KR20230059455A - Tmv 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 TMV(Tobacco Mosaic Virus)에 대해 저항성 또는 이병성인 고추 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SNP 마커를 고추 작물에 적용하면, TMV에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 TMV 저항성 고추 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 고추 작물 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 TMV(Tobacco Mosaic Virus)에 대해 저항성 또는 이병성인 고추 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별방법에 관한 것이다.
TMV(Tobacco Mosaic Virus)는 토바모바이러스군(Tobamovirus)에 속하며, 단일가닥 리보핵산으로 이루어진 바이러스이다. TMV는 전 세계적으로 발견되고 있으며, 200여 종의 식물에 감염 사례가 보고될 정도로 기주 범위가 넓다. TMV에 감염되면 모자이크, 왜성화, 꽃의 탈색, 잎의 뒤틀림 등의 병징이 나타나 식물의 생육에 악영향을 미치며, 잎이나 줄기 외에도 과실에까지 병징이 발생하여 상품 가치를 떨어뜨린다. 한국에서는 주로 담배, 고추, 토마토에 큰 피해를 입히는 것으로 알려졌다.
TMV의 매개충은 아직 발견되지 않았으며 주로 기계적인 접촉이나 식물체의 잔해가 남아 있는 토양, 종자 감염에 의해 전염된다. TMV의 방제를 위해서는 토양의 소독, 농기구와 종자의 철저한 관리가 필요하다. 그러나 방제 방법이 간접적이고, 많은 노력이 필요하기 때문에 TMV에 저항성을 가진 품종을 육성하는 것이 보다 효율적이고 경제적인 방제 방법이 될 것이다.
고추에서 발견된 TMV 저항성은 L 유전자좌에 있는 유전자에 의해 유전되는 것으로 보이며, 지금까지 L 0 , L 1 , L 2 , L 3 , L 4 5개의 대립유전자가 보고되었다. 각 대립유전자는 TMV의 strain에 따라 서로 다른 저항성과 감수성 반응을 보이며, 이들 중 L 4 대립유전자는 지금까지 발견된 모든 TMV strain에 대해 저항성을 나타내는 것으로 알려졌다.
TMV 저항성 품종을 육성하기 위해서는 직접 병을 접종하여 그 표현형을 보고 다음 세대로 진전하는 방법을 사용하였다. 그러나 이런 방법은 유전자형을 알기 위하여 후대에서 저항성과 이병성의 비율을 확인해야 하기 때문에 많은 시간, 돈, 공간, 노력이 필요하다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종을 효율적으로 판별하기 위한 분자마커를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, TMV 저항성 계통 및 이병성 계통의 유전체 염기서열 비교분석 및 다형성 확인을 통하여 신규 SNP 분자마커를 도출하고, 이를 토대로 SNP 분자마커 증폭용 프라이머 세트 및 프로브를 개발하여 TMV 저항성 여부를 용이하게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 TMV(Tobacco Mosaic Viurs) 저항성 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프라이머 세트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프로브 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 마이크로어레이를 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 서열번호 2로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브; b) 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브; c) 서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브; 및 d) 서열번호 10으로 표시되는 프라이머; 서열번호 11로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 12로 표시되는 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV(Tobacco Mosaic Viurs) 저항성 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; b) 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트; c) 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 및 d) 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브; b) 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브; c) 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브; 및 d) 서열번호 12로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프로브 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 상기 프로브; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 고추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트 또는 상기 프로브 조성물을 이용하여 혼성화 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열; b) 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열; c) 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열; 및 d) 서열번호 12로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에 따른 SNP 마커를 고추 작물에 적용하면, TMV에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 방법으로 육성한 TMV 저항성 고추 품종의 보급은 재배 농가 및 소비자에게도 고품질의 고추 작물 생산 및 공급을 가능하게 할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 TMV(Tobacco Mosaic Virus) 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 도 1에 표시된 염기서열(서열번호 13)의 107번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 1 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 C이다. 또한, TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 혼성화 부위(L1_AF1 및 L1_AR1)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(L1_AP1)를 각각 볼드체 및 밑줄로 표시하여 나타내었다.
도 2는 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L1_AF1, L1_AR1 및 L1_AP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)는 54℃인 경우 이병성(SS)으로, 용융 온도가 63℃인 경우 저항성(RR)으로 판별한다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 도 3에 표시된 염기서열(서열번호 14)의 99번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 3 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 A이다. 또한, TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 혼성화 부위(L3_BF1 및 L3_BR1)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(L3_BP1)를 각각 볼드체 및 밑줄로 표시하여 나타내었다.
도 4는 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L3_BF1, L3_BR1 및 L3_BP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)는 63℃인 경우 이병성(SS)으로, 용융 온도가 70℃인 경우 저항성(RR)으로 판별한다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 도 5에 표시된 염기서열(서열번호 15)의 158번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 A이고, L 4 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 G이다. 또한, TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 혼성화 부위(L4_MF1 및 L4_MR1)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(L4_MP1)를 각각 볼드체 및 밑줄로 표시하여 나타내었다.
도 6은 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L4_MF1, L4_MR1 및 L4_MP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RS는 중도저항성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)는 58.5℃인 경우 이병성(SS)으로, 용융 온도가 65.5℃인 경우 저항성(RR)으로 판별한다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 도 7에 표시된 염기서열(서열번호 16)의 145번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 4 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 A이다. 또한, TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 혼성화 부위(L4_OF1 및 L4_OR1)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(L4_OP1)를 각각 볼드체 및 밑줄로 표시하여 나타내었다.
도 8은 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L4_OF1, L4_OR1 및 L4_OP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RS는 중도저항성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)가 65.5℃인 경우 저항성(RR) 또는 중도저항성(RS)으로 판별한다.
도 2는 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L1_AF1, L1_AR1 및 L1_AP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)는 54℃인 경우 이병성(SS)으로, 용융 온도가 63℃인 경우 저항성(RR)으로 판별한다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 도 3에 표시된 염기서열(서열번호 14)의 99번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 3 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 A이다. 또한, TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 혼성화 부위(L3_BF1 및 L3_BR1)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(L3_BP1)를 각각 볼드체 및 밑줄로 표시하여 나타내었다.
도 4는 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L3_BF1, L3_BR1 및 L3_BP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)는 63℃인 경우 이병성(SS)으로, 용융 온도가 70℃인 경우 저항성(RR)으로 판별한다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 도 5에 표시된 염기서열(서열번호 15)의 158번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 A이고, L 4 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 G이다. 또한, TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 혼성화 부위(L4_MF1 및 L4_MR1)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(L4_MP1)를 각각 볼드체 및 밑줄로 표시하여 나타내었다.
도 6은 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L4_MF1, L4_MR1 및 L4_MP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RS는 중도저항성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)는 58.5℃인 경우 이병성(SS)으로, 용융 온도가 65.5℃인 경우 저항성(RR)으로 판별한다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따라 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종의 염기서열을 정렬하여 나타낸 도로, 여기서 단일염기다형성(SNP)을 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 도 7에 표시된 염기서열(서열번호 16)의 145번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 4 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 A이다. 또한, TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 고추 품종 판별을 위한 본 발명의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 혼성화 부위(L4_OF1 및 L4_OR1)와 SNP 프로브(SNP probe) 혼성화 부위(L4_OP1)를 각각 볼드체 및 밑줄로 표시하여 나타내었다.
도 8은 본 발명의 TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L4_OF1, L4_OR1 및 L4_OP1)를 이용하여 HRM(high resolution melting) 분석한 결과를 나타낸 그래프로, 여기서, SS는 이병성을, RS는 중도저항성을, RR은 저항성을 나타낸다. 용융 온도(melting temperature)가 65.5℃인 경우 저항성(RR) 또는 중도저항성(RS)으로 판별한다.
본 발명은 TMV(Tobacco Mosaic Virus)에 대해 저항성 또는 이병성인 고추 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별방법에 관한 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 a) 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 서열번호 2로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브; b) 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브; c) 서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브; 및 d) 서열번호 10으로 표시되는 프라이머; 서열번호 11로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 12로 표시되는 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV(Tobacco Mosaic Viurs) 저항성 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "TMV(Tobacco Mosaic Viurs)"는 Tobamovirus군에 속하며, 입자의 모양은 간상(桿牀)이고, 크기는 300×15 nm이다. 물리적 성질로서 불활화온도는 90℃, 내희석성은 10-6배, 내보존성으로 병든 즙액중에서는 실온에서 1개월 이상 병원성을 갖고 있으나 건조시킨 병든 잎에서는 수십 년을 지나도 감염력을 유지한다. TMV는 종자전염이 되고, 연작지 토양내 병든 식물의 유체 등도 1차 전염원으로 중요하다. TMV는 진딧물에 의하여 전염되는 것이 아니고, 접촉전염이 되는데 자연감염 기주가 전염원으로 주위에 있으면 발병이 잘 된다. 또한 이 바이러스는 기주 범위가 넓어서 가지과, 콩과 등 쌍자엽식물을 주로하여 22과 200종 이상 침해한다. 특히 토마토, 피망, 고추, 담배가 주로 발병되는 작물이다.
본 발명에서 용어 "판별"은 고추 품종 시료로부터, 본 발명의 프라이머 세트 또는 프로브에 의해 TMW에 대한 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판단하여 구별하는 것을 의미하며, '구별'과 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머(primer)"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로 작용한다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 DNA 삽입(intercalating) 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 표지 물질은 FAM 또는 HEX일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 대립유전자(allele) 특이적인 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머 세트"는 복수의 프라이머를 의미한다. 또한, 프라이머 세트는 프라이머를 수용하기 위한 컨테이너를 더 포함할 수 있다. 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 염기 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약과 4가지 뉴클레오사이트 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 삽입물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 프라이머는 포스포르아미다이트법, 포스포디 에스테르법, 디에틸포스모르아미다이트법 등을 이용하는 화학 합성법을 통하여 제조될 수 있다. 또한, 프라이머 염기서열은 당해 분야에 공지된 수단에 의해 변형될 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.
일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.
TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트, 또는 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 세트로 이루어질 수 있다(표 2).
또한, TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한, 본 발명의 프로브는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열, 서열번호 6으로 표시되는 염기서열, 서열번호 9로 표시되는 염기서열, 또는 서열번호 12로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다(표 2).
상기 프라이머 세트는 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 또는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있으며, 상기 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 또는 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종 간 구별을 위한 SNP(single nuclotide polymorphism) 부위를 포함한 것일 수 있다(도 1, 도 3, 도 5 및 도 7).
상기 'SNP'란 유전체 상에서 A, T, C, G로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 서열번호 2로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브를 포함하는 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물은, SNP 위치 염기를 포함하는 상기 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화되어 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브를 포함하는 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물은, SNP 위치 염기를 포함하는 상기 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화되어 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브를 포함하는 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물은, SNP 위치 염기를 포함하는 상기 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화되어 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 서열번호 10으로 표시되는 프라이머; 서열번호 11로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 12로 표시되는 프로브를 포함하는 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물은, SNP 위치 염기를 포함하는 상기 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화되어 SNP 위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 13의 107번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 1 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 C이다.
본 발명의 일실시예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 14의 99번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 3 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 A이다.
본 발명의 일실시예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 15의 158번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 A이고, L 4 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 G이다.
본 발명의 일실시예에 따른 SNP 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 16의 145번째 위치 염기가 TMV 이병성(S) 고추 품종의 경우 G이고, L 4 저항성 유전자가 존재하는 저항성(R) 고추 품종의 경우 A이다.
본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 프라이머, 서열번호 2로 표시되는 프라이머 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브는, 이에 제한되지는 않으나, 상기 단일 SNP 염기, G 또는 C를 포함하는 10개 이상의 연속 염기, 15개 이상의 연속 염기, 또는 20개 이상의 연속 염기와 상보적으로 혼성화, 증폭됨에 의해 TMV 저항성 L 1 유전자를 포함한 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 4로 표시되는 프라이머, 서열번호 5로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브는, 이에 제한되지는 않으나, 상기 단일 SNP 염기, G 또는 A를 포함하는 10개 이상의 연속 염기, 15개 이상의 연속 염기, 또는 20개 이상의 연속 염기와 상보적으로 혼성화, 증폭됨에 의해 TMV 저항성 L 3 유전자를 포함한 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 7로 표시되는 프라이머, 서열번호 8로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 9로 표시되는 프로브로 표시되는 프로브는, 이에 제한되지는 않으나, 상기 단일 SNP 염기, A 또는 G를 포함하는 10개 이상의 연속 염기, 15개 이상의 연속 염기, 또는 20개 이상의 연속 염기와 상보적으로 혼성화, 증폭됨에 의해 TMV 저항성 L 4 유전자를 포함한 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 10으로 표시되는 프라이머, 서열번호 11로 표시되는 프라이머, 및 서열번호 12로 표시되는 프로브는, 이에 제한되지는 않으나, 상기 단일 SNP 염기, G 또는 A를 포함하는 10개 이상의 연속 염기, 15개 이상의 연속 염기, 또는 20개 이상의 연속 염기와 상보적으로 혼성화, 증폭됨에 의해 TMV 저항성 L 4 유전자를 포함한 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트; b) 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트; c) 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 및 d) 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종 판별용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 서열번호 4 및 5의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 서열번호 7 및 8의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 10 또는 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프라이머 세트는 SNP 위치의 주변 서열로부터 제작하였으며, 이에 제한되지는 않으나, PCR로 증폭하고 전기영동을 통해 산물을 확인함으로써 품종을 식별하는 방법에 적용될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브; b) 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브; c) 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브; 및 d) 서열번호 12로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프로브 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종 판별용 프로브는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드; 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프로브는 SNP 위치를 포함하여 제작하였으며, 이에 제한되지는 않으나, SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 특이적 혼성화를 통해, TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종을 판별할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트 또는 상기 프로브; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼(buffer) 등을 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 고추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트 또는 제3항의 프로브 조성물을 이용하여 혼성화 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 고추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 알려진 통상적인 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 그 방법은 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 분리된 고추 시료의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. PCR은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 고추 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 FAM 또는 HEX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종 판별을 위한 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 시퀀싱, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종 판별을 위한 방법은 PCR 증폭 산물에 대하여 HRM 분석함으로써 TMV 저항성 여부를 판단하여 판별하였다. 본 발명에서 사용하는 HRM(high resolution melting) 분석은 한 개의 염기 서열 차이에 의하여 달라지는 용융 온도(melting temperature)를 구분해 줌으로써 염기서열 분석 없이 DNA 조각의 염기서열 차이를 보여줄 수 있는 분석방법으로서, 이러한 HRM 분석 결과는 두 DNA 샘플 간 용해 곡선(melting curve)에 있어 차이를 보여주었다.
상세하게는, TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L1_AF1, L1_AR1 및 L1_AP1)를 이용하여 HRM 분석한 결과, TMV 이병성(SS) 고추 품종의 경우 용융 온도 54℃를 나타내었고, L 1 저항성 유전자가 존재하는 저항성(RR) 고추 품종의 경우 용융 온도 63℃를 나타내었다(도 2).
또한, TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L3_BF1, L3_BR1 및 L3_BP1)를 이용하여 HRM 분석한 결과, TMV 이병성(SS) 고추 품종의 경우 용융 온도 63℃를 나타내었고, L 3 저항성 유전자가 존재하는 저항성(RR) 고추 품종의 경우 용융 온도 70℃를 나타내었다(도 4).
또한, TMV 저항성 및 이병성 판별용 프라이머 세트 및 프로브(L4_MF1, L4_MR1 및 L4_MP1)를 이용하여 HRM 분석한 결과, TMV 이병성(SS) 고추 품종의 경우 용융 온도 58.5℃를 나타내었고, L 4 저항성 유전자가 존재하는 저항성(RR) 고추 품종의 경우 용융 온도 65.5℃를 나타내었다(도 6).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열; b) 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열; c) 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열; 및 d) 서열번호 12로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명에서 TMV 저항성 고추 품종 또는 이병성 고추 품종 판별용 마이크로어레이는 본 발명의 SNP 마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: TMV
저항성 고추(R) 및 이병성 고추(S) 판별을 위한 마커 제조
고추에 발생하는 담배모자이크바이러스(TMV; Tobacco Mosaic Viurs) 저항성 유전자의 참조서열은 Sol Genomics Network(https://solgenomics.net/)에서 얻었다. 구체적으로, 고추 L 유전자좌와 연관된 분자마커를 개발하기 위해 L 유전자형(L 0 , L 1 , L 2 , L 3 및 L 4 )으로 알려진 다섯 개의 고추 유전자원(표 1 참조) 염기서열과 Sol Genomics Network 내 Pepper 1.55v 염기서열 분석 결과를 바탕으로 TMV 저항성 유전자 부위를 확인하였다. 이에 따라, 저항성/이병성 유전자원의 유전자 서열 분석 결과를 비교하여, 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)을 확인하고 혼성화 프로브(Hybprobe; hybridization probe) 마커를 제작하였다.
실시예 1-1: 고추
L
유전자 염기서열 분석
Sol Genomics Network 내 Pepper1.55 염기서열에서 TMV 저항성 유전자 부위를 확인하고, C. annuum Early California Wonder(ECW), C. annuum Tisana, C. annuum Criollo de Morelos 334 (CM334), C. chinense PI 159236, C. chacoense PI 260429의 염기서열을 분석하여 L 유전자를 확인하였다. 염기서열 분석에 사용된 고추 유전자원에 관한 정보를 하기 표 1에 정리하여 나타내었다. 구체적으로, ECW는 이병성이며, Tisana는 L 1 저항성 유전자를 가지고 있으며, CM334는 L 2 , PI159236은 L 3 , PI260429는 L 4 저항성 유전자를 가지고 있다.
실시예 1-2: TMV 저항성 고추(R) 및 이병성 고추(S) 판별을 위한 HybProbe 마커 제작
염기서열 분석을 통한 TMV 저항성/이병성 계통의 L 유전자 정보를 비교하여 SNP를 확인하고, HybProbe 마커를 제작하였다. 하기 표 2에 개발된 마커 목록을 정리하여 나타내었다.
실시예 2: TMV 저항성 고추(R) 및 이병성 고추(S) 판별을 위한 HybProbe (hybridization probe) 용융 분석
상기 실시예 1에서 제작된 분자마커는 LightCycler 96(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)를 사용하여 HMR(high resolution melting) 분석을 수행하였다. 분석 조건은 xx ℃에서 xx 분 동안 변성시킨 다음, xx ℃에서 xx 초 동안 변성(denaturation), xx ℃에서 xx 초 동안 프라이머 결합(annealing), xx ℃에서 xx 초 동안 연장(extention)을 xx 사이클을 실시하였고, 마지막으로 High Resolution Melting 단계에서 xx ℃에서 xx 초, xx ℃에서 xx 초 및 xx ℃에서 x 초로 PCR을 종결하였다.
(* 상기 PCR 조건을 기재하여 주시기 바랍니다.)
도 1, 도 3, 도 5 및 도 7은 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 판별용 분자마커에 의해 확인되는 단일염기다형성(SNP) 부위 및 증폭 부위를 나타낸 것이다. 또한, 도 2, 도 4, 도 6 및 도 8은 TMV 저항성(R) 및 이병성(S) 판별용 분자마커를 이용하여 HybProbe 용융 분석을 실시한 결과를 나타낸 그래프이다. 결과와 같이 저항성 고추 품종[RR]과 이병성 고추 품종[SS]이 상이한 용융 피크(melting peak)를 나타내는 것을 확인하였다.
실시예 3: TMV
저항성 고추(R) 및 이병성 고추(S) 확인
상기 실시예 1에서 개발한 분자마커의 유효성을 검정하고자, 군산 파프리카 시험장의 F1 품종 및 저항성/이병성 계통을 사용하였다. 상기 개발된 마커의 유효성 검정 및 유전자형 분석 결과를 하기 표 3에 정리하여 나타내었다.
결과적으로, 고추 유전자 L 1 , L 3 , L 4 의 서열 특이적인 SNP를 기반으로 하는 HybProbe 마커를 개발함을 확인하였다.
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L4_MP1
<400> 9
gaaagatcat tttggcttga a 21
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L4_OF2
<400> 10
ctgcatctgt ggaattgtcc agaaatagaa 30
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L4_OR2
<400> 11
tcttcgtcac tgccatcgtg gcg 23
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L4_OP1
<400> 12
agaaactggt gaacagtcga a 21
<210> 13
<211> 240
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMV L1 allele
<400> 13
gacttaaagg atgacaacaa tctgaatcag ctacaggtaa aattgaagga aagcctaaag 60
ggaaaaagat ttcttgttgt ccttgatgac ttgtggaatg atgactctga tgagtgggat 120
gacttgaaaa atctttttgt acaaggagct atgggaagta agatccttgt gacgacacgt 180
aaggaggatg ttgccttgat gatgggtaat ggggcaatca atgtggagac tctgtctgat 240
240
<210> 14
<211> 180
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMV L3 allele
<400> 14
ccagaacttg aagaggttgg aaagcgaatt gcagacaagt gcaaaggatt gcctttagct 60
ctaaaggcac ttgctggtat tttatgccgc aaatcagaag tgtacgagtg gaaaaacgtc 120
ttaagaagtg aaatatggga gctgccaagg cgtaagaatg gtatattacc agagttgatg 180
180
<210> 15
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMV L4 allele_1
<400> 15
agaatgattg aaaaagagag attgattgac cgtttattgt caagtgattc aaatggagaa 60
aatctgactg ttgtccctat tgttggaatg gggggcgtgg gcaagacaac acttgctaaa 120
attgtttaca acgataagaa ggtgaaagat cattttggct tgaaagcttg gttttgtgtt 180
tcggaggcat atgatgcttt cagaataaca aaaggattac ttcaagaaat tggatcattc 240
gacttaaagg atgacaacaa tcttaatcag ctacaggtaa aattgaagga aagcctaaag 300
300
<210> 16
<211> 240
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMV L4 allele_2
<400> 16
ctgccagaat gtatgcagga actccttcca tctcttaagg aactgcatct gtggaattgt 60
ccagaaatag aatcctttcc tgatggagga ttgcccttca atttacaact cctcgtgatc 120
aactattgcg agaaactggt gaacagtcga aaggagtggc gtctacagag actccattct 180
ctcagagagt tgttcatccg ccacgatggc agtgacgaag agattgttgg tggtgagaat 240
240
Claims (4)
- a) 서열번호 1로 표시되는 프라이머; 서열번호 2로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3으로 표시되는 프로브;
b) 서열번호 4로 표시되는 프라이머; 서열번호 5로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 프로브;
c) 서열번호 7로 표시되는 프라이머; 서열번호 8로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 9로 표시되는 프로브; 및
d) 서열번호 10으로 표시되는 프라이머; 서열번호 11로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 12로 표시되는 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV(Tobacco Mosaic Viurs) 저항성 또는 이병성 고추 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물. - a) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트;
b) 서열번호 4 및 5로 표시되는 프라이머 세트;
c) 서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트; 및
d) 서열번호 10 및 11로 표시되는 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프라이머 세트. - a) 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브;
b) 서열번호 6으로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브;
c) 서열번호 9로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브; 및
d) 서열번호 12로 표시되는 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 프로브 조성물. - a) 고추 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트 또는 제3항의 프로브 조성물을 이용하여 혼성화 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, TMV 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210143667A KR102668083B1 (ko) | 2021-10-26 | 2021-10-26 | Tmv 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210143667A KR102668083B1 (ko) | 2021-10-26 | 2021-10-26 | Tmv 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| KR102668083B1 KR102668083B1 (ko) | 2024-05-22 |
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ID=86380784
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210143667A KR102668083B1 (ko) | 2021-10-26 | 2021-10-26 | Tmv 저항성 또는 이병성 고추 품종 판별용 분자마커 및 이의 용도 |
Country Status (1)
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR20090085839A (ko) * | 2008-02-05 | 2009-08-10 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Ｔｍｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트,방법 및 키트 |
| KR20150047857A (ko) * | 2013-10-25 | 2015-05-06 | 솔젠트 (주) | 고추 병 저항성 품종 선발용 프라이머 세트 |
| KR20170065110A (ko) * | 2015-12-03 | 2017-06-13 | 서울대학교산학협력단 | 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
-
2021
- 2021-10-26 KR KR1020210143667A patent/KR102668083B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20090085839A (ko) * | 2008-02-05 | 2009-08-10 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Ｔｍｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트,방법 및 키트 |
| KR100984169B1 (ko) | 2008-02-05 | 2010-09-28 | 재단법인서울대학교산학협력재단 | Ｔｍｖ 저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머 세트,방법 및 키트 |
| KR20150047857A (ko) * | 2013-10-25 | 2015-05-06 | 솔젠트 (주) | 고추 병 저항성 품종 선발용 프라이머 세트 |
| KR20170065110A (ko) * | 2015-12-03 | 2017-06-13 | 서울대학교산학협력단 | 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102668083B1 (ko) | 2024-05-22 |
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