KR100984169B1 - Ｔｍｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트,방법 및 키트 - Google Patents

Ｔｍｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트,방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시된 3개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 TMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하는 방법, 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 TMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하기 위한 키트에 관한 것이다. 분자 표지가 없다면, TMV에 대한 저항성 육종을 하기 위하여 매 세대마다 후대 검정을 해야 하므로, 많은 노력과 시간, 자본 등이 소요되는데, 본 발명의 프라이머 세트로 이루어진 분자 표지의 개발은 이러한 비용을 줄여 보다 빠르고 정확한 육종에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
프라이머 세트, TMV, 고추, 키트, 마커

Description

ＴＭＶ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트, 방법 및 키트{Primer set, method and kit for selecting TMV-resistant pepper cultivar}
본 발명은 TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 DNA 마커에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1 내지 6으로 표시된 3개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용하여 TMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하는 방법, 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 TMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하기 위한 키트에 관한 것이다.
TMV는 Tobamovirus에 속하며, 단일가닥 리보핵산으로 이루어진 바이러스이다. TMV는 전 세계적으로 발견되고 있으며, 22과 200여 종의 식물에 감염사례가 보고될 정도로 기주 범위가 넓다. TMV에 감염되면 모자이크, 왜성화, 꽃의 탈색, 잎의 뒤틀림 등의 병징이 나타나 식물의 생육에 악영향을 미치며, 잎이나 줄기 외에도 과실에까지 병징이 발생하여 상품가치를 떨어뜨린다. 한국에서는 주로 담배, 고추, 토마토에 큰 피해를 입히는 것으로 알려졌다.
TMV의 매개충은 아직 발견되지 않았으며 주로 기계적인 접촉이나 식물체의 잔해가 남아 있는 토양, 종자 감염에 의해 전염된다. TMV의 방제를 위해서는 토양의 소독, 농기구와 종자의 철저한 관리가 필요하다. 그러나 방제방법이 간접적이고, 많은 노력이 필요하기 때문에 TMV에 저항성을 가진 품종을 육성하는 것이 보다 효율적이고 경제적인 방제 방법이 될 것이다.
고추에서 발견된 TMV 저항성은 L 유전자좌에 있는 유전자에 의해 유전되는 것으로 보이며, 지금까지 L 0 , L 1 , L 2 , L 3 , L 4 5개의 대립유전자가 보고되었다. 각 대립유전자는 TMV의 strain에 따라 서로 다른 저항성과 감수성 반응을 보이며, 이들 중 L 4 대립유전자는 지금까지 발견된 모든 TMV strain에 대해 저항성을 나타내는 것으로 알려졌다.
한편 감자의 역병(Phytophthora infestans) 저항성을 암호화하는 R3/R7 complex 유전자좌와 토마토의 시들음병(Fusarium oxysporum) 저항성을 암호화하는 I2 complex 유전자좌는 각각의 종에서 염색체 11의 아랫 쪽 끝에 비슷한 지점에 위치한다는 것이 비교유전체학 연구를 통해 밝혀졌다. 뿐만 아니라 유전자지도를 비교하여 고추의 TMV 저항성 유전자좌인 L은 감자의 R3, 토마토의 I2와 비슷한 위치인 염색체 11번 말단에 존재한다는 것이 알려졌다.
TMV 저항성 품종을 육성하기 위해서는 직접 병을 접종하여 그 표현형을 보고 다음 세대로 진전하는 방법을 사용하였다. 그러나 이런 방법은 유전자형을 알기 위하여 후대에서 저항성과 이병성의 비율을 확인해야 하기 때문에 많은 시간, 돈, 공 간, 노력이 필요하다. L 4 대립유전자와 가깝게 연관된 분자표지를 이용하면 후대 검정을 하지 않아도 유전자형을 알 수 있기 때문에 보다 신속하고 효율적으로 TMV 저항성 품종을 육종할 수 있다.
표 1. L 대립유전자의 TMV strain 저항성 스펙트럼 (R : 저항성, S : 감수성).
Indicate plant Genotype TMV strain
　 　 P0 P1 P1.2 P1.2.3
C. annuum cv.E arlywonder L0L0 S S S S
C. annuum cv. Bruinsmawonde L1L1 R S S S
C. frutescens cv. Tabasco L2L2 R R S S
C. chinense var. PI159236 L3L3 R R R S
C. chacoense var. PI260429 L4L4 R R R R
본 발명은 감자와 토마토의 정보를 이용한 비교유전체학적인 접근 방법으로 L4 및 L3 대립유전자와 연관된 분자표지를 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 6으로 표시된 3개 쌍의 프라이머 세트 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 TMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 TMV에 대한 고추 저항성 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 분자 표지가 없다면, TMV에 대한 저항성 육종을 하기 위하여 매 세대마다 후대 검정을 해야 함으로 인해 많은 노력과 시간, 자본 등이 소요되는데, 본 발명의 프라이머 세트로 이루어진 분자 표지의 개발은 이러한 비용을 줄여 보다 빠르고 정확한 육종에 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;
서열번호 3의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및
서열번호 5의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 서열 내의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트
로 구성되는 군으로부터 선택된 TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 3의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 5의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 6의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 TMV에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 TMV에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다. 3개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 TMV에 대한 저항성을 가진 계통을 비교적 쉽고 정확하게 분별할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 마커로 이용된다. 상기 마커를 개발하기 위해, 먼저 토마토와 감자의 저항성 유전자인 I2와 R3를 이용하여 BAC 클론을 선발한 후 이 중에서 L 유전자좌에 연관이 된 BAC 클론을 선발하였다. 이 BAC 클론의 염기서열을 바탕으로 저항성 식물인 C. chacoense와 감수성식물인 C. annuum의 염기서열을 비교하여 다형성이 있는 염기서열을 탐색하였다. 최종적으로 이러한 다형성 염기서열을 이용하여 프라이머를 디자인하고 이를 TMV 저항성이 분리되는 집단에서 분석함으로써 TMV 저항성 분자표지인 서열번호 1 내지 6의 프라이머 세트를 선발하였다.
보다 구체적으로는, contig를 구성하고 있는 22, 38, 51, 69번 BAC 클론의 양 끝 염기를 증폭하는 프라이머로 C. chacoense cv. PI260429, C. annuum cv.Early Calwonder를 PCR하여 그 염기 서열을 분석하였다. 그 가운데 22번 BAC 클론의 T7 방향과, 51번 BAC 클론의 SP6 방향의 끝 염기 서열에서 각각 2, 3개의 SNP를 확인했다. SNP를 포함하도록 HRM 분석용 프라이머를 2개 제작하여 다형성을 확인하고, 서열번호 1 내지 4의 공우성(co-dominant) 분자표지로 개발하였다.
13번 BAC 클론의 draft 염기서열 분석한 자료에서 2개의 프라이머를 제작하여 C. chacoense cv. PI260429, C. annuum cv.Early Calwonder를 PCR한 결과 그 가운데 하나의 프라이머에서 다형성이 확인되었다. L 0 대립 유전자를 가진 동형접합체와 이형접합체 식물체에서 750bp의 핵산이 PCR 되고, L 4 대립 유전자의 동형접합체에서는 약한 1200bp의 핵산이 PCR 된다. 이 프라이머로 서열번호 5 및 6의 SCAR (sequence characterized amplified region) 분자표지를 개발하였다. SCAR 분자 표지는 PCR을 하여 겔 상에서 밴드의 유무나 그 길이의 차이로 다형성을 찾는 방법이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험재료 및 방법
1) 감자와 토마토의 R 유전자를 이용한 BAC 클론 선발
C. frutescens BG2816의 잎 조직에서부터 만들어진 221,184개의 BAC 클론 중 에 I2C -1 유전자의 3 서열로부터 개발한 탐침자(probe)로 89개의 BAC 클론을 선발했다. 89개의 BAC 클론에 대해 Amplicon Express(Pullmam)에 BAC fingerprinting을 의뢰하였다. BAC fingerprinting 결과로부터 FPC 프로그램을 이용해 tolerance setting이 3 cutoff가 1e-10일 때 89개의 BAC 클론이 하나의 contig로 연결되는 것을 확인할 수 있었다 (도 1 참조).
2) BAC 클론의 그룹화
토마토의 I2 complex 유전자를 이용해 개발한 탐침자로 선발한 89개의 BAC 클론들을 감자의 R7 유전자를 바탕으로 개발한 R7-1, R7-2 프라이머와 R3a 유전자의 가까운 서열에서 개발한 LRR 프라이머로 PCR 하였다. 37개의 BAC 클론에서 R7-1 프라이머로 1.5kb 크기의 PCR 산물이 증폭되었고, R7-2 프라이머에서는 0.8~1.3kb크기의 PCR 산물이 52개의 BAC 클론에서 증폭되었고, LRR 프라이머로는 22개의 BAC 클론에서 1.2kb 크기의 PCR 산물이 증폭되었다. 이 가운데 LRR 프라이머로 증폭된 22개의 클론에서 R7-1, R7-2 프라이머로도 모두 증폭되어, LRR 프라이머로 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 22개의 BAC 클론을 염기서열의 유사성에 따라 10개의 그룹으로 구분할 수 있었다 (도 2 참조).
3) BAC 클론의 드래프트 시퀀싱(Draft sequencing)
10개의 그룹에서 하나씩 BAC 클론을 선발하여 드래프트 시퀀싱(Draft sequencing)을 TIGR(미국 유전체 연구소)에 의뢰하였다. 그 결과로부터 40개의 SSR (Simple Sequence Repeat) 분자표지를 개발하였고, 6개의 SSR 분자표지에서 다형성 을 확인하여 5개의 BAC 클론을 고추의 AC99 연관지도 상에서 그 위치를 결정하였다. 그 가운데 20번 BAC 클론이 염색체 11번의 L 유전자좌와 그에 가까운 TG36 분자표지 가운데에 위치하였다 (도 3 참조).
4) BAC contig 제작
BAC fingerprinting의 결과를 토대로 FPC 프로그램을 이용해 만든 contig를 검증하기 위하여 40개의 SSR 분자표지 중 하나인 pepbac 13-E4 프라이머를 선발하여 89개의 BAC 클론에 PCR을 했다. PCR 결과는 FPC 프로그램을 이용해 만든 contig와 완전히 일치하지 않아 BAC 클론의 양 끝 염기서열로부터 프라이머를 만들어 새롭게 contig를 만들었다. BAC 클론의 양 끝 염기서열은 BAC 클론으로부터 플라스미드 정제 키트를 이용해 플라스미드를 뽑은 뒤 유니버설 프라이머(Univarsal primer)인 SP6와 T7으로 염기분석을 하도록 NICEM(서울대학교 농생명과학공동기기원)에 의뢰하였다.
우선 pepbac 13-E4 프라이머로 89개의 BAC 클론 중 아가로즈 겔에서 밴드가 진한 4개의 BAC 클론(22, 38, 51, 69)을 선발하여 양 끝 염기서열을 분석하였다 (도 4 참조). 이 중 7개의 염기서열에서 그 일부분을 증폭하는 프라이머를 만들고, 다시 그 가운데 6개의 프라이머를 이용해 3개의 BAC 클론으로 이루어진 contig를 만들었다 (도 5 참조).
표 2. BAC contig를 제작하기 위한 프라이머
　 프라이머명 염기서열(5' - 3')
1 pepbac13-E4F TTACTCCCATAGCGAGTTCA (서열번호 7)
2 pepbac13-E4R AGTGTTCGTGCTAGGTTTCA (서열번호 8)
3 22_SP6_F_430bp CAGAATTTGGGTGGATCAAAGAG (서열번호 9)
4 22_SP6_R TCACCTCAAGTGTGATCTGCC (서열번호 10)
5 22_T7_F_440bp CCTTTGCCTGCATTATTCTTG (서열번호 11)
6 22_T7_R GCCCAAATTTATTCCCAAATGC (서열번호 12)
7 51_T7_F_450bp GCACTAAGGCTATTTTGAGAC (서열번호 13)
8 51_T7_R GACACAAGAGAGGCATCCAC (서열번호 14)
9 68_T7_F_470bp GAATTACAACAACAAGTGCAACT (서열번호 15)
10 68_T7_R CGTTGGCTTGAACGTAGTCAG (서열번호 16)
11 69_SP6_F_540bp CACCCAATAGCTTAACAAGGG (서열번호 17)
12 69_SP6_R CTTCAGCACCTCACTTCGCT (서열번호 18)
13 69_T7_F_450bp ACAAGTGCAACTAATCTCCATC (서열번호 19)
14 69_T7_R GCTTGAACGTAGTCAGAGTAAC (서열번호 20)
5) 분자 표지 개발
Contig를 구성하고 있는 22, 38, 51, 69번 BAC 클론의 양 끝 염기를 증폭하는 프라이머로 C. chacoense cv. PI260429, C. annuum cv.Early Calwonder를 PCR하여 그 염기 서열을 분석하였다. 염기 서열분석은 pGEM-T 벡터에 PCR 산물을 클로닝하여 유니버설 프라이머로 NICEM에 의뢰하였다. 그 가운데 22번 BAC 클론의 T7 방향과, 51번 BAC 클론의 SP6 방향의 끝 염기 서열에서 각각 2, 3개의 SNP를 확인했다. SNP를 포함하도록 HRM 분석용 프라이머를 2개 제작하여 다형성을 확인하고 공우성 분자표지로 개발하였다.
13번 BAC 클론의 draft 염기서열 분석한 자료에서 2개의 프라이머를 제작하여 C. chacoense cv. PI260429, C. annuum cv.Early Calwonder를 PCR한 결과 그 가운데 하나의 프라이머에서 다형성이 확인되었다. L 0 대립 유전자를 가진 동형접합체와 이형접합체 식물체에서 750bp의 핵산이 PCR 되고, L 4 대립 유전자의 동형접합체에서는 약한 1200bp의 핵산이 PCR 된다. 이 프라이머로 SCAR (sequence characterized amplified region) 분자표지를 개발하였다.
표 3. L 4 대립유전자를 가진 식물체를 선발하기 위한 분자표지
　 프라이머명 염기서열(5' - 3') 비고　
1 22T7150F CATGATTACATTTTATGTTGC (서열번호 1) 공우성표지
2 22T7150R AAAAGGAAGGTTCTCATTGTT (서열번호 2)
3 51SP6200F CATCATGGGTTAATGGATGTGAG (서열번호 3) 공우성표지
4 51SP6200R GAATTCACTAGTGATTGGCCATG (서열번호 4)
5 13END-2F GCACATCAGCAGGTTTAGTACG (서열번호 5) 동형접합저항성
구분표지
(저항성과 trans 연관)
6 13END-2R CCAACTGTCAAACCTCGGTT (서열번호 6)
6) TMV 저항성 분리 집단의 육성
착색단 고추의 시판품종인 Special(Enza Zaden, 네델란드 종자회사)은 L 4 대립유전자, Cupra 및 Maeserati (Enza Zaden, 네델란드 종자회사)는 L 3 를 가지고 있다. L 4 대립유전자는 C. chacoense cv. PI260429에서 유래되는 대립유전자로, 육종 과정에서 C. annuum에 그 대립유전자가 도입된 것이다. Special은 L 4 대립유전자를 이형접합체로, Cupra 및 Maeserati는 L 3 를 이형접합체로 가지고 있으므로, 이들을 심어 나온 식물체를 자가 교배하여 얻은 종자로 F2 집단을 만들어 TMV 저항성 분리집단으로 이용하였다. 또한 매운 고추 육종계통의 교배조합으로부터 육성된 BC10F2 집단을 이용하여 분자표지를 검정하였다.
7) F2 집단의 표현형의 결정
F2 집단의 표현형은 TMV P1 .2를 접종하여 확인하였다. TMV P1 .2를 접종한 Nicotiana tabacum cv. Samsun nn을 접종원으로 사용하였다. 접종원을 액체 질소로 얼린 다음 막자 사발로 곱게 마쇄하였다. 접종원 1g 당 5ml의 인산 완충액(0.615M K2HPO4, 0.385M KH2PO4, pH7.0)을 넣고 잘 섞은 뒤, 그 상징액을 접종용 완충액으로 사용하였다. 식물체에 접종할 때에는 식물의 본엽이 2~4장이 되는 때에 접종하였다. 접종할 때에는 제1, 2 본엽에 연마제(Carborandum, 300mesh)를 뿌리고, 손가락으로 접종용 완충액을 접종부위에 부드럽게 문질러 접종하였다. 접종 3일 후부터 표현형 결정이 가능하며, 과민성 반응(HR, hypersensitive response)이 나타나는 식물체를 저항성으로 과민성 반응이 나타나지 않는 식물체를 감수성으로 분류하였다.
8) F2 집단의 핵산 추출
식물체의 2~3cm 길이의 어린 잎을 2장 따 1.7ml의 마이크로원심분리 튜브에 넣었다. 식물체가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 4mm의 알루미늄 비드를 2개 넣고 Tissuelyser(Retsch, QIAGEN)을 이용하여 방향을 바꿔주며 3분간 분쇄한 다음, 60℃의 CTAB 핵산 추출 완충액(2% CTAB, 20mM EDTA, 100mM Tris-Cl pH 8.0, 1.4M NaCl)을 600㎕ 넣었다. 다시 PVP(Polyvinylpyrrolidone)를 0.5g, β-머캅토에탄올을 12.5㎕ 넣어 위 아래로 잘 섞은 다음 65℃의 항온 수조에서 1~2시간 반응시켰다. 반응이 끝나면 잠시 식힌 후, 클로로포름:이소아밀알코올(24:1) 용액을 700㎕ 넣었다. 4℃에서 12,000rpm 으로 15분 동안 원심분리하고, 상징액만을 새로운 마이크로원심분리 튜브에 취하였다. 상징액의 2배 부피의 4℃ 99% 에탄올이나 상징액과 동량의 이소프로판올을 넣고, -20℃에서 1~2시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 4℃, 12,000rpm 으로 10분 동안 원심분리하고, 상징액을 버렸다. 70%의 에탄올을 800㎕ 넣어, 핵산 침전물이 바닥에서 떨어지도록 마이크로원심분리 튜브를 톡톡 쳤다. 4℃, 12,000rpm 으로 10분 동안 원심분리한 다음, 상징액을 버렸다. 한 번 더 70% 에탄올로 핵산 침전물을 씻어 준 다음 공기 중에서 10시간 건조시켰다. 건조가 끝나면 50㎕의 TE 완충액(1mM EDTA, 10mM Tris-Cl)과 RNase(10㎕/ml)을 넣어 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 핵산은 분광광도계(ND-1000, Nanodrop Technologies, Inc)로 정량하였다.
9) 실시간(real time) PCR을 이용한 유전자형 결정
HRM 분석 (High resolution meting analysis)은 Rotorgene(Corbett Research, 호주) 실시간 PCR 장비로 수행하였다. PCR 반응액은 1XPCR 완충액(500mM KCl, 100mM Tris-Cl pH 8.3, 15mM의 MgCl2), 프라이머 0.25pM, 주형 핵산 100ng, dNTPs 0.25mM, SYTO9 0.25mM, 핵산중합효소 0.5U으로 구성하여 총 부피가 20㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 4분 동안 가열한 다음 50 사이클(95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 30초)을 반복한 뒤, 70℃~90℃ 온도 범위에서 0.1℃마다 형광을 측정하였다. C. chacoense cv. PI260429의 그래프와 유사한 식물체를 L4의 동형접합체로(R), C. annuumcv.EarlyCalsonder의 그래프와 유사한 식물체를 L+의 동형접합체(S)로 분류하였다. 두 지표식물과 다른 형태의 그래프를 보이는 식물체는 L4와 L+를 모두 갖는 이형접합체(H)로 분류하였다 (도 6 참조).
10) SCAR 분자표지를 이용한 유전자형 결정
SCAR 분자표지 분석은 MyCycler Thermal Cycle(BIO-RAD, 미국) 장비로 수행하였다. PCR 반응액은 1XPCR 완충액(500mM KCl, 100mM Tris-Cl pH 8.3, 15mM MgCl2), 프라이머 0.4pM, 주형 핵산 50ng, dNTPs 0.2mM, 핵산중합효소 0.5U으로 구성되며 총 부피가 25㎕가 되도록 하였다. PCR 반응은 95℃에서 4분 동안 가열한 다음 50 사이클(95℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 30초)을 반복한 뒤 72℃에서 5분 동안 가열한 뒤 반응을 종료하였다. PCR 산물은 1% 아가로스 겔에 PCR로 증폭한 핵산 산물을 로딩한 후, 전기영동하여 밴드를 확인하였다 (도 7 참조). 750bp의 강한 밴드가 없고, 1200bp의 약한 밴드가 증폭되는 L 4 동형접합체를 (-)로 표시하여 구별하였다.
실시예 1: 착색단 고추 집단에서 분자표지와 L 4 TMV 저항성 표현형의 공분 리 검정
착색단 고추인 Special F2 집단 44개의 식물체에 TMV P1 .2를 접종하여 표현형을 조사하고, 핵산을 추출하여 2개의 HRM 분자표지와 1개의 SCAR 분자표지로 유전자형을 분석하였다. 44개의 집단에서 1개의 개체를 제외한 43개의 개체에서 3 종류의 분자표지 모두에서 공동 분리되는 것을 확인하였다.
표 4. 표현형과 분자표지의 공분리 검정
　 표현형 HRM SCAR 　 표현형 HRM SCAR
C. chacoense R R (-) special - 23 R S
ECW S S 　 special - 24 R hetero
special - 1 R R (-) special - 27 - S
special - 2 R hetero 　 special - 28 R hetero
special - 4 R hetero 　 special - 29 R R (-)
special - 5 R hetero 　 special - 30 R hetero
special - 6 R R (-) special - 31 R R (-)
special - 7 S S 　 special - 32 R hetero
special - 8 R hetero 　 special - 33 R hetero
special - 9 R hetero 　 special - 34 R hetero
special - 10 R R (-) special - 35 R R (-)
special - 11 R hetero 　 special - 36 R R (-)
special - 12 S S 　 special - 37 S S
special - 14 R hetero 　 special - 38 - R (-)
special - 15 S S 　 special - 39 - S
special - 17 R R (-) special - 40 R hetero
special - 18 R R (-) special - 41 R R (-)
special - 19 R R (-) special - 43 R R (-)
special - 20 - R (-) special - 44 R R (-)
special - 21 - R (-) 　 　 　 　
실시예 2: 착색단 고추 집단에서 분자표지와 L 3 TMV 저항성 표현형의 공분리 검정
3개의 분자표지 가운데 22_T7_RT_150bp 프라이머를 이용하여 L 3 저항성유전 자가 분리하는 파프리카의 육종 계통에 TMV P1 .2로 접종한 표현형과, 핵산을 추출하여 HRM 분석을 한 유전자형을 비교하여 공동 분리가 되는지 확인해 보았다. L 3 대립유전자를 갖고 있는 Cupra를 육종 소재로 한 육종 계통에서는 17개체 가운데 하나를 제외하고 공동 분리되었고, 마찬가지로 L 3 대립유전자를 갖고 있는 Maserati를 육종 소재로 한 육종 계통에서는 10개체 모두 공동 분리되었다.
표 5. L 3 대립유전자를 가지고 있는 육종 계통에 대해 공동 분리 검정
육종소재 TMV 저항성 대립유전자 개체번호 표현형 유전자형
Cupra L3 125-09 S S
Cupra L3 125-09' R R
Cupra L3 125-18 R R
Cupra L3 125-32 R H
Cupra L3 126-07 S S
Cupra L3 126-29 S S
Cupra L3 127-02 R R
Cupra L3 127-12 R R
Cupra L3 128-02 R H
Cupra L3 128-05 S S
Cupra L3 129-19 S S
Cupra L3 129-34 R H
Cupra L3 130-35 R H
Cupra L3 131-13 R R
Cupra L3 131-14 R R
Cupra L3 131-22 R R
Cupra L3 131-31 R R
Maeserati L3 155-02 R R
Maeserati L3 155-21 R R
Maeserati L3 155-36 R R
Maeserati L3 155-37 R R
Maeserati L3 156-12 S S
Maeserati L3 156-14 S S
Maeserati L3 156-25 S S
Maeserati L3 159-13 R H
Maeserati L3 159-19 R R
Maeserati L3 159-21 R R
실시예 3: 매운맛 고추 집단에서 분자표지와 L 4 TMV 저항성 표현형의 공분 리 검정
3개의 분자표지 가운데 pepBAC_13_end-2 프라이머를 이용하여 L 4 저항성 유전자가 분리하는 매운 고추 육종 계통에 TMV P1 .2로 접종한 표현형과, 핵산을 추출하여 HRM 분석을 한 유전자형을 비교하여 공동 분리가 되는지 확인해 보았다. L 4 대립유전자를 갖고 있는 매운 고추 102개체 분리집단에서는 동형접합 저항성 개체의 경우 밴드가 증폭되지 않았고, 감수성이거나 이형접합체는 밴드가 증폭되는 것으로 보아 이 표지는 L4 저항성 유전자와 trans로 연관된 것으로 보이며 18개의 저항성 개체 중 2 개체에서 재조합 개체가 발견되었으며 감수성이거나 이형접합체 84 개체에서는 모두 밴드가 증폭되었다.
도 1은 89개의 BAC 클론을 BAC fingerprinting하여, 그 결과를 FPC 프로그램에 적용하여 89개의 BAC 클론이 하나의 contig가 된 그림이다.
도 2는 LRR, R7a, R7b 프라이머로 모두 증폭된 22개의 BAC 클론이 LRR 프라이머로 PCR한 핵산의 염기서열의 유사성을 기준으로 10개의 그룹화된 그림이다.
도 3은 SSR 분자표지를 이용해 BAC 클론 중 20번의 염기서열이 11번 염색체의 L 유전자좌와 가까운 곳에 있다는 것을 보여주는 그림이다.
도 4는 pepbac 13E-4 프라이머로 PCR 하여 그 중 4개의 BAC 클론을 선발하는 그림이다.
도 5는 pepbac 13E-4 프라이머로 선발된 BAC 클론의 양 끝 염기서열로부터 만든 6개의 프라이머를 이용하여 13개의 BAC 클론을 포함하는 contig를 만든 모습이다.
도 6은 22_T7_RT_150bp 프라이머(상단 패널) 및 51_SP6_RT_200bp 프라이머(하단 패널)를 이용하여 HRM 분석을 하는 그림이다.
R : L 4 L 4 L 4 대립유전자의 동형접합체
S : L 0 L 0 L 0 대립유전자의 동형접합체
H : L 4 L 0 이형접합체
도 7은 pepbac_13_end-2 프라이머를 이용하여 SCAR 분자표지를 이용하여 유전자형을 결정하는 그림이다.
(-) : 750bp 크기의 밴드가 없는 경우
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Primer set, method and kit for selecting TMV-resistant pepper cultivar <130> PN07045 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22T7150F primer <400> 1 catgattaca ttttatgttg c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22T7150R primer <400> 2 aaaaggaagg ttctcattgt t 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 51SP6200F primer <400> 3 catcatgggt taatggatgt gag 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 51SP6200R primer <400> 4 gaattcacta gtgattggcc atg 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13END-2F primer <400> 5 gcacatcagc aggtttagta cg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13END-2R primer <400> 6 ccaactgtca aacctcggtt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pepbac13-E4F primer <400> 7 ttactcccat agcgagttca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pepbac13-E4R primer <400> 8 agtgttcgtg ctaggtttca 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22_SP6_F_430bp primer <400> 9 cagaatttgg gtggatcaaa gag 23 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22_SP6_R primer <400> 10 tcacctcaag tgtgatctgc c 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22_T7_F_440bp primer <400> 11 cctttgcctg cattattctt g 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22_T7_R primer <400> 12 gcccaaattt attcccaaat gc 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 51_T7_F_450bp primer <400> 13 gcactaaggc tattttgaga c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 51_T7_R primer <400> 14 gacacaagag aggcatccac 20 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 68_T7_F_470bp primer <400> 15 gaattacaac aacaagtgca act 23 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 68_T7_R primer <400> 16 cgttggcttg aacgtagtca g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 69_SP6_F_540bp primer <400> 17 cacccaatag cttaacaagg g 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 69_SP6_R primer <400> 18 cttcagcacc tcacttcgct 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 69_T7_F_450bp primer <400> 19 acaagtgcaa ctaatctcca tc 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 69_T7_R primer <400> 20 gcttgaacgt agtcagagta ac 22

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
  4. 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.
  7. 제3항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, TMV (Tobacco Mosaic Viurs)에 대해 저항성인 고추 품종을 선별하기 위한 키트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
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