노출의 결과로서 실질적으로 표현형 변화를 보이지 않는 것을 의미할 수 있으며, 바람직하게는 병원체 감염 시 실질적으로 표현형 변화를 보이지 않는 것을 의미할 수 있다.
또한, 상기 유전자 연관지도는 인접한 좌위 간 평균거리가 5.45 cM이며, 총장이 3,001 cM인 것을 특징으로 한다.
그리고, 상기 유전자 연관지도는 12개의 연관군인 1~12에 할당된 SNU3, TMDH map 유래 43개의 SSR primer, BAC 클론 유래 79개 마커, NCBI sequence data base 유래 187개 마커, cDNA library 유래 140개 마커, web search SSR primer 93개, 형질과 연관된 마커 9개를 포함한다.
이처럼, 본 발명의 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)의 고밀도 유전자 연관지도는 MAS, MAB에 활용되어 고추의 육종연한을 단축시키고 유용한 유전자 및 형질의 탐색에 기여할 수 있을 뿐 아니라 가지과 식물의 종분화 및 게놈중복 연구를 위한 기초자료로서 활용이 가능하다.
더구나, 기존의 고추의 유전자 연관지도는 모두 서로 다른 종을 교배하여 얻은 집단을 이용하였기 때문에 다형성이 높은 분자 마커를 얻었지만, 본 발명의 경우는 동일 종을 교배하여 얻어 다형성이 많이 나타나지 않는 특징을 가진다. 따라서, 본 발명의 캡시컴 안늄(Capsicum annuum)의 고밀도 유전자 연관지도는 육종에 활용하기기에 더욱 적합하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것들과 유사하거나 등가인 임의의 방법 및 재료가 본 발명을 테스트하기 위한 실행에서 사용될 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법이 본원에서 기술된다.
실시예 1: 게놈 DNA 추출
고추 12개의 다른 계통과 F2 집단으로부터 각 개체들의 gDNA를 추출하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
우선, 각 Capsicum annuum 개체들의 잎 50 mg을 CTAB 버퍼[2%(w/v) 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide), 1.4 M 염화나트륨, 30 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1%(w/v) PVP, 0.2%(v/v) 머캅토 에탄올(mercaptoethanol)] 750 ㎕에 넣고 각각 마쇄한 후, 65℃에서 1시간 배양하였다.
다음으로, 클로로포름:이소아밀알콜(24:1) 용액을 750 ㎕ 넣고 잘 섞은 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 500 ㎕를 취하였다. 여기에 1/10 양만큼 의 소듐 아세테이트와 2배 양만큼의 100% 에탄올을 넣어 DNA를 침전시켰다. 다음으로, 70% 에탄올로 세척 및 건조한 후 RNase가 첨가된 TE 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA)에 녹여 DNA를 분리하였다.
실시예 2: SSR마커 개발
2-1: SSR 마커 개발
우선 BAC-end sequencing을 통해 SSR을 찾았으며, 이때 사용된 것은 FP11E와 FP11H BAC library로 18,432개 클론을 염기서열 분석하여 15,609개의 BAC-end sequence를 얻었다. 이로부터 5,106개의 SSR을 포함하는 프라이머를 Primer3 software(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)를 이용해 합성하여 다형성분석에 사용하였다. BAC-end sequencing 데이터에 대한 내용은 표 1(시퀀스 통계)과 표 2(시퀀스 유사성 써치 결과)에서 나타내었다.
총 클론 수 18,432
총 시퀀스 수 15,609
총 염기 수(base count, bp) 10,380 kb
평균 길이(bp) 665
게놈 범위(coverage) 0.37X
Database Number of hits (%)
Mitochondria + Chloroplast 35 (0.2%)
Transposon + Retrotransposon 928 (5.9%)
NCBI protein database
Protein 14,102 (90.3%)
Unknown 544 (3.5%)
Total number of BAC ends 15,609 (100%)
그리고, NCBI site(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 이용하여 12만개 이상의 Capsicum nucleotide sequence를 확보하여 SSR 프라미어 합성에 이용하였다.
프라이머 디자인에 사용되는 조건으로는 증폭된 DNA의 길이가 100-300 bp이어야 하며, forward와 reverse 프라이머간의 melting temperature(Tm) 값이 3℃ 이하이며 전체적인 Tm 값은 57℃에서 63℃ 이내로 하였다. 또한 GC contents는 20%에서 80%로 하여 되도록 많은 프라이머가 합성되도록 하였다.
SSR 반복 motif는 1개의 염기가 반복되는 것(mono-)에서부터 6개의 염기가 반복되는 것(hexa-)까지 제한하였으며, 반복되는 motif의 수는 1개의 염기가 반복되는 것은 10회 이상, 2개에서 6개 염기가 반복되는 것은 5회 이상으로 하였다. 이러한 SSR motif search와 primer design은 SSR finder 1.2b (http://jicbio.bbsrc.ac.uk/cereals/webstart/ssrfinder/ssrfinderlaunch.html)와 SSRLocator l(http://minerva.ufpel.edu.br/~lmaia.faem/ssr_install_guide.html, Luciano et al., 2008)의 프로그램을 이용하였다. 이렇게 합성된 프라이머들은 우선 12개의 대표 계통에 대해서 다형성 검증을 우선 실시하였다.
사용된 프라이머를 이하의 표 3에 기재하였다.
특히, FnP 그룹으로 표시된 서열번호 1 내지 1098로 기재된 핵산서열을 갖는 프라이머들은 본 발명자들에 의해 제작한 프라이머와, 공지의 SNU3, TMDH 맵에 포함된 것도 포함하고 있으나, 이들은 본 발명의 고밀도 유전연관지도에 포함되어 고유의 새로운 위치를 가지게 되었다.
Figure 112013117269273-pat00001
Figure 112013117269273-pat00002
Figure 112013117269273-pat00003
Figure 112013117269273-pat00004
Figure 112013117269273-pat00005
Figure 112013117269273-pat00006
Figure 112013117269273-pat00007
Figure 112013117269273-pat00008
Figure 112013117269273-pat00009
Figure 112013117269273-pat00010
2-2: SSR 프라이머를 이용한 DNA 증폭과 PAGE 분석
PCR 증폭은 25 μl의 최종 부피를 가지며 30-50 ng의 genomic DNA 주형과, 10 pmole의 SSR 프라이머, 0.5 unit의 Taq polymerase(Solgent, Korea)와 10X PCR buffer 그리고 멸균 증류수를 이용하였다.
*증폭은 일반적인 PCR machine에서 수행하였으며며, 조건은 denaturation 단계에서 94℃ 4분, 증폭단계에서 94℃ 45초, 55℃ 45초, 72℃ 45초로 하고 35 cycle을 반복하였다. 마지막으로 72℃에 10분간 반응하고 8℃로 모든 반응을 종료하였다.
일반적으로 SSR은 그 증폭된 DNA조각의 길이가 100~300 bp 이내로 작고, 다형성도 1~수십 bp로 작기 때문에 일반적인 아가로즈 겔 분석에서는 다형성을 찾을 수 없으므로, 6% polyacrylamide gel(Sambrook et al., 1989)을 통해서 전기영동하고 rapid silver staining method(Sanguinetti et al., 1994)를 이용하여 DNA를 염색 관찰 하였다.
실시예 3 : 유전자 연관지도 작성
본 발명에 사용된 고추의 조합은 Capsicum annuum CM334 X Capsicum annuum ECW123R으로 하였다. 이중에서 CM334는 고추의 가장 많은 피해를 주는 역병균(Phytophthora capsici)에 대해 저항성을 나타내고 ECW123R은 이병성을 나타내는 종으로서, 역병의 QTL분석에 매우 용이한 조합을 선택하였다.
특히 대부분의 고추 유전자 연관지도는 Capsicum 속의 종간집단(interspecific population)을 이용하여 다형성이 유리한 집단을 이용하는 반면 본 발명에서는 대부분의 육종가들이 사용하는 교잡종에 해당하는 C. annuum 종내집단(intraspecific population)을 이용하여 유전자 연관지도를 작성하였다.
이렇게 교배한 F1은 모두 hetero type으로 이를 다시 자가수분하여 얻은 F2집단 190 개체를 유전자 연관지도 작성에 사용하였다. 이렇게 얻은 F2 집단은 멘델의 독립유전법칙에 따라 1:2:1의 유전형으로 나타나게 되고 이렇게 나타난 분자표지를 모아 각각의 recombination value를 계산하여 유전자 연관지도를 작성하였다.
유전자 연관지도 작성에 사용된 프로그램은 Mapdisto 1.7b(http://mapdisto.free.fr)를 사용하였으며 find groups를 우선 실행하고 LOD값은 6으로 r max/d max 값은 9~15를 주어 그룹화하였으며 Kosambi mapping function(Kosambi, 1944)을 따랐다.
데이터 파라미터 값은 population type은 'F2', data format은 '2'를 입력하였다. 재조합 빈도는 유전자 연관지도의 거리 계산을 위해 단위로는 centimorgans(cM)을 사용하였고 이 또한 Kosambi mapping function(Kosambi, 1943)을 따랐다. Mapdisto 1.7b에서 그려진 유전자 연관지도는 다시 MapChart program (Voorrips, 2002)으로 옮겨 도식화하고 다른 유전자 연관지도와 comparative map을 작성하였다. SSR 분자표지 이외에 형질과 관련하여 기존에 알려진 primer를 이용하여 screening하였고 이를 유전자 연관지도에 함께 등재하였다(표 4).
마커명 프로토콜 제한효소 Reference 크기(bp) 연관군
PH5-SCAR CAPS Dra I Pungency 1200 2
FPtr055(SCAR) SCAR lipid transfer protein gene 194 3
PSY4 CAPS Spe I organ pigmentation loci 219 3
M06-CAPS CAPS Cla I Phytophthora capsici 453 5
FPACS75 CAPS Dde I ACS075 7
MS3(AluI) CAPS Alu I genetic male sterility 412 8
BS2(SCAR) SCAR Bacterial spot 550 9
FPSSR9 SCAR Phytophthora capsici 268 9
FPTr053(PvuII) CAPS Pvu II Phytophthora capsici 900 9
그리고, 도 1a 내지 도 3d에 본 발명의 C. annuum의 고밀도 유전자 연관지도를 도시하였다.
도 1a 내지 도 3d에서는 연관군의 우측에 마커를 위치, 좌측에 누적적인 재조합거리(cM)를 표시하였다. BAC 염기서열로 개발된 SSR 마커는 푸른색으로 표시하였으며, web search primer는 갈색, cDNA library를 이용한 SSR 마커는 붉은색으로 표시하였다. SNU3 map과 TMDH map에서 유래된 SSR 마커는 초록색으로 표시하였으며 형질과 관련된 분자마커는 분홍색으로 표시하였다.
실시예 4 : SNU3 , TMDH map 과의 비교지도( comparative map )
실시예 3에서 작성된 유전자 연관지도에 대한 검증을 위하여, 현재까지 가장 많이 사용되고 있는 SNU3 map(Yi et al., 2006)과 비교 지도(comparative map)을 작성함으로써 본 발명의 검증을 하고자 하였다. 이 때, 직접적으로 SNU3 map과 비교하기에는 상동성(synteny)이 있는 마커가 너무 부족하여 FnP(AC) map과 함께 비교하였다.
C. annuumC. chinense의 gDNA를 대상으로 염기서열분석을 하여 염기서열에 차이가 있는 부분을 찾고 그 부분이 제한효소로 절단되는지 유무를 확인하고, 염기서열 분석에서 제한효소로 절단되는 프라이머를 PCR 증폭하고 거기에 따른 제한효소로 처리하여 다형성이 나타나는지 조사하였다(STS 마커이용). 이 때, 다형성이 나타나면 F2 집단 190 개체에 대해 분석하여 나타난 유전자형을 입력하여 유전연관지도에 등록하였다. 그리고, CAPS 마커 개발과 같은 방법으로 염기서열 분석을 실시하고 나타나 SNP를 확인하고, 해당 SNP가 유일하게 존재하는 부분을 중심으로 primer를 디자인하였다(SNP 마커이용).
이렇게 합성된 primer를 이용하여 C. annuumC. chinense의 gDNA를 대상으로 HRM(Hign resolution melting)법을 이용하여 분석하였다. 이때 사용되는 기기로는 Roche사의 LightCycler 480을 사용하고 분석 프로그램으로는 LightCycler Analysis Software Applications(LC480 software Version 1.5)를 사용하였다.
이와 같은 방법으로 FnP(AC) map을 수득하였다.
이와 같이, SNU3 map과 FnP(AC) map의 상동성을 확인해본 결과 모든 linkage group LG)과 상동성이 확인되었으나, SNU3 map의 특성상 8번 LG가 없어 TMDH map(Minamiyama et al., 2006)을 이용하여 8번 LG의 상동성을 확인하였다.
<110> Fnp, Co. <120> SSR markers and Genetic linkage map using Intraspecific population of Capsicum annuum <130> PD13-1076-D1 <160> 1098 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN0996 Forward <400> 1 cacccttctc tgctttgtca g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN0996 Reverse <400> 2 tggggtaata tttgtccgtc a 21 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN0214 Forward <400> 3 ttgcaagagt agatcgttga cc 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN0214 Reverse <400> 4 tgggtctggt tgttgttctt c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0890 Forward <400> 5 taagagcaag gaggctctgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0890 Reverse <400> 6 gacatgatcc aacccaatcc 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1072 Forward <400> 7 tctaataaag ctagttcttc agcg 24 <210> 8 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24 tcctaggcag cacaaacctt 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0750 Forward <400> 25 aacaaaacgc gctaaaatgg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0750 Reverse <400> 26 acaagtcatg ggagaatggc 20 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1601 Forward <400> 27 ggttatggtt tggccatttc t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1601 Reverse <400> 28 atcaaatttc tggctttgcc t 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1478 Forward <400> 29 gcatcaacaa caacgcctaa t 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1478 Reverse <400> 30 tcagaagcaa aagggtcaga a 21 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1475 Forward <400> 31 aaagagggga gttatggcgt 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1475 Reverse <400> 32 ggtcagaagc aaaagggtca 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0023 Forward <400> 33 atggaagatg ccattgaagc 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0023 Reverse <400> 34 accgaccacc tctacctcct 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1440 Forward <400> 35 ttccaattct ccctctcagc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1440 Reverse <400> 36 gatggggatt ggaattaggg 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE063 Forward <400> 37 ccaaatcatc atcaatgcga aga 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE063 Reverse <400> 38 cggagtagat ttggcggaga aa 22 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1390 Forward <400> 39 acacacgaca ggcaaaatca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1390 Reverse <400> 40 aagggcgagg gttagagaag 20 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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FPssrC0774 Forward <400> 1019 tgcggtgtgc taaatagtgc 20 <210> 1020 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0774 Reverse <400> 1020 gctgttgcta ctcgcaatga 20 <210> 1021 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE075 Forward <400> 1021 gcggctcagc agaaagagag ag 22 <210> 1022 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE075 Reverse <400> 1022 tgccacagct ggagaacgta aa 22 <210> 1023 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1452 Forward <400> 1023 ctagataatc atggcggctc a 21 <210> 1024 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1452 Reverse <400> 1024 tggagaacgt aaagctacgg a 21 <210> 1025 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1436 Forward <400> 1025 ttcacctggt ggaggtagat aga 23 <210> 1026 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1436 Reverse <400> 1026 tcggtgtttg gatgttgcta 20 <210> 1027 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN2782 Forward <400> 1027 cacacacgca catctctcat t 21 <210> 1028 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN2782 Reverse <400> 1028 aatgcgacca acaagtaatc g 21 <210> 1029 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1653 Forward <400> 1029 acaacttgtt ccaccatcag g 21 <210> 1030 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1653 Reverse <400> 1030 cgtagggagg agcgatagag a 21 <210> 1031 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1651 Forward <400> 1031 tgttgaggaa aattgcaaag g 21 <210> 1032 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1651 Reverse <400> 1032 tttataaatt tgttttgggg gc 22 <210> 1033 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0326 Forward <400> 1033 attgcaaagg aatgggatca 20 <210> 1034 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0326 Reverse <400> 1034 tcttttataa atttgttttg gggg 24 <210> 1035 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1143 Forward <400> 1035 catggtttct gctgacgtgt 20 <210> 1036 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1143 Reverse <400> 1036 tccaagaaat accacaccca 20 <210> 1037 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN3298 Forward <400> 1037 cacaacacaa aacccccata c 21 <210> 1038 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN3298 Reverse <400> 1038 aaactgttcg gattgttgac g 21 <210> 1039 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrB5339 Forward <400> 1039 acaaaggggg tttcaaatgt t 21 <210> 1040 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrB5339 Reverse <400> 1040 cgatgtgaaa ttgaattagt caga 24 <210> 1041 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN2564 Forward <400> 1041 tttcttcttc tgggttcacc a 21 <210> 1042 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN2564 Reverse <400> 1042 cctctctcgc tgtctctctc a 21 <210> 1043 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0300 Forward <400> 1043 ccttttacgc caaattccaa 20 <210> 1044 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0300 Reverse <400> 1044 aattaagctg gccacacagc 20 <210> 1045 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1054 Forward <400> 1045 attttgctcc tgggttttcc 20 <210> 1046 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1054 Reverse <400> 1046 cctcgtggag gtagagagac a 21 <210> 1047 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN0251 Forward <400> 1047 aatattccga atctgcctca g 21 <210> 1048 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN0251 Reverse <400> 1048 cgctcagtaa tttcagcttc g 21 <210> 1049 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1531 Forward <400> 1049 atctttcatc cctttgtggc 20 <210> 1050 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1531 Reverse <400> 1050 ttcgcctctg tttcgattct 20 <210> 1051 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN2784 Forward <400> 1051 ttttctcatc tttcatccct ttg 23 <210> 1052 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN2784 Reverse <400> 1052 ttcttcaggt gtggctgagt t 21 <210> 1053 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1974 Forward <400> 1053 aacctcatct gcacccttct t 21 <210> 1054 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1974 Reverse <400> 1054 agattttcat cagaactgcg g 21 <210> 1055 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0609 Forward <400> 1055 atggagatcg caacctcatc 20 <210> 1056 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0609 Reverse <400> 1056 gcggcaagaa gatgaaagtc 20 <210> 1057 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0720 Forward <400> 1057 gttgttgggt ggtacttggg 20 <210> 1058 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0720 Reverse <400> 1058 ggaagatctc aaatgggtcg 20 <210> 1059 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1514 Forward <400> 1059 atggcggttc tttttatcgt t 21 <210> 1060 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1514 Reverse <400> 1060 aggaagatct caaatgggtc g 21 <210> 1061 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1464 Forward <400> 1061 ttgtcgaaaa ttaggcgttc tt 22 <210> 1062 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1464 Reverse <400> 1062 tgggaaatgg ctaattcagg 20 <210> 1063 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN4641 Forward <400> 1063 gcatctctgc tctttccgc 19 <210> 1064 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN4641 Reverse <400> 1064 atcgaagaag aaagggggat t 21 <210> 1065 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0600 Forward <400> 1065 gccctcctca accctaaaaa 20 <210> 1066 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0600 Reverse <400> 1066 tgcgccatat tggttgaata 20 <210> 1067 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE108 Forward <400> 1067 ggccgcgtca accctaaaaa 20 <210> 1068 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE108 Reverse <400> 1068 tgggagggaa aagtaagcga aa 22 <210> 1069 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrB6151 Forward <400> 1069 aagaatgcgc cttcaatacc t 21 <210> 1070 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrB6151 Reverse <400> 1070 agaggaaaca acccttttcc a 21 <210> 1071 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrB3017 Forward <400> 1071 tccttcttcg tagggcatca 20 <210> 1072 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrB3017 Reverse <400> 1072 cctcctcgag cttgtcattt 20 <210> 1073 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1430 Forward <400> 1073 gccagcaaaa ctccaaagaa 20 <210> 1074 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC1430 Reverse <400> 1074 ccagcagcac caagagtaca 20 <210> 1075 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0886 Forward <400> 1075 ttcccaacaa aatcaaattg c 21 <210> 1076 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0886 Reverse <400> 1076 ttttgaaggg ttttggcaac 20 <210> 1077 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE128 Forward <400> 1077 tggatcccaa aagactcaga aca 23 <210> 1078 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpmsE128 Reverse <400> 1078 tatttccctc agtcgaggtc gt 22 <210> 1079 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0246 Forward <400> 1079 ctcccaccag agtccttttg 20 <210> 1080 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0246 Reverse <400> 1080 cagaccggct tcgaaataaa 20 <210> 1081 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0647 Forward <400> 1081 gcttttctta aagttcttag tttccaa 27 <210> 1082 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0647 Reverse <400> 1082 tggtcatgtc gtttgcattt 20 <210> 1083 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0972 Forward <400> 1083 ccccctaatt cgacccttt 19 <210> 1084 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrC0972 Reverse <400> 1084 ttttggggtt ttgcaatcat 20 <210> 1085 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1250 Forward <400> 1085 ggcctctgtg ttttcctctc t 21 <210> 1086 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN1250 Reverse <400> 1086 ctcatttctt gcaaaacgag c 21 <210> 1087 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0538 Forward <400> 1087 ctggcctctg tgttttcctc 20 <210> 1088 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0538 Reverse <400> 1088 ccgtacagct gaatccccta 20 <210> 1089 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1854 Forward <400> 1089 tctggcctct gtgttttcct 20 <210> 1090 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1854 Reverse <400> 1090 ctgacttgca tctccatagc c 21 <210> 1091 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0050 Forward <400> 1091 cactgaaaat ttgcttttct ttga 24 <210> 1092 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW0050 Reverse <400> 1092 tcttgaccag cagtatccca 20 <210> 1093 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1621 Forward <400> 1093 tccaattgat gaacaagcat tc 22 <210> 1094 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1621 Reverse <400> 1094 tttgcaaatt tgaaggacag g 21 <210> 1095 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1296 Forward <400> 1095 tacaaaagga agccgaggtc 20 <210> 1096 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrW1296 Reverse <400> 1096 tctgtagccg gtggctctac 20 <210> 1097 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN4798 Forward <400> 1097 caagagccat tactcttccc c 21 <210> 1098 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FPssrN4798 Reverse <400> 1098 catcgtagcg cctttctaca c 21

Claims (2)

  1. 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머로 캡시컴 안늄(Capsicum annum)의 게놈 DNA를 증폭시켜 생성되는 DNA들 중에서 선택되는 종내 집단인 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) CM334 및 캡시컴 안늄(Capsicum annuum) ECW123R 간의 교배로 생성된 F1을 자가수분하여 수득한 F2 집단 캡시컴 안늄 식물의 유전자 연관군 2의 인접좌위 간 평균 거리가 5.45 cM인 고밀도 유전자 연관지도 작성용 마커 DNA(이 때, 상기 n은 82 내지 140의 정수 중 하나로서, 121, 124 및 135는 제외된다).
  2. 서열번호 2n-1로 기재되는 핵산서열로 구성되는 포워드 프라이머 및 서열번호 2n으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 세트들 중 선택되는, 제1항의 마커 DNA의 증폭용 프라이머 세트(이 때, 상기 n은 82 내지 140의 정수 중 하나로서, 121, 124 및 135는 제외된다).
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Rajesh Kumar 등. International Journal of Plant Breeding and Genetics. Vol. 5, No. 2, 페이지 99-110 (2011.) *
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