CN110819732A

CN110819732A - 梅花垂枝性状紧密连锁的纯合snp分子标记及其检测方法与应用

Info

Publication number: CN110819732A
Application number: CN201911038349.3A
Authority: CN
Inventors: 张启翔; 卓孝康; 郑唐春; 孙丽丹; 袁存权; 程堂仁; 王佳
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: CN110819732B

Abstract

本发明涉及分子生物学及植物分子育种技术领域，具体涉及梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记及其检测方法与应用。本发明提供两个梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记，分别位于梅花第7号染色体第10245464bp处和第10284630bp处，多态性分别为G/A和G/T。这两个分子标记在垂枝/直枝性状的个体中均表现为纯合基因型，在梅花杂交后代分离群体的垂枝/直枝性状鉴定中重复性好、准确性高，可实现垂枝/直枝性状的幼苗期分子辅助选择，有助于缩短育种周期和提高育种效率。基于该SNP分子标记，本发明还提供梅花垂枝性状调控基因Pm024074，为梅花垂枝性状的调控和遗传育种提供了基础。

Description

梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记及其检测方法与应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及植物分子育种技术领域，具体涉及梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记及其检测方法与应用。

背景技术

梅花(Prunus mume Sieb.et Zucc.)隶属于蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)，是中国的传统名花，具观赏价值和经济价值(陈俊愉. 中国梅花品种图志[M].中国林业出版社,2010)。梅花品种丰富，色、香、味、型品种齐全，其中，垂枝梅是具有独特株型的梅花的九大品种群之一，因其别致的树姿兼具花色、花香等其它观赏性状而深受人们喜爱，在园林造景中具有重要的地位。

目前，已见报道一种基于SLAF标记和QTL定位分析并利用 AS-PCR的策略开发的检测梅花垂枝性状的分子标记及方法，该方法价格低廉、容易实验室操作，但是检测的通量和精度较低，对引物的要求严格(中国专利CN201810415993.7)。在桃中，基于双亲群体，利用BSA基因组测序的方法鉴定了一个位于3号染色体15545036至 15979629区间的缺失与桃垂枝性状有关，并开发了桃垂枝性状关联的 InDel标记，鉴定了Ppa013325参与调控桃的垂枝性状(Hollender et al., 2018,Proceedings of the National Academy ofSciences,115(20): E4690-E4699.)。此外，鲁振华等同样利用双亲群体鉴定了桃3号染色体20.839Mb和20.998Mb区域的2个SNP位点和一个InDel标记与桃的垂枝性状紧密连锁(中国专利CN201810315313.4)。然而，双亲群体鉴定和开发性状连锁的分子标记这两种研究结果差异较大，说明仅仅利用单一的双亲群体鉴定和开发性状连锁的分子标记的误差较大，不利于高效的筛选目标性状和挖掘关键基因。而利用连锁与关联分析挖掘垂枝性状连锁的SNP分子标记，能够显著增加标记的可靠性和缩小候选基因的范围，有利于开发高效的分子辅助育种标记和挖掘关键候选基因，缩短育种周期和提高育种效率。基于这种策略，申请人前期已经开发了一个与梅花垂枝性状紧密连锁的SNP分子标记 Pm7_11182911，该标记在垂枝梅花中表型为杂合，在直枝梅花中表现为纯合，单标记准确率可达96％(中国CN201811504968.2)。在分子辅助育种中，将纯合SNP分子标记和杂合的SNP标记相结合可以进一步提高目标性状筛选的准确率，同时依据纯合位点有助于挖掘梅花垂枝性状隐性位点基因和综合解析梅花垂枝性状的遗传变异，在梅花分子设计育种中具有重要的应用价值。因此，开发预测准确性较高的纯合SNP分子标记具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记、该SNP分子标记的检测引物和梅花垂枝/直枝性状的检测方法，以及参与梅花垂枝性状调控的 Pm024074基因。

本发明在对214个梅花品种进行全基因组测序的基础上(Genbank 登陆号：PRJNA171605；时间：2013年2月28日；参考基因组版本信息(http://prunusmumegenome.bjfu.edu.cn))，利用全基因组关联分析的方法检测与梅花枝条性状显著关联的位点；利用342个‘六瓣’和‘粉台垂枝’杂交的F1分离群体作为材料，开展梅花垂枝性状的QTL定位分析。联合全基因组关联分析、群体选择分析和QTL定位分析在梅花 7号染色体10.2-11.7Mb区间获得了重叠位点，利用质谱基因分型法对该位点区间内起源于全基因组关联分析的7个显著关联的SNP标记进行验证，基因分型结果发现这7个SNP标记均与梅花垂枝性状紧密关联，其中，位于7号染色体的第10245464bp处的Pm7_10245464和位于7号染色体的第10284630bp处的Pm7_10284630在垂枝梅和直枝梅中的基因型均表现为纯合型，Pm7_10245464表现为GG(垂枝)/AA(直枝)，Pm7_10284630表现为TT(垂枝)/GG(直枝)。

具体地，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供两个梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记，分别为：位于梅花第7号染色体第10245464bp处，多态性为G/A (命名为Pm7_10245464)；位于梅花第7号染色体第10284630bp处，多态性为G/T(命名为Pm7_10284630)。

上述SNP分子标记的位置为在基因组版本为Prunus mume Genome v1.0(http://prunusmumegenome.bjfu.edu.cn/)的梅花第7号染色体上的位置。

上述位于梅花第7号染色体第10245464bp处的SNP(G/A)和第 10284630bp处的SNP(T/G)与梅花的垂枝/直枝性状紧密连锁，且均属于纯合突变，在梅花垂枝和直枝性状中均表现为纯合基因型，其中，梅花垂枝性状对应的上述Pm7_10245464SNP位点的基因型为GG，直枝性状对应的基因型为AA；梅花垂枝性状对应的上述Pm7_10284630 SNP位点的基因型为TT，直枝性状对应的基因型为GG。

Pm7_10245464和Pm7_10284630两个SNP分子标记分别位于如 SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示序列的第300bp处。

上述两个SNP分子标记可分别单独使用用于梅花垂枝/直枝性状的鉴定，也可联合使用进行梅花垂枝/直枝性状的鉴定。

进一步地，为进行所述SNP分子标记的检测，本发明还提供所述 SNP分子标记的检测引物，其中，Pm7_10245464分子标记的检测引物包括引物对1，序列如SEQ ID NO.3-4所示；Pm7_10284630分子标记的检测引物包括引物对2，序列如SEQ ID NO.6-7所示。

SEQ ID NO.3：正向引物F：

5’-ACGTTGGATGTTCAAGACCGGTCCAATGAG-3’；

SEQ ID NO.4：反向引物R：

5’-ACGTTGGATGATTGACCACAATCCCAGCAG-3’。

SEQ ID NO.6：正向引物F：

5’-ACGTTGGATGGGCTTACTGTGGTTTTGGAC-3’；

SEQ ID NO.7：反向引物R：

5’-ACGTTGGATGCCGCTAAGGATAAGAATGGG-3’。

当通过分析单碱基延伸反应产物的序列检测SNP的基因型时，所述检测引物还包括单碱基延伸引物：

其中，与所述引物对1配合使用，用于Pm7_10245464分子标记检测的单碱基延伸引物的序列如SEQ ID NO.5所示；与所述引物对2配合使用，用于Pm7_10284630SNP分子标记检测的单碱基延伸引物的序列如SEQ ID NO.8所示。

SEQ ID NO.5：5’-CGGATGTGCAAGAAGTA-3’；

SEQ ID NO.8：5’-GTATGACGGGTTCGG-3’。

在此基础上，本发明提供包含所述SNP分子标记的检测引物的试剂盒。所述试剂盒可用于梅花垂枝/直枝性状的检测。

为检测方便，所述试剂盒还可包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg²⁺、 PCR反应缓冲液、标准阳性对照模板和SAP酶中的一种或多种。

进一步地，本发明提供所述SNP分子标记或所述SNP分子标记的检测引物或包含所述检测引物的试剂盒在梅花垂枝/直枝性状鉴定中的应用。

本发明还提供所述SNP分子标记或所述SNP分子标记的检测引物或包含所述检测引物的试剂盒在梅花分子标记辅助育种中的应用。

进一步地，本发明提供一种鉴定梅花垂枝/直枝性状的方法，其为以待测梅花的基因组为模板，采用所述SNP分子标记的检测引物进行PCR扩增，分析PCR扩增产物的序列，判断待测梅花的基因型。

本发明中，经上述PCR扩增得到的PCR扩增产物可以采用直接测序法、基于电泳的检测方法、质谱分析检测方法和SNapshot等任何本领域常规的SNP分型方法进行序列分析。

为更好地满足高通量、高精度、高效性、价格低和应用广泛的分子辅助育种要求，优选地，所述分析扩增产物的序列的方法为采用 Sequenom

SNP技术进行SNP的基因型分析，具体包括如下步骤：

(1)以待测梅花的基因组为模板，采用序列如SEQ ID NO.3-4 和/或SEQ ID NO.6-7所示的检测引物进行PCR扩增，将所述PCR扩增的产物用碱性磷酸酶处理；

(2)以步骤(1)得到的碱性磷酸酶处理的产物为模板，采用序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.8所示的单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应；

(3)分析步骤(2)得到的单碱基延伸反应的产物的基因型。

优选地，上述步骤(3)中，分析步骤(2)得到的单碱基延伸反应的产物的基因型为采用MassARRAY SpectroCHIP芯片及质谱仪检测分析。

为更好地满足高通量、自动化分析的要求，作为本发明的一种优选实施方式，所述鉴定梅花垂枝性状的方法包括如下步骤：

(1)提取待测梅花的基因组DNA；

(2)以待测植株的基因组DNA为模板，采用序列如SEQ ID NO.3-4和/或SEQ IDNO.6-7所示的检测引物进行PCR扩增；将PCR扩增的产物用碱性磷酸酶处理，以去除体系中游离的dNTPs；

(3)以步骤(2)得到的碱性磷酸酶处理的产物为模板，采用序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.8所示的单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应；

(4)单碱基延伸反应结束后，利用树脂纯化延伸产物；

(5)将步骤(4)的纯化产物转移到MassARRAY SpectroCHIP 芯片上，利用MassARRAY Analyzer ComPmc质谱仪检测，利用软件分析质谱检测结果，获得所述SNP位点的分型数据。

上述步骤(2)中，PCR扩增反应的反应体系(5μL)如下：

10×PCR Buffer(含Mg²⁺)0.625μL、25mM MgCl2 0.325μL、 dNTP(2.5mM each)1.0μL、正向引物F 0.5μL、反向引物R0.5μL、 5U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL、浓度为50ng/μL的基因组DNA模板1.0 μL、加水补足5μL。

反应程序如下：94℃ 15min；94℃ 10-20sec，56-65℃ 30sec， 72℃ 1min，45个循环；72℃ 3-5min。

上述步骤(2)中，碱性磷酸酶处理的反应体系(7μL)如下： 10×SAP Buffer 0.17μL、1U/μL SAP酶0.3μL、步骤(2)的PCR 产物5μL、加水补足7μL。

反应程序如下：37℃，40min；85℃，5min。

上述步骤(3)中，单碱基延伸反应的反应体系(9μL)如下： 10×iPlex Buffer 0.2μL、iPlex Termination mix 0.2μL、单碱基延伸引物0.804μL、iPlex enzyme 0.041μL、步骤(3)得到的碱性磷酸酶处理产物7μL、加水补足9μL。

反应程序如下：

本发明提供的SNP分子标记中，Pm7_10245464分子标记位于 Pm024074基因的编码序列，Pm024074基因预测编码具有松柏醇乙醇葡糖基转移酶(coniferyl-alcoholglucosyltransferase)功能的蛋白。本发明通过转录组分析获得该基因的表达模式，Pm024074基因在垂枝梅花和直枝梅花的茎和芽中显著差异表达，因此Pm024074基因可作为参与梅花垂枝性状调控的重要候选基因。

本发明提供Pm024074基因在梅花枝条性状调控中的应用；所述 Pm024074基因具有如SEQ ID NO.9所示的序列或如SEQ ID NO.9所示的序列经一个或多个核苷酸的缺失、替换或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供Pm024074基因在垂枝梅花遗传育种中的应用；所述Pm024074基因具有如SEQ ID NO.9所示的序列或如SEQ ID NO.9所示的序列经一个或多个核苷酸的缺失、替换或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明联合全基因组关联分析、群体选择分析和QTL定位分析的方法，挖掘重叠区间内与梅花垂枝性状紧密连锁的SNP分子标记，对位于7号染色体重叠候选区间10.2～11.7Mb内的7个显著关联标记进行验证，发现2个纯合的SNP标记Pm7_10245464和Pm7_10284630，其在垂枝梅花和直枝梅花中均表现为纯合型，在梅花杂交后代分离群体的垂枝/直枝的性状鉴定中具有重复性好、准确性高的优势，实现了单分子标记鉴定准确率达到90％以上的检测效果。

(2)本发明提供了利用SNP分子标记Pm7_10245464和 Pm7_10284630进行梅花垂枝/直枝性状高效检测的方法，具有通量高、检测成本低、不受环境条件的影响等优势。

(3)本发明提供的Pm7_10245464和Pm7_10284630分子标记及其检测方法，可以实现垂枝/直枝性状的幼苗期选择，显著缩短了垂枝梅花新品种的培育周期，提高了育种效率，降低育种成本，可以在实践中用于梅花分子辅助选择育种。

(4)本发明还提供了一个参与梅花垂枝性状调控的重要候选基因Pm024074，为梅花垂枝性状的调控和遗传育种提供了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中7号染色体重叠区间的鉴定；其中，a为全基因组关联分析结果；b为基因组选择分析的群体遗传分化系数；c 为基因组选择分析的核酸多样性；d为QTL定位分析。

图2为本发明实施列2中重叠候选区间内7个SNPs在垂枝梅 (Weeping)和直枝梅(Upright)中的等位基因频率分析图。

图3为本发明实施例2中的质谱分型峰图。

图4为本发明实施例2中基因分型散点图和基因型频率分析；其中， a为Pm7_10245464等位基因的分析散点图；b为Pm7_10245464在垂枝梅(Weeping)与直枝梅(Upright)中的基因型频率分析图；c为 Pm7_10284630等位基因的分析散点图；d为Pm7_10284630在垂枝梅与直枝梅中的基因型频率分析图。

图5为本发明实施例3中Pm7_10245464和Pm7_10284630上下游 100kb范围的基因表达水平分析结果；其中，WT代表垂枝梅芽，WS 代表垂枝梅茎，UT代表直枝梅芽，US代表直枝梅茎。

图6为本发明实施例3中SNP位点Pm7_10245464和Pm7_10284630 在基因组上的位置，其中，Pm7_10245464位于Pm024074的外显子， Pm7_10284630位于非编码序列。

图7为本发明实施例3中Pm024074基因的功能预测结果。

图8为本发明实施例3中Pm024074基因的表达模式分析，其中，a 为Pm024074在“粉台垂枝”(FT)和“六瓣”(LB)杂交子代直枝梅与垂枝梅个体茎和芽中的表达模式分析；b为Pm024074在亲本中的表达模式分析；其中，Graftings代表嫁接苗，Seedings代表实生苗，Tip 代表顶芽，Stem代表茎；W2、W56、W148、U141、U352、U351等分别代表不同的杂交子代植株；Upright(U)代表直枝梅花，Weeping (W)代表垂枝梅花。

图9为本发明实施例3中Pm024074基因的组织特异性表达分析，其中，a为Pm024074基因在垂枝梅和直枝梅枝条不同组织部位的特异性表达分析；b为Pm024074基因在各个组织部位特异表达的热图分析；其中T代表顶芽，S代表茎、L代表叶，Su代表枝条中部上侧，Sd代表枝条基部下侧，Bu代表枝条基部上侧，Bd代表枝条基部下侧；Upright 代表直枝梅花，Weeping代表垂枝梅花。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1重叠候选区间的确定及SNP分子标记挖掘

1、实验材料

全基因组关联分析和群体选择分析的供试材料为214个梅花栽培品种，包含9个品种群(宫粉、朱砂、单瓣、玉碟、杏梅、黄香、垂枝、跳枝和龙游品种群)。QTL定位分析材料来源于梅花‘六瓣’(直枝)为母本和‘粉台垂枝’(垂枝)为父本杂交获得的342个F1代家系群体。

2、表型性状的测量

将梅花垂枝性状分解为7个亚性状，即枝条生长期的分枝角度 (A1)，枝条休眠期的分枝角度(A2)以及基部到梢部生长方向与负重力方向的夹角，将其定义为T1到T5。通过田间采集上述7个亚性状的影像数据，采集方向为东西南北四个方向，每个方向至少取3个枝条。利用Image J软件处理采集的图像。各表型性状的统计析利用R软件(https://www.r-project.org/)。

3、梅花垂枝性状全基因组关联与QTL定位分析

利用214个梅花品种的重测序数据，通过严格的过滤，获得 3,014,409个高质量SNP位点用于开展全基因组关联分析和群体选择分析，全基因组关联分析采用群体结构数据矩阵(Q)和亲缘关系矩阵(K)作为校正模型，采用MLM模型开展关联分析，通过计算垂枝梅与直枝梅全基因组核苷酸多样性指数(Pi)和群体遗传分化系数 (FST)判断垂枝梅花和直枝梅花的基因组选择情况。利用SLAF简化基因组测序获得的734个hk×hk分离标记、4310个lm×ll分离标记和2502个nn×np标记，利用三种分离标记和QTL IciMapping软件开展 QTL定位分析。上述三种方法均在梅花7号染色体上检测到与梅花垂枝性状显著关联或连锁的区间，其重叠区间大约在10.2-11.7Mb区间 (图1)。

实施例2重叠候选区间内显著关联的SNP分子标记的验证

1、实验材料

以‘六瓣’(母本)×‘粉台垂枝’(父本)得到的F1分离群体作为材料，其中极端垂枝个体90株，直枝个体165株。

2、基因组DNA的提取

按照高效植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司) 的说明书进行基因组DNA的提取，经电泳和NanoDrop 2000检测合格的DNA样品用于质谱检测实验。

3、候选区间标记验证

在重叠候选区间内筛选7个最为显著关联的全基因组关联分析起源的SNP标记进行验证，根据SNP位置信息提取7个SNP位点上下游 300bp序列(其中，SNP位点Pm7_10245464的上下游300bp序列如SEQ ID NO.1所示；SNP位点Pm7_10284630的上下游300bp序列如SEQID NO.2所示)，设计PCR扩增引物和单碱基延伸反应引物。引物设计所用软件为Genotyping Tools和MassARRAY Assay Design。

利用所设计的引物，以所选材料的基因组DNA为模板，采用多重PCR扩增技术获得扩增产物，获得的PCR产物利用碱性磷酸酶处理 (SAP处理)，去除游离的dNTPs。处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应结束后利用树脂纯化产物。最后，将纯化产物在从384孔反应板转移到表面覆盖基质的MassARRAY SpectroCHIP芯片，利用 MassARRAY AnalyzerComPmc质谱检测样品，利用TYPER软件分析实验结果，获得分型数据。

4、结果分析

利用质谱分型结果对‘六瓣’与‘粉台垂枝’杂交得到的F1分离群体的等位基因型频率进行计算，结果显示，7个SNP位点均与梅花垂枝性状紧密连锁(图2)，两种不同的等位基因频率在垂枝梅花和直枝梅花中的差异显著。其中，质谱检测峰图显示SNP位点 Pm7_10245464(位于梅花第7号染色体第10245464bp处，多态性为 G/A)和Pm7_10284630(位于梅花第7号染色体第10284630bp处，多态性为G/T)有三种分离的基因型(图3)，其中在垂枝梅花和直枝梅花中绝大部分为纯合基因型(图4)。SNP位点Pm7_10245464在垂枝梅和直枝梅中的准确率分别为87.8％(72/82)和92.4％(145/157)，垂枝个体表现为GG基因型，直枝个体表现为AA基因型(图4的a、b)； SNP位点Pm7_10284630在垂枝梅花和直枝梅花中的准确率分别为 90.1％(73/81)和91.1％(143/157)(图4的c、d)。

上述SNP位点的基因型检测中，用于检测SNP位点Pm7_10245464 的PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.3-4所示，单碱基延伸反应引物序列如SEQ ID NO.5所示；用于检测SNP位点Pm7_10284630的PCR扩增引物序列如SEQ ID NO.6-7所示，单碱基延伸反应引物序列如SEQ ID NO.8所示。

SEQ ID NO.3：正向引物F：

5’-ACGTTGGATGTTCAAGACCGGTCCAATGAG-3’；

SEQ ID NO.4：反向引物R：

5’-ACGTTGGATGATTGACCACAATCCCAGCAG-3’；

SEQ ID NO.5：5’-CGGATGTGCAAGAAGTA-3’；

SEQ ID NO.6：正向引物F：

5’-ACGTTGGATGGGCTTACTGTGGTTTTGGAC-3’；

SEQ ID NO.7：反向引物R：

5’-ACGTTGGATGCCGCTAAGGATAAGAATGGG-3’。

SEQ ID NO.8：5’-GTATGACGGGTTCGG-3’。

上述SNP位点的基因型检测方法如下：

(1)提取待测梅花的基因组DNA。

(2)以待测植株的基因组DNA为模板，采用序列如SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.6-7所示的检测引物进行PCR扩增；将PCR扩增的产物用碱性磷酸酶处理，以去除体系中游离的dNTPs；

PCR扩增反应的反应体系(5μL)如下：

10×PCR Buffer(含Mg²⁺)0.625μL、25mM MgCl₂ 0.325μL、 dNTP(2.5mM each)1.0μL、正向引物F 0.5μL、反向引物R 0.5μL、 5U/μL Taq DNA聚合酶0.1μL、浓度为50ng/μL的基因组DNA模板1.0 μL、加水补足5μL。

反应程序如下：94℃ 15min；94℃ 20sec，60℃ 30sec，72℃ 1min，45个循环；72℃5min。

碱性磷酸酶处理的反应体系(7μL)如下：10×SAP Buffer 0.17μL、 1U/μL SAP酶0.3μL、步骤(2)的PCR产物5μL、加水补足7μL。

反应程序如下：37℃，40min；85℃，5min。

(3)以步骤(2)得到的碱性磷酸酶处理的产物为模板，采用序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8所示的单碱基延伸引物进行单碱基延伸反应；

单碱基延伸反应的反应体系(9μL)如下：10×iPlex Buffer 0.2μL、 iPlexTermination mix 0.2μL、单碱基延伸引物0.804μL、iPlex enzyme 0.041μL、步骤(3)得到的碱性磷酸酶处理产物7μL、加水补足9μL。

反应程序如下：

(4)单碱基延伸反应结束后，利用树脂纯化延伸产物；

实施例3基于纯合SNP分子标记鉴定其附近的潜在候选基因

1、实验材料

为了进一步预测显著关联的纯合SNP分子标记附近是否存调控梅花垂枝性状的关键基因，进一步开展转录组分析，观察SNP分子标记Pm7_10245464和Pm7_10284630附近基因的表达模式，转录组测序材料为梅花‘六瓣’×‘粉台垂枝’杂交的F1代群体，随机选择极端的垂枝和直枝个体各20株，采集每个个体的嫩茎和芽，并将材料迅速保存于液氮。

2、建库测序及数据质控

RNA的提取采用RN38 EASYspin试剂盒，并按照试剂盒RNA提取流程严格提取总RNA，每份总RNA样品的完整性、浓度和纯度经过严格检测合格后用于下一步建库测序。

利用磁珠(带有Oligo(dT))富集mRNA并将其打断成短片段，然后利用六碱基随机引物将短片断mRNA合成一链cDNA，然后再加入缓冲液、dNTPs以及聚合酶，合成二链cDNA。然后再纯化双链cDNA 从而得到测序文库。经检测合格后的文库使用Illumina HiSeq X-10platform双端测序(片段长度150bp)，测序深度大于6G。

对下机的测序数据去除接头、重复和低质量的reads得到clean reads，对cleanreads再次过滤得到高质量的clean data。同时对数据的 Error rate、Q30和GC content进行评估和质控。

3、数据比对与分析

将高质量的测序数据比对到梅花参考基因Prunus mume Genome v1.0(http://prunusmumegenome.bjfu.edu.cn)，将比对结果均一化，然后利用DESeq R package(1.18.0)分析四个转录组池的差异表达基因，利用Benjamini and Hochberg进行质控，确保假阳性率小于0.001，并且选择差异表达倍数(fold changed,FC)大于1.5倍(|log₂Ratio|≥0.585) 的基因为差异表达基因。利用GO、Nr和KEGG等公共数据库进行基因的功能注释，阈值E<10^-5。

4、荧光定量与组织特异性表达分析

为了进一步验证候选基因在垂枝梅和直枝梅的芽和茎组织的差异表达规律，选择两个来源于不同生长环境(种植于温室的一年生嫁接苗和种植于苗圃的5年生实生苗)的子代以及两个亲本(‘六瓣’和‘粉台垂枝’)作为荧光定量分析试验材料。随机选择生长于温室的8个株系(垂枝梅：W2/56/148/333；直枝梅：U141/341/352/351)和生长于苗圃的8个株系(垂枝梅：W132/362/382/393；直枝梅： U138/208/226/392)。为了进一步观察候选基因在枝条不同组织部位的表达特点，对枝条不同组织部位进行取材，利用荧光定量PCR分析垂枝梅和直枝梅枝条不同部位的候选基因表达模式。其中，Pm024074 基因的荧光定量PCR所用引物序列如SEQ ID NO.10-11所示

5、结果分析

利用转录差异表达分析，检测了Pm7_10245464和Pm7_10284630 上下游100kb范围的基因表达水平。在所有覆盖的基因中，发现 Pm024074基因(序列如SEQ ID NO.9所示)的差异表达倍数显著高于其它基因(图5)，而SNP标记Pm7_10245464正好在位于Pm024074基因的编码区，在染色体水平上与另一个纯合的SNP位点 Pm7_10284630的距离小于50kb，然而编码区AA向GG的突变并没有产生氨基酸序列的差异(图6)。功能预测分析表明，Pm024074是一个编码松柏醇乙醇葡糖基转移酶(coniferyl-alcoholglucosyltransferase) 的基因(图7)。荧光定量PCR分析结果进一步证明了Pm024074在垂枝梅花的茎和芽中显著高表达(图8)。组织特异表达分析结果(图9) 同样显示，Pm024074从直枝梅幼嫩的顶芽到枝条的基部差异表达倍数显著增加，而垂枝梅的差异表达倍数显著低于直枝梅。基于上述结果，推测Pm024074是一个参与垂枝性状调控的关键基因。

本发明开发了两个梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记，可用于构建垂枝梅花分子辅助选择育种体系和垂枝性状关键候选基因的预测和图位克隆。利用本发明的两个纯合SNP标记，可以实现垂枝梅花育种的早期选择，提高育种效率，降低了育种成本。对垂枝梅花的分子育种具有重要的应用价值。基于本发明的SNP标记，本发明发现Pm7_10245464标记位于Pm024074基因编码序列，其在垂枝梅中显著高表达，是一个潜在参与垂枝性状调控的关键基因。

上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京林业大学

<120> 梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记及其检测方法与应用

<130> KHP191115042.4

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctcttaacaa cccaaataaa cctctgccca ctcaattcaa gtcccaaggc taattcagtc 60

atttgctctt gtgagaaagt tcccccactc ccaaatgaaa caaacaacac tgactcattg 120

ggttgcttat caagccactt caaacactca ttcccttcga acccatctgc tgaactgatc 180

tttattactg gtccaaccgg ataaaccggt ggaagacctt gtccttgctc cttgaaagcc 240

ttgaaagcac ccggttccaa gtccacaaag ctattgacca caatcccagc agccgactta 300

tacttcttgc acatccgaac catcacttta taggcctcat tggaccggtc ttgaaccggg 360

tccataaaat ctcgaccgtg aaggggaaca caacccggaa gttggactag ttcaggcaag 420

tccctatact cacaagtagt ggtctcgtga aggtgtggga aatgaaatat aagcgacaaa 480

ctaaaggctg aagtggtgaa aaatatgtat gggggcacgt ggagttcatt ggccacatca 540

gaggtatcag caccaaaaag atcaacaaga agtgccacta gacgagttga ctcggttagg 600

<210> 2

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

attgaatttc tcgtccgcgt tgcggtcaaa gtctcgggag ttgagataat gattgtgtcg 60

tgagaatagt gttaaattat tgggtacttg atgacgcgtg agctcttgcc acgtcagtca 120

gtttcccgcg ctcgtttggt ggttgttgtt tctgttgtcc ctctctctcc ccatttcggc 180

ctggagagta tgtatgacgc aataattgca agaaatggag ggatggaatg ggcttactgt 240

ggttttggac aatgatccaa ctttcagtta gggataccaa caacgtatga cgggttcggg 300

tttgctcttc ccattcttat ccttagcggg cacacgtaaa ttacattata ctcgtaatta 360

gttttgagta gaacttccac ttccttcatt cttaaccccc caaaaaaaaa aaactacatt 420

atacgcgctc aagagttcga acctcctcct catttggtct aattggtatc tagaagaaaa 480

ttatacatta actacacaat ttgttgtata acaacataaa aatgtgaaat aacacaattc 540

atttcaaaag aaaaactaaa gaacttgtag ctcaagttaa atgaattaac agatttgggg 600

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg ttcaagaccg gtccaatgag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg attgaccaca atcccagcag 30

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggatgtgca agaagta 17

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgttggatg ggcttactgt ggttttggac 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg ccgctaagga taagaatggg 30

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtatgacggg ttcgg 15

<210> 9

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggacccgg ttcaagaccg gtccaatgag gcctataaag tgatggttcg gatgtgcaag 60

aagtataagt cggctgctgg gattgtggtc aatagctttg tggacttgga accgggtgct 120

ttcaaggctt tcaaggagca aggacaaggt cttccaccgg tttatccggt tggaccagta 180

ataaagatca gttcagcaga tgggttcgaa gggaatgagt gtttgaagtg gcttgataag 240

caacccaatg agtcagtgtt gtttgtttca tttgggagtg ggggaacttt ctcacaagag 300

caaatgactg aattagcctt gggacttgaa ttgagtgggc agaggtttat ttgggttgtt 360

aagagcccaa atgagacagc taaaaatgca aattatttta acgtccaagg ctgtgaggac 420

ccttctggtt ttttaccaca tgggtttttg gagaggacca aggaggtagg tctagtggtc 480

ccatcttggg ccccacaagt aaaaatgctg agtcaccaag caacgggtgg gtttttgact 540

cattgtggat ggaactcaac attggagagc attgtgcatg gtgtgccttt gattgcttgg 600

ccactctatg cagagcaaag gatgaatagg gtgctccttg ttgatggttt gaaggttgct 660

ttgggtgtta gatcgaatga taaggggata gtggagagcc aagatattgc taagtatgtt 720

aggggcctaa ttgaaggtga tgaagggaaa ttgctaagga acaagatgaa agggtataaa 780

gaggcagcca aattggcttt aagtcaagaa gggtcttcta ccaagtcact tgctgaggtg 840

gctcaggtat ggaagggcct caagatctaa 870

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggttcaaga ccggtccaat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaaagccttg aaagcacccg 20

Claims

1.梅花垂枝性状紧密连锁的纯合SNP分子标记，其特征在于，包括：位于梅花第7号染色体第10245464bp处，多态性为G/A，和/或，位于梅花第7号染色体第10284630bp处，多态性为G/T。

2.权利要求1所述的SNP分子标记的检测引物，其特征在于，包括：引物对1和/或引物对2：所述引物对1用于检测位于梅花第7号染色体第10245464bp处的SNP分子标记，其序列如SEQ ID NO.3-4所示；所述引物对2用于检测位于梅花第7号染色体第10284630bp处的SNP分子标记，其序列如SEQ ID NO.6-7所示。

3.根据权利要求2所述的检测引物，其特征在于，还包括单碱基延伸引物；其中，与所述引物对1配合使用的单碱基延伸引物的序列如SEQ ID NO.5所示；与所述引物对2配合使用的单碱基延伸引物的序列如SEQ ID NO.8所示。

4.包含权利要求2或3所述的检测引物的试剂盒。

5.权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2或3所述的检测引物或权利要求4所述的试剂盒在梅花垂枝或直枝性状鉴定中的应用。

6.权利要求1所述的SNP分子标记或权利要求2或3所述的检测引物或权利要求4所述的试剂盒在梅花分子标记辅助育种中的应用。

7.一种鉴定梅花垂枝/直枝性状的方法，其特征在于，以待测梅花的基因组为模板，采用权利要求2或3所述的检测引物进行PCR扩增，分析PCR扩增产物的序列，判断所述待测梅花的基因型。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以待测梅花的基因组为模板，采用序列如SEQ ID NO.3-4和/或SEQ ID NO.6-7所示的检测引物进行PCR扩增，将所述PCR扩增的产物用碱性磷酸酶处理；

(3)分析步骤(2)得到的单碱基延伸反应的产物的基因型。

9.Pm024074基因在梅花枝条性状调控中的应用；所述Pm024074基因具有如SEQ IDNO.9所示的序列或如SEQ ID NO.9所示的序列经一个或多个核苷酸的缺失、替换或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。

10.Pm024074基因在垂枝梅花遗传育种中的应用；所述Pm024074基因具有如SEQ IDNO.9所示的序列或如SEQ ID NO.9所示的序列经一个或多个核苷酸的缺失、替换或插入得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。