CN111560420A - 一种abo基因单倍体分型方法及试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种ABO基因单倍体分型方法及试剂。所述ABO基因单倍体分型方法包括以下步骤：（1）设计并合成可扩增长片段特定等位基因的PCR扩增引物；（2）制备人基因组DNA；（3）根据ABO基因型，进行选择性PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因单倍体部分DNA序列；（4）将扩增产物进行双酶切纯化；（5）提供寡核苷酸测序引物，将双酶切纯化产物进行测序PCR反应；（6）将测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；（7）确定ABO基因单倍体并指定其基因型。本发明所提供的ABO基因单倍体分型方法可选择性的分离出三个等位基因的单倍体形式，在ABO疑难血型的鉴定、ABO新等位基因序列的确认和精确分型等方面的具有广泛的应用价值。

Description

一种ABO基因单倍体分型方法及试剂
技术领域
本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种ABO基因单倍体分型方法。本发明还涉及一种用于ABO基因单倍体分型方法的分型试剂。
背景技术
人类ABO血型是最具临床意义的血型系统，对其进行准确分型以明确个体血型基因型具有重要意义。
ABO血型抗原由ABO基因所决定。该基因位于人类9号染色体(9q34.1～34.2)，由A、B和O三个复等位基因控制。目前，A、B和O三个等位基因已报道存在约有400多个包含不同突变的基因形式，且在不断发现新的突变体。由于人类染色体为2倍体形式，因此，个体的ABO血型基因型通常以该三个复等位基因中的单个或两个等位基因组合存在。现有的ABO血型系统基因分型常用技术如PCR-SBT等，通常是对2倍体组成的基因进行扩增测序，杂合子基因获得的基因分型结果通常为2个等位基因的杂合状态。因此，对于存在新的点突变或组合不明确的状况时，现有的分型技术无法明确新突变点所在的等位基因，也无法判断个体的ABO基因型，只能是推测的结果。而解决此类问题只能通过分离单倍体，而获得ABO基因单倍体目前只能通过基因克隆技术来实现两个等位基因的分离。但ABO基因的单克隆技术存在两个主要的问题，第一，DNA克隆基因序列太长，克隆难度较大，而cDNA序列由于ABO基因转录剪接的存在，获得其cDNA序列难度较大。第二，克隆技术本身操作过程极其繁琐，时间跨度长，从克隆到序列鉴定通常需要3-4天的周期，而且克隆过程可引入假性突变，因此，通过传统的克隆技术来获得ABO基因的单倍体目前局限性较大。
因此，建立一种快速有效，且适用性广泛的单倍体分离技术对ABO血型的精准鉴定和科学研究具有重要的意义和实用价值。
发明内容
针对现有ABO基因分型技术的局限性和克隆技术的繁杂性与困难度，对新等位基因的确认和血型的精准诊断带来的困难，本发明目的在于提供了一种ABO基因单倍体分型方法，为ABO基因的单倍体分型提供了一种简单、快速、有效且适用性广泛的技术方法，以实现大部分样本的ABO基因的单倍体序列确认，从而明确新的等位基因点突变或重组等变异，为解决ABO血型标本的鉴定提供一种全新的方法。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：所述ABO基因单倍体分型方法对ABO基因第2号外显子至第6或第7号外显子序列进行长片段PCR选择性扩增单倍体等位基因和测序分型，并包括以下步骤：
针对ABO基因单倍体的不同等位基因序列的特异性，设计并合成可扩增长片段特定等位基因的PCR扩增引物，以分离A/B杂合型或B/O杂合型或A/O杂合型人基因组DNA中的A等位基因或者B等位基因或者O等位基因；
表1
Figure BDA0002525050190000021
ABO基因可分为A、B和O三个复等位基因。通常将A等位基因中的ABO*A1.01作为参考序列，不同的等位基因与ABO*A1.01的序列高度同源，仅有几个碱基的变化。常见的A、B、O三个等位基因主要序列差异位点见表1。其中B基因与A基因的主要关键差异位点在于6号外显子的297位以及在7号外显子的526、657、703、796、803、930和1096位这8个位置碱基的差异。B基因与O基因的主要差异位点在于6号外显子的第261位以及7号外显子的526、657、703、796、803、930和1096位碱基的差异。O基因与A基因、B基因的主要差异是在6号外显子的第261位发生了碱基G的缺失(c.261delG)。除常见A、B、O三个基因之间主要差异位点的基础上，各等位基因均存在较多的突变体，目前，A、B和O三个等位基因已报道存在约有400多个包含不同突变的基因形式，且还在不断的发现更多的新突变等位基因。由于人类染色体为2倍体形式，因此个体的ABO血型基因型通常以该三个复等位基因中的单个或两个等位基因组合存在。基于ABO基因中各等位基因的主要序列差异，设计了用于分离各等位基因的反向特异性引物，表2列举了本发明根据不同的基因型组合进行引物的选择与分离后得到的单倍体，并作详细的说明。
表2
Figure BDA0002525050190000031
R-B引物用于分离B等位基因。即B等位基因与A、O基因杂合的标本(A/B或B/O基因型)，可选择反向特异性引物R-B，获得B等位基因单倍体；
R-AO引物用于分离非B等位基因。即A、O等位基因与B基因杂合的标本(A/B或B/O基因型)，也可选择反向特异性引物R-AO，获得A等位基因单倍体或O等位基因单倍体；
R-261引物用于分离非O等位基因。即A或B等位基因与O等位基因杂合的标本(A/O或B/O基因型)，可选择反向特异性引物R-261，获得A等位基因单倍体或B等位基因单倍体；
可根据初步的基因型组合以及实际需要分离的单倍体选择合适的反向特异性引物；
(2)制备人基因组DNA；
(3)根据ABO基因型，进行选择性PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因单倍体部分DNA序列，包括第2号外显子至第7号外显子区域的单倍体DNA分子序列；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；
(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；
(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；
(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定ABO基因单倍体并指定其基因型。
在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：
作为本发明的优选技术方案：步骤(1)中的扩增引物如下：
正向通用引物包括：
E27F：5’-TACTCACCTATTGGCCTTTGGTT-3’
反向特异性引物包括：
R-B：5’-ATC GACCCCCCGAAGAGCG-3’
R-AO：5’-CCGACCCCCGAAGAGCC-3’
R-261：5’-GGAGCCAGCCAAGGGGTCA-3’。
作为本发明的优选技术方案：所述步骤(3)中的选择性PCR扩增反应体系包括：
5×GLX PCR缓冲液5.0μl；2.5mM dNTP 2.0μl；引物浓度25μmol/L，正向通用引物和反向特异性引物各0.1μl；1.25U/μl GLX-Taq酶0.5μl；50-100ng/μl DNA 2.5μl；余量以H2O补足至25μl。
作为本发明的优选技术方案：所述步骤(3)中选择性PCR扩增反应程序均为：
94℃预变性1min，98℃变性10s，68℃退火加延伸7min，30个循环，68℃延伸10min，然后冷却至12℃。
作为本发明的优选技术方案：所述步骤(4)中双酶切纯化所需的两种酶分别为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
作为本发明的优选技术方案：所述步骤(5)中的寡核苷酸测序引物为如下12条寡核苷酸测序引物：
I1-F：5’-TACTCACCTATTATTGGCCTTTGGT-3’
I2-R：5’-GTGGTCCCTGGGATATTG-3’
I2-F：5’-ACACTCCCTGACGTGGCCTC-3’
I3-R:5’-TCAAGGCTGACTCCAGAGGT-3’
I3-F：5’-CCCGAACGTAGACCTCAGAC-3’
I4-R:5’-GAGCGAGACTCCATCACACA-3’
I4-F：5’-CCCAAGCAACCACAGTGA-3’
I5-R：5’-TTGGAGAACAAAGGGACAGG-3’
I5-F:5’-CATTTGCCTCTGGTTGGTTT-3’
I6-R：5’-CTGGAGAAGGAGCTGGGTTT-3’
E7-F1：5’-TCTGCTGCTCTAAGCCTTCC-3’
E7-F2:5’-AAGGACGAGGGCGATTTCTAC-3’。
本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种应用于ABO基因单倍体分型方法的分型试剂。
为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
一种应用于ABO基因单倍体分型方法的分型试剂，其特征在于：所述应用于ABO基因单倍体分型方法的分型试剂为用于扩增ABO基因2号外显子至第6或第7号外显子区域的单倍体DNA分子序列的4条选择性PCR扩增引物和用于该部分序列测序分析的12条寡核苷酸测序引物所组成的试剂；
PCR扩增引物序列分别为：
正向通用引物包括：
E27F：5’-TACTCACCTATTGGCCTTTGGTT-3’
反向特异性引物包括：
R-B：5’-ATC GACCCCCCGAAGAGCG-3’
R-AO：5’-CCGACCCCCGAAGAGCC-3’
R-261：5’-GGAGCCAGCCAAGGGGTCA-3’
12条寡核苷酸测序引物序列分别为：
I1-F：5’-TACTCACCTATTATTGGCCTTTGGT-3’
I2-R：5’-GTGGTCCCTGGGATATTG-3’
I2-F：5’-ACACTCCCTGACGTGGCCTC-3’
I3-R:5’-TCAAGGCTGACTCCAGAGGT-3’
I3-F：5’-CCCGAACGTAGACCTCAGAC-3’
I4-R:5’-GAGCGAGACTCCATCACACA-3’
I4-F：5’-CCCAAGCAACCACAGTGA-3’
I5-R：5’-TTGGAGAACAAAGGGACAGG-3’
I5-F:5’-CATTTGCCTCTGGTTGGTTT-3’
I6-R：5’-CTGGAGAAGGAGCTGGGTTT-3’
E7-F1：5’-TCTGCTGCTCTAAGCCTTCC-3’
E7-F2:5’-AAGGACGAGGGCGATTTCTAC-3’。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所提供的ABO基因单倍体分型方法采用选择性PCR扩增，对于人群中大部分类型ABO等位基因单倍体都可以快速准确地获得，克服了传统分子克隆技术对ABO等位基因获取难度大的缺点。本发明所涉及的寡核苷酸扩增引物的3’端引入不同等位基因的特异性碱基序列，可长片段选择性扩增ABO基因2号外显子至第6或第7号外显子区域序列。由于ABO基因大部分的基因突变位于6-7号外显子，而1号外显子保守性较高，突变较少，因此，该选择性PCR扩增方法可以满足大部分样本对单倍体序列的获取需求，从而达到新等位基因确认及基因型确认的目的，并且还能够解决分子克隆技术确认单倍体过程中长片段克隆难、目的片段在克隆过程中容易引入新的突变、阳性克隆的盲目挑选等困难。
(2)本发明所提供的ABO基因单链分型方法极大地降低了ABO基因单倍体获得的繁杂度，经典的分子克隆技术中包括了目的基因的扩增、载体的构建、转化、阳性克隆的挑选及测序验证等一系列繁杂的步骤，即使针对一个样本的操作都极其繁琐和复杂，对阳性克隆的挑选和验证更是一个无限放大的操作程序，无法进行高通量的操作。而本发明所提供的ABO基因单倍体分型方法中由于巧妙地利用特异性引物，仅通过一步简单的PCR扩增和常规的测序就达到了ABO基因单倍体分离的目的，大大降低了ABO基因单倍体获得的繁杂度。同时，本发明采用统一的扩增条件达到不同的特异性引物的扩增目的，进一步增加该技术的操作简便性以及通量操作性，其优越性极明显。
(3)本发明所提供的ABO基因单倍体分型方法可作为一种全新的ABO血型基因单倍体鉴定的方法，可选择性的分离出三个单倍体等位基因，对单倍体分离具有简便、准确、快速的特点，在ABO疑难血型的鉴定、ABO新等位基因序列的确认和精确分型等方面具有广泛的应用价值，在输血医学研究和遗传学等领域的应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明的ABO等位基因单倍体PCR扩增产物电泳图，图中：1、2、3泳道为三个不同杂合样本分离获得的单个等位基因产物，M为DNA分子Marker DL 5000bp。
图2为基于R-B引物从B/O型标本中获得B等位基因单倍体的测序图谱。
图3为基于R-AO引物从B/O型标本获得的O等位基因单倍体测序图谱。
图4为基于R-261引物从A/O型标本分离获得的A等位基因单倍体测序图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。
本实施具体以献血者的血液为检测样本，取三个样本，第1例基础分型为B/O型，带有一个杂合子562Y(C/T)的新突变点，该新突变位于B等位基因序列上还是O等位基因上，无法确定；第2例为B/O型样本；第3例为A/O型样本。以三种类型样本为例，进行人类红细胞血型ABO基因单倍体分型，对本发明内容做详细说明。
本发明的ABO基因单倍体分型方法包括以下步骤：
1、合成4条扩增引物和12条寡核苷酸测序引物，具体引物序列见发明内容和序列表中的基因序列，此处不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至25μmol/L。
2、制备3个人基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板。
取待检全血200μl，按照MagDNA Pure LC DNA Isolation Kit试剂盒说明书提取基因组DNA，并测定基因组DNA的浓度和纯度。
3、选择性扩增ABO基因2-7号外显子部分序列。
准备GXL-Taq酶(TaKaRa)、5×GXL buffer、dNTP(TaKaRa)、纯水，与步骤2所制备的基因组DNA模板，每个样本按表3所述体系配制PCR扩增体系，表3为选择性PCR扩增反应体系。
表3
PCR扩增体系 1组(μl)B/O 2组(μl)B/O 3组(μl)A/O
5×GXL buffer 5.0 5.0 5.0
dNTP(2.5mM) 2.0 2.0 2.0
引物1 E27F 0.1 E27F 0.1 E27F 0.1
引物2 R-B 0.1 R-AO 0.1 R-261 0.1
GXL-Taq酶(1.25U/μl) 0.5 0.5 0.5
DNA模板(50-100ng/μl) 2.5 2.5 2.5
H<sub>2</sub>O 14.8 14.8 14.8
总体系 25 25 25
上表中，1组体系样本DNA基因型为B/O型，引物2为R-B，用于分离B/O基因型中的B链；2组体系样本DNA基因型为B/O型，引物2为R-AO，用于分离B/O基因型中的O链；3组体系样本DNA基因型为A/O型，引物2为R-261，用于分离A/O基因型中的A链。这里仅采用B/O型和A/O型人基因组DNA样本，在其他的实施例中，也可以采用A/B型人基因组DNA样本进行分型，且均落在本发明的保护范围内。
94℃预变性1min，98℃变性10s、68℃退火加延伸10min，30个循环，68℃延伸10min，然后冷却至12℃。PCR扩增结束后，将检测样本所扩增片段各取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段的特异性。PCR扩增产物的电泳结果如图1所示，图1为本发明对3例样本的ABO基因单倍体扩增电泳图谱，1、2、3泳道分别为三个不同杂合样本分离获得的B、O、A三个等位基因单倍体扩增产物，M为DNA分子Marker DL5000。
4、扩增产物的双酶切纯化。
在剩余的PCR产物中分别加入虾碱性磷酸酶(SAP，1U/μl，Lot：M820A，Promega)和核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ，5U/μl，Lot：CK11011B，TaKaRa)，利用虾碱性磷酸酶(SAP)的核苷酸5′端去磷酸化功能以及核酸外切酶Ⅰ(Exo-Ⅰ)的单链特异性3′→5′核酸外切酶功能，进行扩增产物纯化。在23μl扩增产物体系中加入SAP 1μl和Exo-Ⅰ2μl，37℃，进行30min酶切反应，80℃下15min酶失活。
5、PCR产物进行测序反应。
将步骤3中纯化之后的PCR产物加入20μl纯水稀释，混匀，将12条寡核苷酸测序引物用纯水稀释至浓度为3.2μmol/L，以BigDye terminator v3.1 sequencing kit(美国ABI公司)试剂按照表4配制分别配置反应体系，1条测序引物即为一个反应体系，表4为测序反应PCR扩增体系。
表4
Figure BDA0002525050190000091
Figure BDA0002525050190000101
所测样本以扩增纯化的片段1:1稀释后作为模板，分别进行测序反应，用PCR仪(ABI9700)按以下程序扩增：预变性96℃1min，DNA双链充分解开；96℃变性10s，50℃退火5s，测序引物结合到DNA模板上，60℃延伸4min，延长扩增片段，25个循环。然后冷却至12℃。
6、测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。将步骤5中测序扩增PCR产物直接用醋酸钠/乙醇纯化法进行纯化。直接在PCR产物中加入1μl EDTA(1.25μM)和25μl醋酸钠(3mol/L)/无水乙醇(1：40)混合液，充分混匀，3000g离心30min；去除上清，加入50μl75％乙醇，3000g离心10min，去除上清，酒精挥发后加入10μl甲酰胺溶解，95℃变性3min，迅速在冰上冷却。
7、将制备好的产物在ABI 3730测序仪上进行48孔毛细管高通量电泳测序，所测序结果利用SeqScape V2.5软件进行序列比对，确定ABO基因的单倍体序列，结果显示了检测样本(杂合子)中预分离基因都获得了单倍体序列。图2-4分别为1号、2号、3号血液检测样本进行ABO基因分型的测序电泳图谱，图中A、G、C、T分别为测序的四种碱基，A为腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶，E代表外显子，即E2-E7代表外显子2-外显子7。三个样本的测序结果显示，所有的碱基均呈纯合状态，杂合子已成功获得分离。图2中1号样本序列分析显示，该单倍体为ABO*B.01等位基因基础上增加了c.562T突变，见图2中方框内部分所示，图2中星号表示的位点为ABO*B.01所特有的碱基位点，分别为c.297G、c.526G、c.657T、c.703A、c.796A、c.803C，新的突变点c.562T位于B等位基因上，从而确定了1个新的B基因变异体。图3中2号样本序列分析显示，该单倍体为ABO*O.01.02等位基因，图中方框中261位G缺失(c.261Gdel)为O等位基因的标志，除此以外，其余星号表示的位点为ABO*O.01.02所特有的碱基位点，其突变点为c.106T、c.188A、c.189T、c.220T、c.261del、c.297G、c.646A、c.681A、c.771T。图4中3号样本序列分析显示，该单倍体为非O等位基因，结合样本的基因型，即为A等位基因，图4中方框内c.261G不缺失为非O等位基因的标志。
上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江省血液中心
<120> 一种ABO基因单倍体分型方法及试剂
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactcaccta ttggcctttg gtt 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcgaccccc cgaagagcg 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgacccccg aagagcc 17
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggagccagcc aaggggtca 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tactcaccta ttattggcct ttggt 25
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggtccctg ggatattg 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acactccctg acgtggcctc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaaggctga ctccagaggt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccgaacgta gacctcagac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagcgagact ccatcacaca 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccaagcaac cacagtga 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttggagaaca aagggacagg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catttgcctc tggttggttt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctggagaagg agctgggttt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctgctgctc taagccttcc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaggacgagg gcgatttcta c 21

Claims (7)

1.一种ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：所述ABO基因单倍体分型方法对ABO基因第2号外显子至第6或第7号外显子序列进行长片段PCR选择性扩增单倍体等位基因和测序分型，并包括以下步骤：
（1）针对ABO基因单倍体的不同等位基因序列的特异性，设计并合成可扩增长片段特定等位基因的PCR扩增引物，以分离A/B杂合型或B/O杂合型或A/O杂合型人基因组DNA中的A等位基因或者B等位基因或者O等位基因；
（2）制备人基因组DNA；
（3）根据ABO基因型，进行选择性PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因单倍体部分DNA序列，包括第2号外显子至第6或第7号外显子区域的单倍体DNA分子序列；
（4）将步骤（3）得到的扩增产物进行双酶切纯化；
（5）提供寡核苷酸测序引物，将步骤（4）得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；
（6）将步骤（5）得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；
（7）将步骤（6）获得的序列通过软件分析，确定ABO基因单倍体并指定其基因型。
2.根据权利要求1所述的ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：步骤（1）中的扩增引物如下：
正向通用引物包括：
E27F：5’-TACTCACCTATTGGCCTTTGGTT-3’
反向特异性引物包括：
R-B：5’-ATC GACCCCCCGAAGAGCG-3’
R-AO：5’-CCGACCCCCGAAGAGCC-3’
R-261：5’-GGAGCCAGCCAAGGGGTCA-3’。
3.根据权利要求1所述的ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：所述步骤（3）中的选择性PCR扩增反应体系包括：
5×GLX PCR 缓冲液5.0 μl；2.5 mM dNTP 2.0μl；引物浓度25 µmol/L，正向通用引物和反向特异性引物各0.1 µl；1.25U/µl GLX-Taq酶0.5 µl；50-100 ng/µl DNA 2.5 µl；余量以H2O补足至25 µl。
4.根据权利要求1所述的ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：所述步骤（3）中选择性PCR扩增反应程序均为：
94℃ 预变性1 min，98℃ 变性10 s，68℃退火加延伸7 min，30个循环，68℃延伸10min，然后冷却至12℃。
5.根据权利要求1所述的ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：所述步骤（4）中双酶切纯化所需的两种酶分别为虾碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
6. 根据权利要求1所述的ABO基因单倍体分型方法，其特征在于：所述步骤（5）中的寡核苷酸测序引物为如下12条寡核苷酸测序引物：
I1-F：5’-tactcacctattattggcctttggt-3’
I2-R：5’-gtggtccctgggatattg-3’
I2-F：5’-acactccctgacgtggcctc-3’
I3-R: 5’-tcaaggctgactccagaggt-3’
I3-F：5’-cccgaacgtagacctcagac-3’
I4-R: 5’-gagcgagactccatcacaca-3’
I4-F：5’-cccaagcaaccacagtga-3’
I5-R：5’-ttggagaacaaagggacagg-3’
I5-F:5’-catttgcctctggttggttt-3’
I6-R：5’-ctggagaaggagctgggttt-3’
E7-F1：5’-tctgctgctctAagccttcc-3’
E7-F2: 5’-aaggacgagggcgatttctac-3’。
7.一种应用于权利要求1所述的ABO基因单倍体分型方法的分型试剂，其特征在于：所述应用于ABO基因单倍体分型方法的分型试剂为用于选择性扩增ABO基因2号外显子至第6或第7号外显子区域的单倍体DNA分子序列的4条PCR扩增引物和用于该部分序列测序分析的12条寡核苷酸测序引物所组成的试剂；
PCR扩增引物序列分别为：
正向通用引物包括：
E27F：5’-TACTCACCTATTGGCCTTTGGTT-3’
反向特异性引物包括：
R-B：5’-ATC GACCCCCCGAAGAGCG-3’
R-AO：5’-CCGACCCCCGAAGAGCC-3’
R-261：5’-GGAGCCAGCCAAGGGGTCA-3’
12条寡核苷酸测序引物序列分别为：
I1-F：5’-tactcacctattattggcctttggt-3’
I2-R：5’-gtggtccctgggatattg-3’
I2-F：5’-acactccctgacgtggcctc-3’
I3-R: 5’-tcaaggctgactccagaggt-3’
I3-F：5’-cccgaacgtagacctcagac-3’
I4-R: 5’-gagcgagactccatcacaca-3’
I4-F：5’-cccaagcaaccacagtga-3’
I5-R：5’-ttggagaacaaagggacagg-3’
I5-F:5’-catttgcctctggttggttt-3’
I6-R：5’-ctggagaaggagctgggttt-3’
E7-F1：5’-tctgctgctctAagccttcc-3’
E7-F2: 5’-aaggacgagggcgatttctac-3’。
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CN115725711A (zh) * 2022-08-16 2023-03-03 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 冰冻全血中血型抗原编码基因的扩增引物组及扩增方法和基因分型方法

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