KR102121570B1 - 인삼 품종 또는 자원의 판별 및 분류를 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인삼 품종 또는 자원의 판별 및 분류를 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 다양한 인삼 품종과 육종 계통, 재래종 및 산삼 등의 유전형을 구별할 수 있으므로, 인삼의 품종 개발, 품종 보호 및 종자 순도 유지에 효율적인 바이오 마커로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 인삼 품종 또는 자원의 판별 및 분류를 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng)은 전 세계적으로 가치가 높은 약용식물로서 널리 사용되어 왔다. 이런 식물의 경우에 우수 품종 개발이 중요하며 육종의 효율성을 높이기 위해 분자마커를 중요 수단으로 사용하고 있다. 하지만, 인삼의 경우에 복잡한 유전체 구조 때문에 분자마커의 개발이 매우 어려우며 지금까지 육종에 사용할만한 고품질의 마커가 많이 개발되어 있지 않아 분자육종 기반이 잘 갖춰져 있지 않은 실정이다.
인삼은 전장유전체배가(whole-genome duplication) 현상을 겪으면서 핵 유전체 내부에 거의 모든 지역이 2카피 이상으로 된 동형 지역이 존재하는데, 이를 고려하지 않고 분자마커를 개발하면 그 해석과 적용에 오류가 있다. 이를 해결하기 위해 단일 유전자 지역만을 탐색하여 SNP를 발굴하고 해당지역에서 분자마커를 개발하는 과정이 필수적이다. 또한, 기존의 아가로스 겔 기반의 방식은 실험과정이 번거롭고 대용량의 분석에 적합하지 않다. 그러나 형광표지 마커의 경우에 실험 과정과 결과 확인 과정이 하나의 단계로 구성되어 있어 기존의 방식에 비해 매우 효율적으로 다수의 유전자원에 대한 유전자형 분석을 수행할 수 있다. 분자마커를 육종에 효율적으로 사용하기 위해서는 간편하게 대량의 자원을 분석할 수 있는 수단이 필요한데, 이를 위해 단일 유전자 지역의 SNP(single nucleotide polymorphism) 정보를 기반으로 한 형광표지 마커가 적합할 것으로 사료된다.
한편, 한국등록특허 제1699518호에는 '인삼 품종 금풍과 황숙 재래종을 판별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1375952호에는 '고려인삼 천풍 품종 판별용 SNP 프라이머 및 이를 이용한 고려인삼 천풍 품종 판별 방법'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '인삼 품종 또는 자원의 판별 및 분류를 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 다양한 인삼자원으로부터 획득한 핵 및 엽록체 게놈 서열의 비교분석을 통해 단일 유전자 지역에 나타나면서, 품종 또는 육종 계통에 특이적인 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커 14개를 선별한 후 상기 마커를 증폭시키기 위한 KASP용 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 프라이머 세트를 사용하여 유전형 분석을 수행한 결과, 본 발명의 분자마커 14개 단독 혹은 전체의 조합을 통해 15개 인삼 품종을 포함한 94개 인삼자원의 유전형을 빠르게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 42로 표시되는 올리고뉴클레오티드에서 서열번호 1부터 시작하여 인접한 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 14개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 판별을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 KASP용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 판별을 위한 KASP용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 KASP용 프라이머 세트는 다양한 인삼 품종과 재래종 및 산삼 등의 유전형을 구별할 수 있으므로, 인삼의 품종 개발, 품종 보호 및 종자 순도 유지에 효율적인 바이오 마커로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 이질사배체(allotetraploid) 고려인삼에서 단일-좌-특이적 SNP를 기반으로 인삼 품종 판별용 KASP 마커의 개발 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 23개 인삼 개체의 엽록체 유전체 지도 및 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 14개 KASP 마커를 이용한 15개의 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원의 유전형을 확인한 결과이다. 초록색 점은 동형접합체(homozygous) AA 유전형으로 HEX 형광물질로 인해 y축에 가깝게 위치하며, 파란색 점은 동형접합체 BB 유전형으로 FAM 형광물질로 인해 x축에 가깝게 위치하며, 빨간색 점은 이형접합체(heterozygous) 유전형(AB)으로 FAM 및 HEX 형광물질을 모두 가지고 있어, x축과 y축의 중간에 나타나며, 회색 점은 NTCs(no template control)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 14개 KASP 마커를 이용하여 15개의 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원의 유전형을 분석한 결과를 토대로 계통 분류를 수행한 결과이다.
도 2는 23개 인삼 개체의 엽록체 유전체 지도 및 SNP 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 14개 KASP 마커를 이용한 15개의 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원의 유전형을 확인한 결과이다. 초록색 점은 동형접합체(homozygous) AA 유전형으로 HEX 형광물질로 인해 y축에 가깝게 위치하며, 파란색 점은 동형접합체 BB 유전형으로 FAM 형광물질로 인해 x축에 가깝게 위치하며, 빨간색 점은 이형접합체(heterozygous) 유전형(AB)으로 FAM 및 HEX 형광물질을 모두 가지고 있어, x축과 y축의 중간에 나타나며, 회색 점은 NTCs(no template control)를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 14개 KASP 마커를 이용하여 15개의 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원의 유전형을 분석한 결과를 토대로 계통 분류를 수행한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 42로 표시되는 올리고뉴클레오티드에서 서열번호 1부터 시작하여 인접한 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 14개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 판별을 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 바람직하게는 서열번호 1부터 시작하여 인접한 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 14개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 인삼 품종은 천풍, 연풍, 고풍, 선풍, 금풍, 선운, 선원, 청선, 선향, K-1, 천량, 고원, 금선, 금진 및 미마끼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 인삼 육종 계통은 G03001, G03002, G03003, G03004, G03005, G03006, G03007, G03008, G03009, G03010, G03011, G03012, G03013, G03014, G03015, G03016, G03017, G03018, G03019, G03020, G03021, G03022, G03023, G03024, G03025, G03026, G03027, G03028, G03029, G03030, G03031, G03032, G03033, G03034, G03035, G03036, G03037, G03038, G03039, G03040, G03041, G03042, G03043, G03044, G03045, G03046, G03047, G03048, G03049, G03050, G03051, G03052, G03053, G03054, G03055, G03056, G03057, G03058, G03059, G03060, G03061, G03062, G03063, G03064, G03065, G03066, G03067, G03068, G03069, G03070, G03071, G03072, G03073, G03074, G03075, G03076 및 G03077일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 인삼 수집자원은 야생 수집종(산삼) 또는 신품종 인삼자원일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 인삼 유전자좌에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)의 염기 타입을 검출하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 연속되는 서열번호 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트를 이루며, 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있다. 구체적으로는 정방향 프라이머의 5' 말단에는 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고 3' 말단에는 SNP를 나타내는 염기가 결합되어 있으며, 역방향 프라이머는 상기 정방향 프라이머의 SNP 부분의 대립유전자에 동일한 염기쌍으로 이루어져 있다(표 4).
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1 내지 30으로 표시되는 10개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 핵 내 게놈 서열에 기반한 SNP 마커를 증폭하며, 서열번호 31 내지 42로 표시되는 4개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 엽록체 완전해독서열에 기반한 SNP 마커를 증폭한다.
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 14개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원의 유전형을 구별할 수 있다(표 5).
본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(25개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 42의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 서열번호 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 31, 34, 37 및 40의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 형광물질 FAM이 부착된 정방향 프라이머이고, 서열번호 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 29, 32, 35, 38 및 41의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 HEX가 부착된 정방향 프라이머이며, 서열번호 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39 및 42의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명의 일 구현예에 따른 프라이머 세트는, 서열번호 1 내지 42로 표시된 14개의 프라이머 세트를 조합하여 전술한 15개의 인삼 품종, 69개의 인삼 육종 계통 및 10개의 야생 수집종을 구별할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.
프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
또한, 본 발명은 상기 KASP용 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 판별을 위한 KASP용 키트를 제공한다. 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, KASP용 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및
상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 판별 방법에 있어서, KASP용 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.
본 발명의 방법은 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 또는 Cy5 등일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 상기 표지 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 하기 표 4에 기재된 바와 같다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계는 유전형 분석을 통해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 정방향 프라이머의 5' 말단에 부착되어 있는 형광물질 FAM 또는 HEX와, 3' 말단에 결합된 SNP를 통해 유전형을 구별하여 인삼 품종을 구별할 수 있다. 유전형이 동형접합체(homozygous)라면 두 개의 형광(FAM 또는 HEX) 중 한 개의 형광만 검출된 것으로, HEX가 검출되면 유전형 'AA', FAM이 검출되면 유전형 'BB'로 판단할 수 있으며, 유전형이 이형접합체(heterozygous)라면 두 개의 형광(FAM 또는 HEX) 모두 검출되어 유전형 'AB'로 판단할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
SNP 정보 및 선정
15개의 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원(표 5)으로부터 DNA를 추출하고 GBS(genotyping-by-sequencing) 방법으로 라이브러리를 제작한 후, Illumina 시퀀싱 기술을 이용해 대량의 서열 정보를 획득하였다. 각각의 유전자원으로부터 생산된 서열들을 인삼의 레퍼런스 어셈블리에 맵핑하고 비교분석하여 다수의 SNP를 선발하였다. 이 중에 단일 유전자 지역에서 탐색된 SNP를 탐색하기 위해 하기 표 1에 개시한 바와 같이 일련의 선별 과정들을 거쳐 정확한 유전자형을 확인할 수 있는 SNP들을 선발하였고 이를 형광표지 마커(Kompetitive Allele Specific PCR, KASP)로 개발하였다(도 1).
SNP들의 선별 과정들에 대해 자세히 살펴보면, 먼저 단일 유전자 지역에서 탐색된 핵 내 게놈 서열의 SNP를 선별하기 위해 다양한 유전자원에서 확인된 대량의 SNP 정보를 이용해 인삼 레퍼런스 어셈블리(http://ginsengdb.snu.ac.kr/)로부터 SNP 주변 양쪽 50bp(총 101bp)의 서열을 추출하고 이를 인삼 레퍼런스 어셈블리에 BLASTN 프로그램을 이용하여 전체 인삼 유전체 지역에서 오로지 한군데에만 매치가 되는 SNP들을 선발하고자 하였다. 이 과정을 통해 111개의 SNP들을 선발할 수 있었으며, 그 후 Primer Blast 프로그램을 이용해 SNP 타겟 지역만을 증폭할 수 있는 마커 개발이 가능한 49개의 SNP을 선발하였다.
이들 중 실제 인삼 육종 과정에서 보다 다양한 정보를 제공할 수 있도록 해당 SNP의 이형접합성 유전형(AB)이 75% 이하이며 동형접합성 유전형(AA, BB)을 모두 가지고 있는 35개의 SNP를 선발하였다. 해당 SNP들이 추후에 형광표지 마커로 개발될 수 있는지 여부를 미리 확인하기 위해 HRM 마커로 분석하고 Tm calling analysis를 수행하였고, 그 중 단일의 증폭산물만 생산해내는 19개의 마커를 확인하였으며 다형성 확인을 통해 마커의 유효성을 확인하여 정상적으로 작동하는 12개의 마커를 최종 선발하였다. 선발된 12개의 마커를 형광표지 마커로 전환하였으며, 이를 총 94개의 인삼 유전자원에 적용하여 마커의 유효성을 확인하였다. 이 중 10개의 형광표지 마커가 94개 샘플 모두에 적용되어 기대했던 다형성을 보여주었고 정상적으로 유전자형 별 cluster를 형성하는 것을 확인하였다.
또한, 인삼의 엽록체 유전체에서 종 내 SNP를 선발하고 형광표지 마커를 제작하기 위해 인삼 품종 또는 산삼개체를 포함하는 11개의 유전자원(표 2 및 표 5)으로부터 dnaLCW(de novo assembly of low coverage whole genome sequence) 방법을 비롯한 선행논문(Kim et al., 2015, Scientific repoets, 5: 15655) 및 한국등록특허 제1678846호를 기반으로 엽록체 유전체 서열을 완성하였다. 본 발명을 위하여 11개의 인삼 엽록체 서열을 새로 완성하였으며(표 2), 기존에 본 발명자가 보고한 12개의 엽록체 서열과 합쳐서 총 23개의 엽록체 유전체 서열을 서로 다중 정렬하여 SNP 변이 지역을 탐색하고(표 3), 23개의 인삼 개체 간에는 총 10개의 SNP가 탐색되었으며(도 2), 이 중 마커를 개발하기에 적합한 4개의 SNP를 선발하였다. 최종적으로, 인삼의 핵 유전체로부터 10개, 엽록체 유전체로부터 4개의 SNP를 선발하여 총 14개의 KASP 마커를 개발하였다.
Chp: Chunpoong, HS: Hwangsook, HY: Hamyang(함양에서 채취한 산삼), Yp: Yunpoong, GO: Gopoong, JK: Jakyung, SW: Sunwon, SP: Sunpoong, Su: Sunun, KW08: Kangwon 08(강원도에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 8), KW13: Kangwon 13(강원도에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 13), KW18: Kangwon 18(강원도에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 18), ChS: Cheongsong(청송에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체), RO1: Russia 01(러시아에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 1), KW17: Kangwon 17(강원도에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 17), DJ: Daejeon(대전에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체), SH: Sunhyang, MMK: Mimaki, CS: Cheongsun, GU: Gumpoong, KW02: Kangwon 02(강원도에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 2), RO2: Russia(러시아에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 2) 및 KW16: Kangwon 16(강원도에서 채취한 산삼 또는 산양삼 개체 16)
2. 상기 SNP 기반
KASP
프라이머
제작
상기 선별된 14개의 SNP를 기반으로 제작된 KASP 프라이머 세트는 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있다. 정방향 프라이머는 5' 말단에 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고 3' 말단에는 SNP와 같은 염기서열의 차이가 구분되도록 디자인하였다. 그리고 역방향 프라이머는 상기 2개의 정방향 프라이머와 작동하여 PCR 반응이 진행될 수 있도록 디자인하였다(표 4). PCR을 수행하면 2개의 정방향 프라이머의 5' 말단에 각기 다른 형광물질이 붙은 채로 증폭되므로, 형광물질의 파장 차이에 따라 유전형을 분석하였다. 유전형이 동형접합체(homozygous)라면 두 개의 형광(FAM 또는 HEX) 중 한 개의 형광만 검출된 것으로, HEX가 검출되면 유전형 'AA', FAM이 검출되면 유전형 'BB'로 판단할 수 있고, 유전형이 이형접합체(heterozygous)라면 두 개의 형광 모두 검출된 것으로 유전형 'AB'로 판단할 수 있다.
3. 계통도 분석
15개의 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원을 대상으로 본 발명의 14개의 KASP를 이용하여 유전자형 분석을 수행하였다. 각각의 KASP에 의해 확정된 94개 인삼 유전자원들의 유전형 정보를 기반으로 Power marker ver.3.25 프로그램(Lie et al., 2005, Bioinformatics., 1(9):2128-9)을 이용해 neighbor-joining 방법으로 1,000번의 bootstrap 과정을 거쳐 계통도 분석(Phylogenetic analysis)을 수행하였다.
실시예
1. 본 발명의
KASP
마커를
이용한 인삼 품종 및 유전형 구별
15개의 인삼 품종을 포함한 94개의 인삼 유전자원을 대상으로 본 발명의 14개의 KASP 마커를 이용하여 유전형 분석을 수행하였다(표 5). 그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 핵 유전체의 SNP 기반으로 제작된 pgKASP001 내지 pgKASP011 마커(A~J)의 경우, 2개의 동형접합성 유전형(AA, BB)과 이형접합성 유전형(AB)의 개체들이 모두 관찰됨을 확인함으로써 해당 마커들이 제대로 작동함을 확인할 수 있었으며, 엽록체 유전체의 SNP 기반으로 제작된 pgcpKASP001 내지 pgcpKASP005 마커들(K~N)은 모계 유전을 하는 엽록체의 특성에 따라 동형접합성 유전형만이 관찰되어, 마찬가지로 제대로 작동함을 확인하였다. 14개의 마커를 인삼 94개체 집단에 적용한 결과 모든 개체 혹은 집단의 유전자형 분석이 정확하게 이루어지는 것을 확인하였다(표 6). 이를 토대로 계통분석을 수행한 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 94개의 인삼 유전자원들이 식별되며 유사한 특징을 가지는 육성계통들은 동일 그룹으로 분류되었다. 연구에 사용된 등록된 모든 인삼 품종들은 14개 마커에 의해 각각 식별이 되었다. 이를 토대로 14개의 마커가 다양한 품종 및 수집자원이나 육종계통 등의 인삼 유전자원에 적용되어 효율적으로 유전자형을 확인하고 분류할 수 있음을 확인하였고 유전자원이나 육성계통의 유사도를 측정하는 수단으로 매우 유용함을 확인할 수 있다.
H: 이형접합체 유전형
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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gcccataaat ttgtcgaaag aggag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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gcccataaat ttgtcgaaag aggaa 25
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<220>
<223> Primer
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<223> Primer
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<220>
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<223> Primer
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<223> Primer
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<223> Primer
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gccctggtga attcgtcatt gta 23
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<220>
<223> Primer
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<211> 23
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<220>
<223> Primer
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<220>
<223> Primer
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ctccaagcta cggctactg 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
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<223> Primer
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<212> DNA
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<223> Primer
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atttggaccg atctggccac caaat 25
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<212> DNA
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<223> Primer
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<210> 20
<211> 24
<212> DNA
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<220>
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ccaaggtttt tgttgttcaa ccca 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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aagatgttca aataaagaaa gtagagcaaa 30
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 22
ggtcggacaa aaaatgaccc gg 22
<210> 23
<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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ggtcggacaa aaaatgaccc ga 22
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cgggcctcac aatatcaaat catcaaaat 29
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<400> 25
ccacatctga actcattcgt g 21
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<211> 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 26
agctccacat ctgaactcat tcgta 25
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 27
acttacccgg gcttgatgag tcat 24
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<211> 24
<212> DNA
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<223> Primer
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 29
taggtgtcat cttagtttca agcca 25
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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cataaacttt atcatgggtt gcctaacatt 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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aaagattgtg gcaccgtccg ag 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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cccatttcgg ggactcacag aaata 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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gctaagaatt attacaggtc ccg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 35
ctgctaagaa ttattacagg tccca 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 36
gacacgataa ctccaataat ccaactgtt 29
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 37
acatcacttc tgcttctatt gtaataaag 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
<400> 38
cacatcactt ctgcttctat tgtaataaaa 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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cgggcctttt ccacataaaa agggaa 26
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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gaaatatgac caacagtagt tcgaatatat 30
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<211> 29
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<220>
<223> Primer
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aaatatgacc aacagtagtt cgaatatag 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 42
gggcaatatc taatagtaag aagtataaaa 30
Claims (5)
- 서열번호 1 내지 42로 표시되는 올리고뉴클레오티드에서 서열번호 1부터 시작하여 인접한 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 14개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 분류를 위한 KASP(kompetiive allele specific PCR)용 프라이머 세트.
- 삭제
- 제1항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 분류를 위한 KASP용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 분류를 위한 KASP용 키트.
- 인삼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및
상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계;를 포함하는, 인삼의 품종, 육종 계통 또는 인삼 수집자원의 분류 방법.
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