CN108715902A

CN108715902A - 梅花垂枝性状snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN108715902A
Application number: CN201810415993.7A
Authority: CN
Inventors: 张启翔; 李素珍; 卓孝康; 郑唐春; 李璐璐; 邱丽珂; 孙丽丹; 程堂仁; 王佳
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2018-05-03
Filing date: 2018-05-03
Publication date: 2018-10-30
Anticipated expiration: 2038-05-03
Also published as: CN108715902B; EP3789506C0; EP3789506B1; WO2019210696A1; EP3789506A4; EP3789506A1

Abstract

本发明公开了梅花垂枝性状SNP分子标记及其应用，具体包括分子标记Marker301243和/或Marker311414，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明利用SLAF‑seq技术开发获得2个梅花垂枝性状SNP分子标记Marker301243和Marker311414，并提供了其序列扩增引物和等位特异性PCR引物。所述分子标记Marker301243和/或Marker311414及其引物在鉴定梅花品种时，具有较高的准确性、稳定性且重复性好。将其用于分子辅助选择育种，可实现苗期提早选择，快速鉴定梅花垂枝性状，减少工作量，大大缩短梅花育种时间。

Description

梅花垂枝性状SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及植物分子育种领域，具体地说，涉及梅花垂枝性状SNP分子标记及其应用。

背景技术

梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)隶属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)，是我国十大传统名花之一，具有观赏和使用价值，起源于中国西南部，距今已有3000多年的引种栽培历史(陈俊愉.中国梅花品种图志[M].中国林业出版社,2010)。梅花种类多样，花色花型株型丰富，其中垂枝梅是具有独特株型的梅花九大品种之一，因其别致的树姿兼具花色、花香等其它观赏性状而深受人们喜爱，在园林造景中具有重要的地位。

张杰(张杰.梅花高密度遗传图谱构建及部分观赏性状QTL分析[D].北京林业大学,2016.)利用特异性位点扩增片段测序(SLAF-seq,Specific-Locus AmplifiedFragment Sequencing)技术对梅花进行全基因组范围内的分子标记开发，构建了梅花标记密度最大的一张遗传连锁图谱，并将垂枝性状定位到梅花7号染色体10.54Mb-11.68Mb区间，同时得到10个可能与梅花垂枝性状紧密连锁的SLAF分子标记。

利用高通量测序技术大量开发SNP标记，开发性状连锁的分子标记进行植株的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期，提高育种效率。本发明利用SLAF-seq技术开发大量的梅花垂枝的SNP标记，筛选紧密连锁的分子标记，为其分子标记辅助选择育种提供重要基础。

发明内容

为解决现有技术中存在的梅花垂枝性状筛选周期长、效率低等问题，本发明的目的是提供梅花垂枝性状SNP分子标记及其应用。

为了实现本发明目的，本发明是以‘六瓣’梅为母本，‘粉台垂枝’为父本杂交获得的F₁分离群体、直枝和垂枝梅花品种为试材，开展梅花垂枝性状分子标记的开发及标记辅助选择育种体系的建立。

本发明提供的梅花垂枝性状SNP分子标记，包括分子标记Marker301243和/或Marker311414，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供用于扩增所述分子标记的特异性PCR引物。

标记Marker301243引物序列为：

正向引物：5′-TGAGAATGGACAATGAGCGT-3′

反向引物：5′-CTCTGCTGGACACCCCTAAT-3′

标记Marker311414引物序列为：

正向引物：5′-CTTAGGGAATGGTGTCGCTT-3′

反向引物：5′-AGAGCAGGCACCCAAGTAAGT-3′

本发明还提供所述分子标记在鉴定梅花垂直性状中的应用，包括以下步骤：

1)提取待测梅花的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；

3)对应于标记Marker301243的SNP位点，位于SEQ ID NO.1所示序列的第426位碱基，该处碱基为T或A，梅花垂枝的优势等位基因型为TT，直枝的优势等位基因型为AT；对应于标记Marker311414的SNP位点，位于SEQ ID NO.2所示序列的第607位碱基，该处碱基为G或A，梅花垂枝的优势等位基因型为GG，直枝的优势等位基因型为GA。

其中，步骤2)中PCR扩增体系为20μL，包括：50ng/μL模板DNA 2μL，2×Taq PCRMaster Mix 10μL，10μmol/L正反向引物各1μL，ddH₂O 6μL。

在本发明的具体实施方式中，使用了以下PCR反应程序作为示例：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃终延伸5min。

本领域技术人员应该知晓，PCR的扩增体系和反应程序可以根据所用DNA聚合酶不同或其它需要调整其中各组分的体积和/或用量以及各反应的温度和时间，因此，本发明所述的PCR扩增体系和反应程序选择包括但不限于上述扩增体系和反应程序。

需要指出的是，在利用本发明提供的2个SNP分子标记Marker301243和Marker311414进行梅花垂枝性状鉴定或者梅花垂枝性状分子标记辅助育种时，本领域技术人员根据需要可以选择Marker301243和Marker311414中任意一种分子标记或Marker301243和Marker311414两种分子标记的组合。两标记结合鉴定，显著提高鉴定的准确率。

因此，步骤2)中所述分子标记的引物可以为标记Marker301243的正反向引物对和/或标记Marker311414的正反向引物对。

本发明还提供用于AS-PCR(等位基因特异性PCR)扩增所述分子标记的AS-PCR引物。

所述AS-PCR引物，分别根据Marker301243(A/T)和Marker311414(C/T)的SNP位点进行设计，为了提高引物特异性，同时在特异性引物3’末端的倒数第3位置引入1个错配碱基，另一条引物(公共引物)按常规方法进行设计。

标记Marker301243引物序列为：

正向引物：5′-TGGAAACTGAATAGATGCGAT-3′

反向公共引物：5′-GGTGAAAGAGACATCAGAAAAT-3′

正向特异性引物：5′-TGGAAACTGAATAGATGCGAA-3′

标记Marker311414引物序列为：

正向公共引物：5′-CATCTAAAATAAAATCTCAAAGG-3′

反向引物：5′-TCATAGGTATTCTTGTCTTTCTC-3′

反向特异性引物：5′-TCATAGGTATTCTTGTCTTTCTT-3′

本发明还提供一种筛选或鉴定梅花垂枝性状的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取待测梅花的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增所述分子标记的AS-PCR引物，进行AS-PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物，根据AS-PCR扩增产物条带的有无，判断对应的SNP位点，其中，对应于标记Marker301243的SNP位点，梅花垂枝的优势等位基因型为TT，直枝的优势等位基因型为AT；对应于标记Marker311414的SNP位点，梅花垂枝的优势等位基因型为GG，直枝的优势等位基因型为GA。

其中，步骤2)中AS-PCR扩增体系为10μL，包括：50ng/μL模板DNA 1μL，2×Taq PCRMaster Mix 5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，ddH₂O 3μL。

在本发明的具体实施方式中，使用以下AS-PCR反应程序作为示例：95℃预变性2min，95℃变性20s，46-52℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃终延伸5min。

步骤2)中所述分子标记的引物可以为标记Marker301243的正反向引物对和/或标记Marker311414的正反向引物对。

本领域技术人员公知，AS-PCR操作过程中需将两条AS-PCR引物与公共引物分别配对使用，在两个PCR管中对同一DNA模板进行PCR扩增。若AS-PCR引物的3’末端与样品中的等位位点相匹配，便能进行有效扩增，反之则不能进行有效扩增。本发明根据AS-PCR的两个特异性引物分别与公共引物配对扩增时，鉴定扩增个体的基因型，根据基因型与表型的关联情况，通过统计基因型频率，以确定该SNP位点是否与梅花的垂枝或直枝性状紧密相关。

本发明还提供含有所述特异性PCR和/或所述AS-PCR引物的用于筛选或鉴定梅花垂枝性状的检测试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液和标准阳性模板中的一种或多种。

本发明进一步提供所述分子标记和/或所述引物在梅花垂枝性状分子标记辅助育种中的应用。

本发明具有以下优点：

(一)本发明利用SLAF-seq技术开发梅花垂枝性状连锁的分子标记，奠定了梅花垂直性状分子标记辅助选择育种的基础。

(二)本发明获得的SNP分子标记在梅花群体和品种的性状鉴定中重复性好、能够稳定扩增，且不受环境条件的影响。

(三)本发明提供的AS-PCR引物用于AS-PCR扩增反应，可通过电泳检测鉴定梅花垂枝和直枝性状，操作简单。

(四)本发明提供的鉴定梅花垂枝性状的方法，通过对基因型频率的统计，发现两标记在梅花F₁群体和品种均具有较高的鉴定准确率：利用Marker301243在F₁群体中准确率最高为91.67％，在直枝个体中准确率高达100％；同时利用标记组合Marker301243+Marker311414，在F₁群体中准确率率高达100％。利用标记组合Marker301243+Marker311414在梅花品种中鉴定的准确率为89.13％，且在梅花垂枝品种中准确率高达100％。

(五)将本发明筛选出的2个分子标记用于辅助选择育种，可以实现苗期提早选择，减少工作量，大大缩短梅花育种周期，提高育种效率。

附图说明

图1本发明实施例3中标记Marker301243的测序峰图，其中A为母本‘六瓣’梅，B为父本‘粉台垂枝’，C为F₁代直枝梅花，D为F₁代垂枝梅花。

图2本发明实施例3中标记Marker311414的测序峰图，其中A为母本‘六瓣’梅，B为父本‘粉台垂枝’。

图3为本发明实施例4中标记Marker301243(Marker左侧1-12)和Marker311414(Marker右侧1-12)在F₁群体中AS-PCR的扩增结果，其中1-6均为垂枝梅花，7-12均为直枝梅花，M为Marker DL2000。

图4为本发明实施例4中标记Marker301243在父母本及梅花垂枝品种中AS-PCR的扩增结果，其中1-2为母本‘六瓣’梅，3-4为父本‘粉台垂枝’，5-19为梅花垂枝品种，M为Marker DL2000。

图5为本发明实施例4中标记Marker301243在梅花直枝品种中AS-PCR的扩增结果，其中1-27为梅花直枝品种，M为Marker DL2000。

图6为本发明实施例4中标记Marker311414在父母本及梅花垂枝品种中AS-PCR的扩增结果，其中1-2为母本‘六瓣’梅，3-4为父本‘粉台垂枝’，5-19为梅花垂枝品种，M为Marker DL2000。

图7为本发明实施例4中标记Marker311414在梅花直枝品种中AS-PCR的扩增结果，其中1-27为梅花直枝品种，M为Marker DL2000。

图8为本发明实施例4中标记Marker301243(上图)和Marker311414(下图)在父母本及梅花垂枝品种中AS-PCR的扩增结果对比图，其中1-2为母本‘六瓣’梅，3-4为父本‘粉台垂枝’，5-19为梅花垂枝品种，M为Marker DL2000。

图9为本发明实施例4中标记Marker301243(上图)和Marker311414(下图)在梅花直枝品种中AS-PCR的扩增结果对比图，其中1-27为梅花直枝品种，M为Marker DL2000。

图10为本发明实施例4中标记Marker301243和Marker311414在F1群体中辅助选择育种准确性。

图11为本发明实施例4中标记Marker301243和Marker311414在梅花品种中辅助选择育种准确性。

图12为本发明实施例4中标记Marker301243+Marker311414组合在F₁群体中和梅花品种中辅助选择育种准确性。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1基于SLAF-seq技术开发梅花垂枝性状SNP分子标记1、实验材料

供试材料包括‘六瓣’梅为母本，‘粉台垂枝’为父本及以其为亲本杂交获得的F₁分离群体、直枝和垂枝梅花品种。亲本在垂枝、花色等表型性状上差异显著，所有材料均定植于浙江省湖州市莫干山镇何村(30.566389°N，119.879582°E)。

2、基因组DNA的提取

选取F₁群体中直枝和垂枝株型的单株各20株。按照高效植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明进行DNA提取，制备1.0％琼脂糖凝胶，吸取3μL DNA混合约1μL loading-buffer，电压150V，电泳15min，检测DNA完整性。用NANO DROP 2000测定DNA浓度和纯度，保证DNA浓度>50ng/μL。

3、梅花性状分子标记的开发

根据梅花基因组信息进行酶切预测，预测不同的内切酶对梅花基因组酶切后所产生的分子标记数量及其在基因组上的分布位置，最终选定HaeⅢ和Hpy 166Ⅱ(New EnglandBiolabs,NEB,USA)两种酶。接着用内切酶HaeⅢ和Hpy 166Ⅱ对梅花基因组DNA进行消化处理，然后加入Klenow片段(3’-5’exo)(NEB)和dATP，37℃温育使消化后的DNA末端接上A碱基，通过T4连接酶在上述带有A碱基的产物末端连上双条形码标签接头(PAGE-purified,Life Technologies,USA)。连接完成之后将稀释的DNA样品，dZTP，高保真酶和PCR引物混匀进行后续的PCR反应。PCR产物通过核酸纯化试剂盒(Beckman Coulter,HighWycombe,UK)纯化之后再混合，然后利用2％的琼脂糖凝胶对不同大小的PCR片段混合产物进行分离，在50μL混合DNA溶液中加入6μL EB，然后依次加入点样孔中，同时加入6μLDL1000Maker，110V电泳约50min。电泳后，将胶放于BioRad紫外成像仪(ChemiDoc^TM MP)切取214-294bp的条带，放入称量好的离心管中，使用QIAquick Gel Eztraction Kit进行胶纯化回收，再将回收产物溶于50μL EB溶液。胶回收得到的产物进行稀释后，根据制造商说明，利用Illumina公司的HiSeq2500测序平台(Illumina,Inc；San Diego；CA,USA)对制备好的SLAF文库进行双末端100bp测序。

实施例2SNP分子标记的扩增

根据梅花垂枝性状差异性标记设计引物，具体如下：

根据Sanger测序结果，选择2个Marker(Marker301243、Marker311414)，利用Primer Premier 5.0设计引物，引物序列见表1。

表1用于Sanger测序的2对引物信息

随机挑选若干株直枝和垂枝个体进行PCR扩增。PCR扩增体系20μL，含100ng·μL^-1模板DNA 2μL，2×Taq PCR Master Mix(BIOMIGA)10μL，10mol/L正向和反向引物(生工生物工程股份有限公司北京合成部)各1μL，ddH₂O 10.3μL。PCR程序为：95℃预变性2min；94℃变性20s，56℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃终延伸5min。后将PCR产物进行Sanger测序(生工生物工程股份有限公司北京测序部)，将子代与亲本的测序结果进行对照，确定该标记含有真实的SNP位点，且与垂枝性状紧密连锁。

以上两个实施例，基于数量性状基因(quantitative trait locus，QTL)分析和SLAF-index分析，发现Marker301243和/或Marker311414与梅花垂枝条性状显著关联。通过PCR扩增和Sanger测序，确定了Marker301243和/或Marker311414存在真实的SNP位点，并在子代中发生分离。

实施例3基于SNP标记建立AS-PCR方法进行基因分型

利用Sanger测序获得2个标记(即标记Marker301243、Marker311414，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，对相应的SNP位点设计AS-PCR引物。等位基因特异性设计时，分别根据Marker301243(A/T)和Marker311414(C/T)的SNP位点进行设计，为了提高引物特异性，同时在特异性引物3’末端的倒数第3位置引入1个错配碱基，另一条引物(公共引物)按常规方法进行设计，所设引物利用NCBI检测特异性(表2)。AS-PCR操作过程中需将两条AS-PCR引物与公用引物分别配对使用，在两个PCR管中对同一DNA模板进行PCR扩增。若AS-PCR引物的3’末端与样品中的等位位点相匹配，便能进行有效扩增，反之则不能进行有效扩增。

AS-PCR反应体系为10μL，50ng/μL模板DNA 1μL，2×Taq PCR Master Mix 5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，ddH₂O 3μL，PCR反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性20s，46-52℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃终延伸5min。扩增结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，统计F₁群体单株的基因型，确定梅花垂枝和直枝性状的优势等位基因型。其中，对应于标记Marker301243的SNP位点，位于SEQ ID NO:1所示序列的第426位碱基，该处碱基为T或A(图1)，梅花垂枝的优势等位基因型为TT，直枝的优势等位基因型为AT；对应于标记Marker311414的SNP位点，位于SEQ ID NO:2所示序列的第607位碱基，该处碱基为G或A，梅花垂枝的优势等位基因型为GG，直枝的优势等位基因型为GA(图2)。

用于AS-PCR扩增的2对标记引物信息见表2。

表2用于AS-PCR扩增的2对引物信息

注：Ref为参考基因组序列；F为正向引物序列；R为反向引物序列；S为特异引物序列；加粗碱基为AS-PCR特异性引物差异碱基。

实施例4Marker301243和Marker311414分子标记的应用

对Marker301243和Marker311414分子标记的准确性、稳定性、重复性进行检测，具体如下：

用得到的2个标记Marker301243和Marker311414对F₁群体进行AS-PCR扩增验证，标记的鉴定结果见图3和图10，Marker301243在F₁群体中准确率最高为91.67％，且在直枝个体中准确率高达100％。同时利用标记组合Marker301243+Marker311414进行表型鉴定时，在F₁群体中成功率高达100％(图12)。由此可见，开发的SNP标记可以用于梅花F₁群体及品种中垂枝性状的辅助选择育种中。

获得的特异性分子标记是否稳定对其应用也是非常重要的，通过相同引物对F₁群体和梅花品种进行扩增，如果能获得稳定的条带，说明开发的标记是稳定的，可用于梅花不同株型的鉴定。以梅花品种为材料，验证所开发的SNP标记的稳定性及准确率。以Marker301243为例，其在直枝个体扩出两条带，为AT等位基因型，在垂枝个体中扩出一条带，为TT等位基因型，说明2个标记在梅花品种均能较好地鉴定不同的表型，具有很好的稳定性(图3)。进一步地，分别在梅花垂枝和直枝品种中验证Marker301243和Marker311414分子标记的特异性和稳定性。对于两个分子标记的等位基因型，可能会出现3种基因型情况(Marker301243为AA，TT和AT；Marker311414为AA(TT)，GG(CC))和AG(CT))，而使用一对引物(一条特异性引物与一条公共引物)扩增时(图4-图9)，则只有与所用特异性引物配对的AA或AT基因型个体可以被扩增出条带，TT则无法扩增出条带(以Marker301243为例)。图4为Marker301243在垂枝品种中的检测结果，其中，无条带的为TT基因型的垂枝品种；图6为Marker311414的在垂枝品种中的检测结果，无带的为GG(CC)基因型垂枝品种。图8为Marker301243/Marker311414相结合，二者结合对应基因型可表示为TT/CC(无带/无带)，A_/CC(有带/无带)，TT/_T(无带/有带)。从图8可以看出，大部分垂枝个体为纯合型，表现为TT/CC基因型组合，呈现无条带。同理，而直枝品种中SNP位点的优势基因型为AT，特异引物均能扩增出条带。图5为Marker30124在直枝品种中的检测结果，由图可知大部分直枝个体均有条带，表现为AT基因型；图7为Marker311414在直枝品种中的检测结果，多表现为有条带，为CT基因型。图9为Marker301243/Marker311414相结合，二者结合对应基因型可表示为A_/_T(有带/有带)，A_/CC(有带/无带)，TT/_T(无带/有带)，TT/CC(无带/无带)。因此，通过统计Marker301243/Marker311414特异的带型，即可对获得相应的鉴定结果。从图9可以看出，大部分直枝个体为杂合型，表现为AT/CT基因型组合，呈现两条带，少数出现与垂枝性状相同的基因型，表现为一条带或无带(如图9个体18)。可见分子标记Marker301243和Marker311414在梅花品种中AS-PCR的扩增具有较高的稳定性和可靠性(图4-图9)。Marker301243在F1群体中鉴定的准确率显著高于梅花品种，Marker311414则反之(图11)。利用标记组合Marker301243+Marker311414进行表型鉴定时，在梅花品种中成功率为89.13％，且在梅花垂枝品种中达100％(图12)。

其中，图3为标记Marker301243和Marker311414在F₁群体中AS-PCR的扩增结果。图4-图9为标记Marker301243和Marker311414在梅花品种中AS-PCR的扩增稳定性。

本发明建立的分子标记辅助选择育种可以实现苗期提早选择、减少工作量，提高了梅花垂枝性状的选择效率，大大缩短了育种周期。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 梅花垂枝性状SNP分子标记及其应用

<130> KHP181112114.0

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 830

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtgcga gttaaagaat cgtggtggta aatgattggc tttctttggt catgcttgag 60

aaatctttaa tgagtgtgag ttgaagagtc ctgatggtgt atgattgcct ttacttggtg 120

atggttgaga atggacaatg agcgtgagtt gaatagtctt gatagtaaat gatttatttg 180

tttggtcaat gacattgtgg tttctaaaaa cttgttcatt gggttttagc aatccaccaa 240

tttggtggaa gctttaagat tctttggagt ataaggaacc aaattgtagt ttttgtttac 300

actctggata ttacactttg gagttccttt catatatgtt ctttgtgaaa gtaaatcatt 360

gtgagaaaag aaattgattt tgaccggtat tattagtggt tcatctggaa tctgaataga 420

tgccatttga tctctgttgc ttatgaagtc agtgtttggt gtgcagctgc cacttcctca 480

acagcagcag cagcagcttc ggcagcaaga gaatgcactt cctaagcaga ggcctcaaac 540

actcgatttg ctctttgcaa acatgaagga gcaaaggatg agggcccaac cacgccagaa 600

caatgccgta cctcgcaaca ttaggggtgt ccagcagagg cccccttggg gaagaggcgg 660

acgatttggc aactgattca tacgcataat gtgccagcta gaaaggggat tgaatgtcta 720

ctttgtctag atcccaatgt gtagctgatg ggggttcata tccaaaatat attggggccg 780

tccgactttt gttgccttta tttttccatt tttatgactt tggaagactt 830

<210> 2

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcattataga aacatgggaa catgagtaaa aataatttcc caagcttagg gaatggtgtc 60

gcttctagca aagtacatca agacaaacaa ctatatgata caaacaaatt catctaaaat 120

aaaatctcaa aggctggaac caaaaggcca caattatagg caactatatg cttggttcat 180

ctatcatgta tttttaatgt agaaaatata tccattcaac tgtagaacca actatatgaa 240

tggtttatct atcatgcttg atatatactt ggtctccccc ttcttgtttc ttcaaggcct 300

tgctttatct gctttccact ctcttctttc tttcattgga tctgagatca aacaagatcc 360

atgaaattct gagttcaaaa aaaaaatcaa aatttagtta ttgtttcata acaaaaaaaa 420

ttgaaatgga attagataca tttagaagta tcgataaaac aataacaacc tttcaaagta 480

aaggctgtga atgatgataa gaataattca tggtgatata aggatatcaa atagctcaac 540

atggataaat gctcaggcca aacttgactc acaagtcaaa ccatgcttca ttctccaact 600

aaaccagaaa aagacaagaa tacgtatgaa tattaagtat atcaacaata ataaatgatt 660

aaggcagatg tcatgtactt acttgggtgc ctgctctgca caagttctta cagagatgag 720

aaaatggatg ggatgtccat ccaccatcca cttagaaata atgaatttaa cctcatagct 780

cattttttgc ttagtaacaa gattatcttt gttagaagta ataggattat gagctctcaa 840

ttgaatatgc cacat 855

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagaatgga caatgagcgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctgctgga cacccctaat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cttagggaat ggtgtcgctt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agagcaggca cccaagtaag t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggaaactga atagatgcca t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tggaaactga atagatgcga t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggaaactga atagatgcga a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtgaaagag acatcagaaa at 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

catctaaaat aaaatctcaa agg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcataggtat tcttgtcttt ttc 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcataggtat tcttgtcttt ctc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcataggtat tcttgtcttt ctt 23

Claims

1.梅花垂枝性状SNP分子标记，其特征在于，包括分子标记Marker301243和/或Marker311414，它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.用于扩增权利要求1所述分子标记的特异性PCR引物，其特征在于，

标记Marker301243引物序列为：

正向引物：5′-TGAGAATGGACAATGAGCGT-3′，

反向引物：5′-CTCTGCTGGACACCCCTAAT-3′；

标记Marker311414引物序列为：

正向引物：5′-CTTAGGGAATGGTGTCGCTT-3′，

反向引物：5′-AGAGCAGGCACCCAAGTAAGT-3′。

3.权利要求1所述分子标记在鉴定梅花垂枝性状中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测梅花的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记的引物，进行PCR扩增反应；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中的PCR扩增体系为20μL，包括：50ng/μL模板DNA 2μL，2×PCR Master Mix 10μL，10μmol/L正反向引物各1μL，ddH₂O 6μL。

5.用于AS-PCR扩增权利要求1分子标记的AS-PCR引物，其特征在于，

标记Marker301243引物序列为：

正向引物：5′-TGGAAACTGAATAGATGCGAT-3′，

反向公共引物：5′-GGTGAAAGAGACATCAGAAAAT-3′，

正向特异性引物：5′-TGGAAACTGAATAGATGCGAA-3′；

标记Marker311414引物序列为：

正向公共引物：5′-CATCTAAAATAAAATCTCAAAGG-3′，

反向引物：5′-TCATAGGTATTCTTGTCTTTCTC-3′，

反向特异性引物：5′-TCATAGGTATTCTTGTCTTTCTT-3′。

6.一种筛选或鉴定梅花垂枝性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测梅花的基因组DNA；

2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述分子标记的AS-PCR引物，进行AS-PCR扩增；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中AS-PCR扩增体系为10μL，包括：50ng/μL模板DNA 1μL，2×PCR Master Mix 5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，ddH₂O 3μL。

8.含有权利要求2和/或权利要求5所述引物的用于筛选或鉴定梅花垂枝性状的检测试剂盒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg² ⁺、PCR反应缓冲液和标准阳性模板中的一种或多种。

10.权利要求1所述分子标记和/或权利要求2或权利要求5所述引物在梅花分子标记辅助育种中的应用。